Abstract

Enquanto PCTAIRE1 /PCTK1 /Cdk16 é abundante em células malignas e é crucial na tumorigénese, sua função na apoptose permanece obscuro. Aqui temos investigado o papel da apoptose em PCTAIRE1, especialmente na via de morte celular extrínseca. Gene-knockdown de

PCTAIRE1

sensibilizado PPC1 câncer de próstata e células DU145, e câncer de mama MDA-MB-468 células para citocinas TNF-família, incluindo ligante indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL). Enquanto isso, PCTAIRE1-knockdown não sensibilizar células não malignas, incluindo fibroblastos diplóides IMR-90 e a linha de células epiteliais da próstata imortalizado 267B1. PCTAIRE1-knockdown não sobre-regular a expressão de receptor de morte na superfície celular ou afectar a caspase-8, FADD e virar os níveis de expressão. PCTAIRE1-knockdown fez promover a caspase-8 clivagem e degradação RIPK1, enquanto mRNA RIPK1 knockdown sensibilizados células PPC1 a citocinas TNF-família. células PPC1 Além disso, o inibidor de cinase de SNS-032, que inibe a actividade cinase PCTAIRE1, sensibilizadas para a apoptose induzida por TRAIL-. Em conjunto, estes resultados sugerem que PCTAIRE1 contribui para a resistência de linhas celulares de cancro para a apoptose induzida pelo TNF-citoquinas da família, o que implica que os inibidores PCTAIRE1 poderia ter efeitos sinérgicos com TNF-citoquinas da família para cytodestruction de células cancerosas.

Citation : Yanagi T, Shi R, Aza-Blanc P, Reed JC, Matsuzawa Si (2015) células PCTAIRE1-Knockdown Cancro sensibiliza para TNF família citocinas. PLoS ONE 10 (3): e0119404. doi: 10.1371 /journal.pone.0119404

Editor do Academic: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 01 de outubro de 2014; Aceito: 12 de janeiro de 2015; Publicação: 19 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yanagi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Teruki Yanagi é suportado por JSPS bolsas para pesquisas no exterior, fundação Kanae, e fundamento da vida Sumitomo serviço de bem-estar social. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. John C. Reed é um empregado do Grupo Roche, AG. Os outros autores não têm qualquer conflito de interesses financeiros. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A família PCTAIRE é um ramo de quinases relacionadas com a família CDK, que inclui PCTAIRE1 (também conhecido como quinase dependente de ciclina 16 (Cdk16) e PCTK1), PCTAIRE2 e PCTAIRE3 [1]. PCTAIRE1 é expressa em termos gerais ao longo do corpo, com níveis mais elevados observados no cérebro e nos testículos [2]. PCTAIRE1 foi mostrado para participar na espermatogénese [3] e regulação de vesículas intracelulares [4,5], assim como a translocação de proteínas transportadoras de glucose [6] e crescimento de neurites [7]. PCTAIRE1 tem um domínio cinase central que mostra semelhança de sequência de aminoácidos de Cdks, e esta região é flanqueada pelos domínios N-terminais e C-terminais únicas. Os mecanismos responsáveis ​​pela activação PCTAIRE1 são desconhecidos, mas o achado que a deleção do domínio N-terminal suprime a actividade de quinase

In vitro

implica que esta região é importante, e pode ligar-se um cofactor desconhecido ou interagir com uma estrutura molecular intra- o domínio central quinase para promover conformações activas do domínio catalítico [1,7]. O domínio N-terminal de PCTAIRE1 é fosforilada pela proteína quinase A (PKA), que inibe a sua actividade [3,8], enquanto que foi mostrado interacção do domínio N-terminal de ciclina PCTAIRE1 com Y para estimular a actividade de quinase [3]. PCTAIRE1 também interage com o complexo COPII envolvidas na exportação de proteínas segregadas a partir do retículo endoplasmático [5].

Descobrimos recentemente que PCTAIRE1 desempenha um papel indispensável na proliferação de células cancerosas [9,10]. Nós também mostrou que as células cancerosas PCTAIRE1-knockdown promovido paragem da mitose associada com defeitos na dinâmica centrossoma. Além disso, PCTAIRE1 fosforila a p27 em Ser10, o que facilita a degradação de p27. No entanto, a função de PCTAIRE1 na apoptose ainda não foi esclarecido.

A apoptose induzida por TRAIL, ligando de Fas (FasL) e TNF-alfa prossegue através de uma série de interacções proteína mediadas pelo receptor que minimamente requerem a proteína adaptadora as proteases de cisteína e FADD, tais como a caspase-8 ou-10. Enquanto estes receptor de morte sinalização componentes complexos são mantidas na maioria dos cânceres, a resistência à apoptose permanece comum. FADD e caspase-8 estão entre os mediadores da via extrínseca que são conhecidos por serem modulados por fosforilação de proteína, o que sugere um papel para cinases na resistência a citocinas TNF-família pró-apoptóticos. proteínas quinases também são alvos atraentes para a descoberta de drogas câncer. Além disso, provas consideráveis ​​sugerem um papel para a fosforilação da proteína em modular eventos de sinalização induzidos por proximais receptores de morte da família de TNF-[11-19], bem como alterar a actividade de bem reconhecidos supressores de apoptose a jusante, tais como flip e Bcl-2- e proteínas IAP-família [18,20-24]. A este respeito, a fosforilação da morte induzir sinalização componentes complexos (disco) Fas, FADD e caspase-8, bem como as caspases-8 substrato Bid e anti-apoptóticos supressores de apoptose induzida pelo receptor de morte (C-FLIP, XIAP) tem sido relatada em associação com a resistência do tumor para TRAIL ou Fas [20-22,25].

neste estudo, caracteriza o papel da PCTAIRE1 em células cancerosas e, particularmente, sua função na morte celular extrínseca via. Nós fornecemos evidências que sugerem que PCTAIRE1 desempenha um papel crucial para a resistência a citocinas TNF-família em células cancerosas. Gene knockdown de

PCTAIRE1

sensibilizado próstata e células de cancro da mama a citocinas TNF-família, incluindo ligando relacionado com o TNF-indução de apoptose (TRAIL) e Fas, mas não sensibilizou as células normais ou não transformadas a TRAIL. PCTAIRE1-knockdown promovido caspase-8 clivagem e degradação de serina-treonina cinase de proteína-receptor de uma interacção (RIPK1). O knockdown mediado por siRNA de mRNA RIPK1 também sensibilizados células PPC1 a citocinas TNF-família. Nossos resultados sugerem que PCTAIRE1 poderia ser um alvo importante para a terapia do cancro, e que os inibidores PCTAIRE1 poderia ter efeitos sinérgicos com citocinas TNF-família para matar células cancerosas.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

A viabilidade celular celular kit de ensaio Titer Glo foi adquirido de Promega. RNAiMAX foi obtido a partir de Life Technologies. Pré-concebidas de interferência curto-RNA (siRNA) dirigido contra PCTAIRE1 humana (siRNA Ids: 1472, 1566, 1656), PCTAIRE2 (s10160), PCTAIRE3 (s10162), caspase-8 (s2427), RIPK1 (s16653), p27 (s2837 ) e corrida-controlo (# 1, # 2) foram adquiridos de Life Technologies. TRAIL recombinante foi adquirida a Enzo Bioscience. SNS-032 foi adquirido a Selleck Chemicals. Os anticorpos contra PCTAIRE1 (policlonal de coelho: HPA001366, Sigma), RIPK1 (610458, BD Transdução Lab), caspase-8 (1C12, # 9746, Cell Signaling Technology), caspase-8 (# 9496, Cell Signaling Technology), fosfo- caspase-8 (Ser387, # 710535, Life Technologies), FADD (06-711, Millipore), fosfo-FADD (# 2781, Cell Signaling Technology), Fas /CD95 (CH-11, SY-001, MBL), DR4 (H-130, Santa Cruz), DR5 (N-19, Santa Cruz), FLIP (F6550, Sigma), fosfo-serina (policlonal de coelho, 61-8100, Life Technologies), p27 (G173-524 monoclonal mouse: BD Pharmagen ou policlonal de coelho C-19, Santa Cruz), HA (Rat, 3F10, Roche), HA (mouse, 12CA5, Roche), Myc (mouse, 9E10, Roche), beta-actina (monoclonal, Sigma), alfa-tubulina (monoclonais rato, B-7, Santa Cruz) e raiz-peroxidase-conjugados anticorpos secundários (cuidados de saúde GE) foram adquiridos a partir das fontes indicadas.

tela e dados siRNA análise

O Ambion Silenciador druggable Genoma Humano siRNA Biblioteca V2 foi entregue nas células por transfecção PPC1 reversa em 384 formato bem a 10 nM utilizando siRNA RNAiMAX (Life Technologies). Após 48 horas, as células foram tratadas com 3 ng de anticorpo FAS anti-/ml (CH-11) ou DMSO durante um período adicional de 24 horas, tempo após o qual a viabilidade foi lido utilizando ATP-Lite (Perkin Elmer) num leitor de placas Envision (Perkin Elmer Inc.). as leituras de dados em bruto foram normalizados para o média de controlos negativos incluído em cada placa e duplicados em média. O efeito da activação de FAS foi medida pelo cálculo das razões de viabilidade CH-11 /DMSO para cada ARNsi. A robusta

Z-Score

foi então atribuído a cada siRNA. Os valores de P foram também calculados para cada ARNsi utilizando um teste t de cauda-2 assumindo uma distribuição normal dos dados. Para produzir um resultado final do gene, que a média dos valores de Z dos 2 ou 3 siRNAs segmentação cada gene, bem como um valor de P utilizando rácios de viabilidade. Os valores para os siRNAs que mostram elevado desvio padrão ( 0,25). Entre os duplicados de DMSO ou CH-11 células tratadas foram removidos a partir da análise

Os plasmídeos

As mutações pontuais de PCTAIRE1 (K194M) era feita com um método de mutagénese sítio-dirigida baseada em PCR usando

Pfu polimerase (Agilent). Os plasmídeos de expressão de várias proteínas foram construídos no vector pcDNA3 para transfecção ou pRDI292 Puro-vector para a infecção por lentivírus. construção do plasmídeo apropriado foi confirmada por digestão com enzima de restrição e sequenciação de ADN. Os detalhes das sequências dos iniciadores utilizados para gerar as mutações pontuais estão disponíveis mediante solicitação.

linhas de células e cultura de células

PPC1, DU145, MDA-MB-468, T47D, MCF7, IMR- 90, células HeLa e HEK293T foram adquiridas a partir da ATCC. células /K-ras 267B1 e 267B1 estavam presentes amáveis ​​do Dr. Dritschilo [26]. Todas as células utilizadas tinham menos de seis meses de passagem contínua.

ensaios de viabilidade celular utilizando ATP medição

celular Titer Glo foi utilizado para estimar a viabilidade celular. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços brancos sólidos a uma densidade de 5000 ~ 10000 células por poço em 100 ul de meio completo com ou sem siRNAs e cultivadas durante 48 horas. As células foram então tratadas com várias concentrações de citoquinas ou compostos para 24 horas. Titer Glo celular solução foi adicionada a 100 ul por cavidade e as placas foram mantidas no escuro durante 15 minutos antes de medir a luminescência com um luminómetro (Luminoskan Ascent; Thermo Scientific).

Análise de apoptose

as células foram processadas utilizando um kit de detecção de apoptose AnnexinV-PI de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies) e analisados ​​por citometria de fluxo usando um dispositivo de FACS Canto (Becton Dickinson).

ARN interferência

para knockdown transiente, as células foram transfectadas com o ARNic em cadeia dupla por um método de transfecção reversa utilizando Lipofectoamine RNAiMAX de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies).

Tet-indutível curtas construções de ARN gancho de cabelo, e lentivírus infecção

PCTAIRE1 shRNA # 1 (GCTCTCATCACTCCTTCACTT), PCTAIRE1 shRNA # 2 (GACCTACATTAAGCTGGACAA), e disputa-controlo (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) foram clonados no pLKO-Tet-On puromicina vector indutível [27]. lentivirais sobrenadantes foram gerados de acordo com um protocolo estabelecido [27]. As células foram seleccionadas com 2 ug /ml de puromicina (MP Biomedicals). Indução de shRNA foi conseguida pela adição de 100 doxiciclina ng /ml ao meio.

A extracção de ARN total e análise por RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado a partir de células cultivadas utilizando o RNeasy mais Mini kit (Qiagen). A concentração de ARN foi medida espectrofotometricamente e as amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização com RT-PCR. O ARN foi transcrito reverso usando Superscript III (Life Technologies) e amostras de DNA complementares foram analisados ​​com o sistema de verde SYBR (Promega). Primers específicos para PCTAIRE1 humana, PCTAIRE2, PCTAIRE3, RIPK1 e controle housekeeping GAPDH humana estão listados abaixo

PCTAIRE1 Humano

Para a frente:. 5′-

Reverse ‘

GCAGTGACCCTGGAGAGG-3 : 5’TCAAGTCCTCGTGCACAATC-3 ‘

PCTAIRE2 Humano

Forward: 5’TGTTATTGGAGGGAGCCTTG-3′

Reverso: 5’TCTCACCATCTGATGCCATTT-3 ‘

PCTAIRE3 Humano

Forward: 5’ATGGCATCCACCTCCTGA-3 ‘

Reverso: 5’TCTGCTGACATGCGACTCTT-3′

RIPK1 Humano

Encaminhar

: 5′- GTGTACAAGGGGCCCAACT-3 ‘

Reverso: 5’CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT-3′

GAPDH humano

Forward: 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘

Reverso:. 5′- ‘

ATGGGATTTCCATTGATGAC-3

Todos os experimentos foram realizados em duplicado e em relação normalizada para níveis de GAPDH

SDS-PAGE, immunoblotting e imunoprecipitação

As células foram lavadas duas vezes com PBS e recolhidas com o ensaio de radioimunoprecipitação tampão (RIPA) contendo Tris-HCl a 20, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,1% de SDS, NaF 5 mM e completo isento de EDTA tablet protease cocktail (Roche). As células foram deixadas em gelo durante 20 minutos e centrifugou-se a 14.000 x

g

durante 10 minutos. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando um kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). Para Laemmli SDS-PAGE, as proteínas foram separadas em SDS-PAGE 4-15% de gel de gradiente (Life Technologies) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad). Phos-tag de SDS-PAGE foi realizada com géis pré-moldados (phostag géis de poliacrilamida a 12,5% contendo 50 uM Phos-tag acrilamida, Wako). Após a electroforese, os géis de acrilamida Phos-tag foram lavados com tampão de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 0,1%) contendo 5 mM de EDTA durante 10 minutos com agitação suave, e depois lavou-se novamente com o tampão de corrida sem EDTA durante 10 minutos de acordo com o protocolo do fabricante (Wako Chemical). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio durante 1 hora em solução salina tamponada com Tris (TBS) com 0,05% de leite seco não gordo de Tween-20 e 5%, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio. As membranas foram lavadas três vezes em TBS com 0,05% de Tween-20 e incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente. Um método de quimioluminescência aumentada (ECL) (GE Health Care) foi usada para a detecção.

Para imunoprecipitação (IP), as células foram lisadas em tampão de NP40 a 1% contendo Tris-HCl a 20, pH 7,5, 150 mM de NaCl , EDTA 0,1 mM, 1% de Nonidet P-40, NaF 5 mM e completa tablet protease cocktail livre de EDTA. Três miligramas de proteína de lisado foram utilizadas para imunoprecipitação com incubação durante a noite a 4 ° C e 2 ug do anticorpo dado. No dia seguinte, 30? L de resina de proteína G (Life Technologies) foi adicionado e incubado durante 1 hora a 4 ° C. Os IPs foram então lavadas quatro vezes com tampão de amostra de tampão de lise após o que foi adicionado, e as pérolas foram fervidas durante 10 minutos a 100 ° C.

ensaio clonogénico para avaliação da sensibilidade de Fas /TRAIL

As células foram semeadas em pratos de 35 mm a 1,0 x 10

5 células por cavidade e, em seguida, transfectadas com o controlo ou ARNsi PCTAIRE1-direccionamento. Após 2 dias, agonista anti-Fas AB foi adicionado (CH-11) ou TRAIL e as células foram cultivadas durante 3 dias antes da fixação e coloração com corante de violeta de cristal a 0,5%. Para a fixação, as células foram incubadas com metanol a -20 ° C durante 20 minutos, lavados com PBS, e incubadas com corante de violeta de cristal a 0,5% em metanol a 25% durante 15 minutos.

análise FACS de Fas /DR4 /DR5 expressão na superfície celular PPC1

e células MDA-MB-468 (1,0 x 10

5) que foram reversa-transfectadas com ARNsi de segmentação e precipitação PCTAIRE1-controlo foram semeadas em placas de 6 cm pratos. Quarenta e oito horas após a transfecção reversa, as células aderentes foram lavadas uma vez com PBS, individual utilizando TripleExpress (Gibco), e ressuspensas em tampão de FACS gelada (1% de FBS em PBS). Após centrifugação, as células foram ressuspensas em tampão de FACS a 3,0 x 10

5 células /100 uL. As células foram então incubadas no escuro em gelo com concentrações saturantes de marcado com ficoeritrina anti-DR4, anti-DR5 (eBioscience), marcado com FITC de anticorpos de controlo anti-Fas (BD Pharmagen), ou imunoglobulina G1 isotipo durante 1 hora de acordo as instruções do fabricante. Um total de 10.000 eventos foram analisados ​​por citometria de fluxo para cada tratamento.

Sincronização

Para prender as células HeLa em fase inicial S, método bloco timidina dupla foi aplicado [10]. Resumidamente, timidina (2,5 mM) foi adicionado a cultura durante 14 horas, e as células foram libertadas a partir do bloco por lavagem três vezes com PBS. Após 8 horas, foi adicionada timidina novamente. Depois de um segundo tratamento por 14 horas, as células foram lançados do bloco.

Quantitative Medição e Análise Estatística

média e desvio padrão (SD) foram calculados estatisticamente a partir de três determinações. Os dados são expressos como média ± DP. A significância estatística de diferenças entre diferentes amostras foi determinada pelo teste t de Student. P 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Identificação de PCTAIRE1 quinase por siRNA biblioteca triagem

Para identificar supressores candidatos ou intensificadores de apoptose induzida por Fas nas células tumorais, otimizamos dois tipos de rastreio de alto rendimento (HTS) para ensaios de rastreio de siRNA biblioteca. Usando células de cancro da próstata PPC1, determinou-se que a estimulação com doses baixas de anti-Fas CH11 anticorpo (3 ng /ml) não resultou em citotoxicidade, enquanto que a estimulação com anticorpo anti-Fas de dose elevada (25 ng /ml) matou estas células de tumor. Usando os siRNAs de controlo para validar o ensaio, determinou-se que 3 dos 3 siRNAs segmentação FLIP sensibilizados células PPC1 a dose baixa de (3 ng /ml) anticorpo anti-Fas Considerando 3 de 3 siRNAs segmentação FADD inibida PPC1 morte induzida por doses elevadas de ( 25 ng /ml) anticorpo anti-Fas. Depois de utilizar estes siRNAs de controlo para optimizar os ensaios de HTS para um Z ‘factor de 0,5, que em seguida, rastreados uma biblioteca de 16.800 siRNAs segmentação 5.600 genes (cobertura 3 vezes), o que constitui a chamada “genoma druggable”. PPC1 células em placas de 384 poços foram “reverso” transfectadas com ARNsi, em seguida, foi adicionado anticorpo CH11 2 dias mais tarde e a viabilidade celular avaliada utilizando um ensaio de bioluminescência para determinar os níveis de ATP um dia mais tarde (Fig S1., S1 conjunto de dados). O efeito da activação de FAS foi medida pelo cálculo das razões de viabilidade Fas /DMSO para cada ARNsi. Para produzir uma pontuação final gene, nós calculamos a média dos valores Z dos 2 ou 3 siRNAs segmentação cada gene. Para a baixa dose (3 ng /ml) de tela, a quinase PCTAIRE1 foi identificado como um supressor de apoptose induzida por Fas.

Gene knockdown de PCTAIRE1 sensibiliza células cancerosas para citocinas TNF-família

Para avaliar melhor o papel da PCTAIRE1 em citocinas TNF-família PPC1 em células do cancro da próstata, usamos siRNAs segmentação PCTAIRE1. A imunotransferência foi realizada pela primeira vez para confirmar knockdown ao nível da proteína (Fig. 1A). Usando 3 siRNAs que com sucesso derrubados expressão PCTAIRE1, observou-se a sensibilização de células PPC1 ao anticorpo anti-Fas (CH-11), TRAIL, e TNF-alfa (Fig. 1B e C, e S2A Fig.). AnnexinV experimentos de coloração confirmada de forma independente estes resultados, e forneceu provas de que um mecanismo de apoptose foi envolvido (Fig. 1D). Em contraste com Fas (CH-11), TRAIL e TNF, PCTAIRE1 knockdown não sensibilizar células PPC1 a outras vias de morte celular, incluindo estímulos que iniciam vias de apoptose do retículo endoplasmático (thapsigargin) e mitocôndria (estaurosporina) (S2B Fig. E dados não mostrados). Conclusões semelhantes foram alcançadas quando a sobrevivência clonogênica foi avaliada, com todos os 3 siRNAs segmentação PCTAIRE1 sensibilizar células PPC1 a Fas (CH-11) e TRAIL (Fig. 1E e F). Em contraste, knockdown siRNA mediada por PCTAIRE2 ou PCTAIRE3 não sensibilizar células PPC1 à FAS, TRAIL ou TNF (S2C-H Fig.). Também avaliamos o efeito de PCTAIRE1-knockdown na quimio-sensibilidade das células à cisplatina e paclitaxel. células PPC1 com PCTAIRE1-knockdown foram incubadas com diferentes concentrações de cisplatina e paclitaxel, e a avaliação da viabilidade celular não demonstrou quaisquer efeitos citotóxicos sinergísticos em células significativas (PPC1 S2I-N Fig.). Nós ainda avaliado mediada por siRNA PCTAIRE1-knockdown em outras linhas celulares, e constatou que, em células de cancro da mama MDA-MB-468 PCTAIRE1-knockdown foi eficaz na restauração da sensibilidade ao Fas ou TRAIL (S3A-F Fig.). No entanto, como seria de esperar para a heterogeneidade visto em cancros humanos, o efeito do knockdown PCTAIRE1 não foi uniforme em que os efeitos menos robustos foram observadas com células MCF-7 de cancro da mama humano (S3G-I Fig.).

( A) As células foram transfectadas com PPC1 ARN mexidos ou três diferentes ARNsi de segmentação PCTAIRE1 (siRNAs 1472, 1566, 1656). Os lisados ​​de células às 48 horas pós transfecção siRNA foram preparados, normalizados para o teor total de proteína, e aliquotas foram analisadas por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-alfa-tubulina (fundo) de anti-PCTAIRE1 (topo) ou. células PPC1 (B, C) foram transfectadas com RNA de controle (roxo “x”) ou vários siRNAs segmentação PCTAIRE1 (diamantes azuis, 1472; quadrados vermelhos, 1566, triângulos verdes, 1656). Após 48 horas, as células foram estimuladas com anticorpo anti-Fas (CH-11) (B) ou TRAIL (C) a várias concentrações, tal como indicado. Após 24 horas, os níveis de ATP celular foram medidos como um indicador substituto da viabilidade das células utilizando células reagentes Titer Glo, e os dados são expressos como a razão entre as células cultivadas com e sem anti-Fas (B), e TRAIL (C). análises (D) Apoptose foram realizadas utilizando um kit de annexinV. células PPC1 foram transfectadas com RNA corrida de siRNAs segmentação PCTAIRE1. Após 48 horas, as células foram tratadas com anticorpo anti-Fas (100 ng /ml) ou TRAIL (50 ng /ml) durante 4 horas. * P 0,05, *** P 0,001 por teste t. Todos os dados representam a média ± SD (n = 3). (E, F) ensaios de sobrevivência clonogénicos. células PPC1 foram semeadas em 6 bem (35 mm) pratos a 1,0 x 10

5 células por poço e, em seguida, inverter-transfectadas com disputa-control ou PCTAIRE1 de metas de siRNAs como indicado. Após 48 horas, o anticorpo anti-Fas (E, 10 ng /ml) ou TRAIL (F, 20 ng /ml) foi adicionado e as células foram cultivadas durante 3 dias antes da fixação e coloração com corante de violeta de cristal a 0,5%. células PPC1 (G, H) foram transfectadas com ARN de controlo ou ARNsi três diferentes segmentação PCTAIRE1. Após 48 horas, as células foram estimuladas com Fas (G, 10 ng /ml) ou TRAIL (H, 10 ng /ml). Após 3 horas, foram preparados lisados ​​celulares, normalizados para o teor total de proteína, e analisados ​​por imunotransferência utilizando um anticorpo específico para a caspase-8 clivado. A parcialmente clivado 43/41 kDa e bandas totalmente clivada de 18 kDa da banda são indicados, assim como os marcadores de peso molecular (kDa). O blot foi sondado com anticorpo de beta-actina como um controlo de carga. (I) células PPC1 foram transfectadas com disputa-control ou siRNA segmentação PCTAIRE1 (si-1472). Após 48 horas, as células eram ou não foram estimuladas com anticorpo anti-Fas (CH-11, 10 ng /ml). Após 3 horas, os lisados ​​celulares foram colhidas e imunoprecipitados com anticorpo anti-caspase 8 de anticorpo, seguido por imunotransferência com os anticorpos indicados. As setas vermelhas indicam bandas não específicas.

A activação de caspase-8 induzida por receptores de morte da família de TNF-é acompanhada por processamento proteolítico da molécula kDa pró-caspase-8 ~ 50, para se obter inicialmente ~ 43/41 kDa parcialmente transformado moléculas e, finalmente, para produzir os ~ 18 e ~ 10 kDa subunidades da protease cataliticamente activo. Utilizou-se imunotransferência para monitorizar os efeitos de knockdown mediada por siARN da PCTAIRE1 no processamento proteolítico de pró-caspase-8. O silenciamento mediado por siRNA de PCTAIRE1 em células PPC1 efectivamente aumentado Fas e transformação induzida por TRAIL de caspase-8 em comparação com o controle de ARN (Fig. 1G e H). Observou-se também a montagem do FADD /caspase-8 complexa (-morte induzindo complexo de sinalização: DISC) em células PPC1 tratados Fas com PCTAIRE1 knockdown (Fig 1I.). Por outro lado, knockdown da caspase-8 conferiu resistência Fas em células PPC1 com PCTAIRE1-knockdown (dados não mostrados).

Os efeitos PCTAIRE1-knockdown mediada por siRNA na via de morte celular extrínseca foram também reproduzidos usando tetraciclina shRNA vectores indutíveis introduzidas por infecção por lentivírus [27]. Em células PPC1 que foram estavelmente infectadas com duas diferentes shRNAs segmentação PCTAIRE1 (shRNA # 1 e # 2), a cultura com a doxiciclina analógico tetraciclina resultou em níveis de proteína PCTAIRE1 reduzidas (Fig. 2a). Correlacionando-se com estas reduções na proteína PCTAIRE1, a doxiciclina também restaurou a sensibilidade PPC1 ao Fas e TRAIL, tal como indicado pelos resultados de ensaio de viabilidade celular (Fig. 2B-E). Resultados semelhantes foram obtidos com duas outras linhas de células de tumor (células MDA-MB-468 e DU145) que foram estavelmente transduzidas com vectores PCTAIRE1 shRNA induzível por tetraciclina (S4 e S5 Figs.). A partir destes resultados, podemos concluir que PCTAIRE1 confere resistência Fas /TRAIL em células cancerosas epiteliais.

células PPC1 (A) contendo estavelmente shRNA induzível segmentação locais diferentes em mRNA PCTAIRE1 (shRNA # 1, # 2) ou scramble- controlo foram cultivadas durante 48 horas com doxiciclina (Dox, 100 ng /ml). Os lisados ​​de proteína foram gerados, normalizada para a concentração de proteína total e analisadas por SDS-PAGE /imunotransferência utilizando anticorpos para PCTAIRE1 (topo) e da beta-actina (parte inferior). células PPC1 (B, C) foram cultivadas com (NO) ou sem (OFF) a 100 ng /ml Dox durante 48 horas, em seguida estimuladas com várias concentrações de um ou outro anticorpo anti-Fas CH-11 (B) ou TRAIL (C). Após 24 horas, os níveis de ATP celular foram medidos, e os dados foram expressos como uma razão em relação a células cultivadas sem anti-Fas ou TRAIL (média ± SD; n = 3). (D, E) ensaios de sobrevivência clonogénicos. células PPC1 contendo estavelmente shRNAs indutível (precipitação ou shRNA # 2) foram cultivadas com (NO) ou sem (OFF) a 100 ng /Dox ml durante 48 horas, em seguida estimuladas com anticorpo anti-Fas (CH-11, 10 ng /ml) ou TRAIL (20 ng /ml). As células foram cultivadas durante 3 dias antes da fixação e coloração com corante violeta de cristal 0,5%.

As células transformadas são preferencialmente dependente PCTAIRE1 para resistência a trilha

Entre as citocinas TNF-família, TRAIL é considerado a arma mais promissora para combater células cancerosas, porque a sensibilidade TRAIL é observada predominantemente no tumor, mas não as células normais [28,29]. Além disso, as análises histológicas de tecidos da próstata e da mama primárias revelaram que PCTAIRE1 imunocoloração foi muito baixo em tecidos normais, mas nitidamente superior em cancros [10]. Estas observações sugerem que PCTAIRE1-knockdown não iria afectar a via de morte celular em células normais extrínseca. Para apoiar esta possibilidade, examinámos o knockdown de PCTAIRE1 na linha de fibroblasto diplóide humano IMR-90. Nestas células siRNA mediada PCTAIRE1-knockdown não afectou a sensibilidade TRAIL tal como avaliado por medição dos níveis de ATP (Fig. 3A e D). Para examinar o papel da PCTAIRE1 no normal versus células transformadas, foi aplicado PCTAIRE1-siRNAs para imortalizadas 267B1 células normais epiteliais da próstata e seus K-ras (V12) transformadas homólogo isogênico, 267B1 células /K-ras [26], seguido de confirmação ARNsi de eficácia usando imunotransf erência (Fig. 3B e C). Sensibilidade à TRAIL foi avaliada por níveis de ATP, o que indica que as células 267B1 /K-ras com PCTAIRE1 knockdown eram notavelmente sensível a trilha em relação ao controle 267B1 células /K-ras com disputa-siRNA (Fig. 3F). Em contraste, não transformada 267B1 células com PCTAIRE1-knockdown não mostrou nenhuma mudança significativa na sensibilidade TRAIL em comparação com células (Fig. 3E) de controlo de embaralhar. Estes resultados sugerem que as células transformadas são preferencialmente dependente PCTAIRE1 para resistência a TRAIL.

(AC), fibroblastos humanos diplóides IMR-90 (A), células epiteliais da próstata 267B1 normais imortalizadas (B), e K-ras 267B1 transformadas células (267B1 /K-ras) (C) foram transfectadas com ARN mexidos ou três diferentes ARNsi de segmentação PCTAIRE1 (ARNsi: SI-1472, SI-1566, SI-1656). Os lisados ​​de células 72 horas após a transfecção foram preparados e analisados ​​por imunotransferência utilizando anti-coelho PCTAIRE1 (topo) ou anticorpos anti-beta-actina (fundo). (D-F) IMR-90, 267B1 e células 267B1 /K-ras foram transfectadas com ARNsi. Após 48 horas, as células foram estimuladas com TRAIL a várias concentrações, tal como indicado. Após 24 horas, os níveis de ATP celular foram medidos, e os dados expressos como uma razão entre células cultivadas com e sem TRAIL (média ± SD; n = 3)

PCTAIRE1-knockdown modula a expressão da proteína RIPK1.

Para explorar o mecanismo pelo qual PCTAIRE1 suprime a apoptose induzida por TRAIL /Fas, examinámos o impacto de PCTAIRE1 knockdown sobre a expressão de várias proteínas que têm sido implicados na via de sinalização do receptor de citocina TNF-família. Porque PCTAIRE1-knockdown sensibilizados células PPC1 a estímulos de receptores de morte (FAS, TRAIL), mas não agentes que desencadeiam outras vias de morte celular, que suspeitava que PCTAIRE1 pode bloquear um passo proximal em Fas e sinalização do receptor de TRAIL. O evento crítico para o início do percurso apoptose induzida por citocinas TNF-família é a ativação da caspase-8, que exige a proteína adaptadora FADD, e opõe-se a FLIP. Como mostrado acima, PCTAIRE1-knockdown activado processamento de caspase-8 (Fig. 4A), mas PCTAIRE1-knockdown não afectou os níveis de FADD, pro-caspase-8 ou C-FLIP expressão (S6A Fig.). A medição dos níveis de superfície celular (por FACS) ou níveis celulares totais (por imunotransferência) do Fas, TRAIL-receptor 1 (receptor de morte 4, DR4) ou TRAIL-receptor 2 (receptor de morte 5, DR5) também mostrou nenhuma diferença reprodutível entre as células de controlo e PCTAIRE1-knockdown (S6A B e Fig., e dados não mostrados). Além disso, enquanto a fosforilação de caspase-8 e FADD são alegadamente envolvido na resistência a citoquinas da família do TNF [11,12,30], foi detectada nenhuma alteração notável dos níveis de fosforilação da caspase-8 (Ser387) ou FADD (Ser194) em PCTAIRE1 células PPC1 com superexpressão /células PPC1 knockdown (S6C-F Fig.).

(A) foram transfectadas com RNA de controle ou três siRNAs diferentes visando PCTAIRE1. Após 48 horas, os lisados ​​celulares foram preparados com tampão RIPA, normalizados para o teor total de proteína, e analisados ​​por imunotransferência utilizando os anticorpos indicados. (B) As células foram transfectadas com PPC1 ARNsi indicados durante 48 horas, após o que os lisados ​​de células foram recolhidas em 1x tampão de Laemmli e sujeitos a análise de imunotransferência para RIPK1 (topo) e da beta-actina (meio). células PPC1 (C, D) foram transfectadas com os ARNsi indicados. Após 48 horas, as células foram tratadas com o inibidor de proteassoma MG-132 (10 uM) durante 5 horas antes da preparação dos lisados ​​celulares (C: 1x tampão de Laemmli, D: tampão RIPA). células PPC1 (E) foram transfectadas com RNA controlo ou siRNA segmentação RIPK1. Após 48 horas, os lisados ​​celulares foram preparados em tampão RIPA, normalizados para o teor total de proteína, e analisados ​​por imunotransferência utilizando os anticorpos indicados. células PPC1 (F, G) foram transfectadas com RNA controlo ou siRNA segmentação RIPK1. Após 48 horas, as células foram estimuladas com anticorpo anti-Fas (CH-11) (F) ou TRAIL (G) a várias concentrações, tal como indicado.