Abstract

O AKT1 hotspot

E17K mutação no domínio plecstrina homologia de AKT1 ocorre em aproximadamente 0,6-2% dos cancros do pulmão humanos. Recentemente, demonstramos que AKT1

E17K transforma células brônquicas humanas imortalizadas. Aqui pelo uso de uma estirpe murina Cre-inducible transgênica no tipo selvagem Rosa26 (R26) loco (

R26-AKT1

E17K

ratos) demonstramos que AKT1

E17K é um

de boa-fé

oncogene e desempenha um papel no desenvolvimento do câncer de pulmão

in vivo

. Na verdade, nós relatam que mutante AKT1

E17K induz brônquica e /ou lesões hiperplásicas bronquiolar em epitélio pulmonar murino, que progridem para carcinoma franca a muito baixa frequência, e acelera a formação de tumores induzidos por carcinógenos químicos. Em conclusão, AKT1

E17K induz hiperplasia do epitélio do mouse pulmão

in vivo

e coopera com uretano para induzir o fenótipo totalmente maligno

Citation:. Malanga D, Belmonte S, Colelli F, Scarfo M, De Marco C, Oliveira DM, et al. (2016) AKT1

E17K Oncogênicos no mouse pulmão é e coopera com produtos químicos cancerígenos na indução do câncer pulmonar. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10.1371 /journal.pone.0147334

editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigações Oncológicas (CNIO), ESPANHA

Recebido: 30 de março de 2015; Aceito: 01 de janeiro de 2016; Publicação: 09 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Malanga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) e Ministero Istruzione Università e Ricerca (MIUR PRIN, prot 2010W4J4RM_001. ; PONa3_00239; PON01_02782) ao VG. HF foi apoiada por Västra Götalandsregionen no âmbito do acordo LUA /ALF e pelas Fundações Assar Gabrielssons e Magnus Bergvalls

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer, estando associada a uma taxa de sobrevivência em todo o mundo em 5 anos de menos de 15% [1,2]. activação mutacional do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) via é o principal evento patogénico no adenocarcinoma induzida por tabaco não (ADC), ao passo que a via impulsionado por v-Ki-ras2 /Kirsten sarcoma de rato oncogene virai homólogo (KRAS) está envolvido na carcinogênese pulmonar mediada pelo tabaco [3-6]. Infelizmente, As mutações de activação de EGFR não estão tipicamente presentes no carcinoma epidermóide de pulmão (SCC), o segundo tipo mais comum de NSCLC [7], e terapia, assim, alvo é ineficaz. Estudos recentes mostram taxa de 2-4% de p110 subunidade α-catalítica de mutações PI3K (PIK3CA) [8-10] e taxa de 1% das mutações AKT1 [11,12] em SCC têm sugerido que a segmentação destes genes pode revelar-se um sucesso terapêutico opção [7,13-15].

as quinases AKT (AKT1, AKT2, AKT3) representam o ponto final primário a jusante da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), proliferação de regulação, sobrevivência, metabolismo e invasão. AKT1 e AKT2 são frequentemente ativada no câncer humano [16-18] após perda da fosfatase lipídica PTEN, mutações ativadoras e /ou copiar número variação nos receptores da tirosina quinase de EGFR ou HER2, mutações ativadoras no KRAS, em PIK3CA [19,20]

, [21] ou na própria AKT1 [22]. No cancro do pulmão de uma mutação somática no domínio de homologia plecstrina (PH) de AKT1 que resulta na substituição de ácido glutâmico para lisina no resíduo 17 (E17K) foi relatada com frequência global de 0,6-2% [7,11,12,23-25 ].

AKT1

E17K mostra maior afinidade para PI (4,5) P2, recrutamento membrana plasmática aumentada e ativação constitutiva [22,26]. AKT1 endógena

localização E17K proteína mutante detectado em células de cancro do pulmão mostra reforçada membrana [11], que resulta na activação de sinalização a jusante [11,22].

O papel de AKT1 mutante

E17K na tumorigênese epitelial ainda não está claro porque os estudos em modelos celulares em células da mama e do pulmão têm produzido resultados discordantes [27-30]. Além disso, nenhuma tensão murino que modela o AKT1

mutação E17K foi gerado até agora.

Estas considerações levaram-nos a abordar o papel da AKT1

E17K na transformação de células epiteliais do pulmão

in vivo

. Aqui, demonstramos que AKT1

E17K promove hiperplasia no pulmão do rato e coopera com outras lesões genéticas para induzir a malignidade cheia.

Materiais e Métodos

Desenho vetorial e Geração de ratinhos transgénicos

Para gerar

R26-AKT1

E17K

camundongos transgênicos cDNA AKT1 humana foi amplificado por PCR a partir de células mononucleares do sangue humano por PCR usando iniciadores 5′-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 ‘e 5′-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3’. O produto de PCR foi clonado num plasmídeo de vaivém (pBlueScript) usando técnicas de clonagem convencionais. AKT1 mutante

E17K ADNc foi gerado por Quick Change Site-directo mutagénese (Stratagene) e sub-clonado no vector pROSA26 [31-33] para se obter o direccionamento E17K construir PR26-AKT1

, que consistiu em 5? e 3 ‘braços de homologia do locus ROSA26, FRT /FRT-flanqueado de resistência à neomicina (Neo) cassete e sequência loxP /ladeado-loxP triple poliadenilação (TPA). Ver figura 1 para detalhes.

A. Representação esquemática da construção de direccionamento usado para o knock-in condicional no

R26

lócus. O ser humano

AKT1

E17K

cDNA precedidos por uma cassete de paragem da transcrição ladeado-loxP, foi recombinada no locus de R26. remoção mediada por Cre da cassete de batente liga Rosa26 exão 1 ao ADNc exógeno, permitindo a expressão do transgene. B. Southern blot de ADN genómico digerido com EcoRV derivado de mESCs transfectadas com a construção de direccionamento realização AKT1 mutante. Pista 1: DNA de mESCs não-alvo, pista 2 e 3: DNA de DNA a partir de dois diferentes

R26-AKT1

E17K

estirpes mESCs. alelo endógena corresponde à faixa de 11,5 kb (

WT

); alelo mutante corresponde à banda de 4,3 kb (

REC

). C. expressão de ARNm de AKT1 humano Relativa

E17K por Q-RT-PCR em mESCs específicas e nas células correspondentes transfectadas com o Flp (pFlpE-IRES-Puro) ou a recombinase Cre (pcre-IRES-puro). Os dados são a partir de experiências em replicado como a média ± DP. *** P 0,001. D. Análise de genótipo por PCR no DNA da ponta da cauda de camundongos geneticamente modificados, como indicado.

30 ug do R26-AKT1

plasmídeo E17K foi linearizado com a enzima de restrição SfiI (New England Biolabs,) e electroporado em células-tronco embrionárias de camundongos (Mesc). Mesc clones resistentes a G418 foram isoladas e rastreadas quanto direccionamento correcto do locus por PCR (iniciadores F1 e R1, respectivamente: 5′-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 ‘, 5’-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) amplificação de um fragmento de 3,9 kb. Os clones resistentes a G418 positivos de PCR foram subsequentemente pesquisados ​​por Southern blot de sondagem por recombinação junção 5 ‘. Uma vez identificadas, os clones Mesc alvo foram transf ectadas com o plasmídeo de expressão de Flp-(-pFlpE-IRES Puro) para a excisão da cassete NEO. Os clones Mesc Subsequentemente, neo-apagados foram isolados, rastreados por PCR (iniciadores F2 e R2, respectivamente: 5’-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 ‘, 5′-R2 GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3’) e injectados em blastocistos B6, que foram subsequentemente transferido para pseudo fêmeas -pregnant para produzir animais quiméricos no Embryonic Stem Cell Facilidade de IRGs (Ariano Irpino, Avellino, Itália). As quimeras gerados foram criados para estabelecer a transmissão da linha germinativa do alelo humano. Os genótipos de

R26-AKT1

E17K

ratos foram determinadas por PCR utilizando ADN genómico isolado a partir das pontas da cauda com os seguintes iniciadores: 5’ARMF, 5′-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 ‘ ; 3’ARMR, 5’-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 ‘; mE17KR5 5’-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 ‘. O

R26-AKT1

E17K

linha foi acasalado com

TTF1-Cre

line (um presente do Dr. Mario De Felice, IRGs, Ariano Irpino, Itália ), para gerar

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre;

ratos. O

TTF1

-Cre ratos foram genotipados usando os seguintes iniciadores: FP, 5′-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 ‘: RP, 5′-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3’.

R26-AKT1

E17K

ratos foram back-cruzadas no fundo B6. Em todos os experimentos da mesma ninhada foram utilizados como controle.

A experimentação animal foi aprovado pelo comitê de ética local “Comitato Ético per la Sperimentazione Animale” (CESA) do IRSG e com as normas e diretrizes da Itália e da União Europeia. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais (S1 CHEGAR Checklist). Os ratinhos foram alojados em um ambiente microbiológico altamente controlado para garantir condições SPF. Eles foram mantidos em gaiolas de VCI, sob condições constantes de temperatura (22 ± 2 ° C), humidade (55 ± 10% UR) e ciclo luz /escuro de 12/12 horas. Os animais tiveram livre acesso à dieta padrão irradiada e água. Camundongos foram genotipados por PCR do ADN da cauda [34]. A deleção de sequências de terminação de transcrição flanqueada-loxP foi determinada por PCR utilizando os seguintes iniciadores:.

TRF, 5′-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 ‘;

L2R 5′-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3′

a expressão de AKT1

E17K em mESCs transfectadas com pcre-IRES-puro foi determinada por RT-PCR quantitativo.

Southern blot

Um protocolo padrão para transferência de Southern foi usava. O ADN genómico (30 ug) foi digerido com EcoRV. Uma sonda de 500 pb do lado 5 ‘do sítio de inserção alvo (de CTTGAAAGTGGAGTAACTAC para TCAGAAGCTTTGAACTAGAA no locus ROSA26) foi marcado com DIG-dUTP, utilizando o kit de PCR DIG Probe Synthesis (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suíça). Esta sonda identifica um fragmento de 11,5 kb em selvagem lócus tipo ROSA26 e um fragmento 4.3kb in locus ROSA26 alvo.

Western Blot e anticorpos

extractos de proteínas de tecido inteiras foram preparadas com tampão NP-40 ( Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de NP-40) contendo inibidores de protease (SigmaFast, Sigma-Aldrich). A análise Western blot foi efectuada através de métodos padrão [11]. Anti-fosfo-AKT (Ser473) (# 4058), anti-AKT1 (# 2938), anti-fosfo-FOXO1 (Ser256) (# 9461), anti-FOXO1 (# 2880), anti-fosfo-GSK3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), anti-GSK3-α (# 9338), anti-GSK3-β (# 9332) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danver, MA).

reversa quantitativa transcrição-PCR em tempo real (Q-RT-PCR)

O ARN total foi preparado como descrito [35]. RT-PCR foi realizada em RNA extraído de Trizol (Invitrogen) e com Superscript II (Invitrogen) transcrito-retro. Q-RT-PCR foi realizada utilizando o Poder SYBR Mix PCR Verde Mestre em ABI Prism 7900 termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA). a expressão do gene foi normalizado para o conteúdo mRNA GAPDH. As quantidades relativas de ARNm ou de ADN foram calculados pelo método comparativo limiar de ciclo (CT) [36]. Os seguintes primers são usados ​​em Q-RT-PCR

AKT1R26 frente 5′-CACACCACCTGACCAAGATG-3. ‘;

AKT1R26 reversa 5′- AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3′

Virus infecção de camundongos

Controle

R26 um

nd

R26-AKT1

E17K

camundongos foram infectados com 10

6 ou 10

7 pfu de Adenovirus expressar Cre (Ad-Cre) (Vector Biolabs, Philadelphia, PA). Ratos entre 6 e 12 semanas de idade foram anestesiados com isoflurano e o Ad-Cre foi administrada por via intranasal. Os murganhos receberam 120 ul de Ad-Cre, em duas doses de 60 ul de cada, com um intervalo entre as duas doses, para permitir que os ratos a recuperar uma respiração normal. ratinhos de controlo receberam uma quantidade igual de solução de fosfato salina tampão (S1 CHEGAR Checklist).

Experimental Carcinogênese

R26 ou R26-AKT1

E17K

da mesma ninhada foram ou infectadas com Ad-Cre (10

10/6

7 UFP) ou tratados apenas com solvente antes de receber a injecção intra-peritoneal com uma dose única de 1 mg /g de peso corporal de uretano, uma éster etílico de ácido carbâmico amplamente utilizados em modelos murinos de carcinogénese [37], dissolvido em solução salina estéril a 0,9%. Os ratos foram monitorados semanalmente e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Nenhum rato tinha que ser sacrificados antes do ponto final experimental específica (6, 9 e 18 meses, respectivamente) por razões de saúde. Os ratos foram sacrificados após 6, 9 e 18 meses por deslocamento cervical (S1 CHEGAR Checklist). Os pulmões foram removidos e inflados com 10% de formalina tamponada neutra. tecidos pulmonares foram recolhidos e fixados com formalina a 10% e embebidos em parafina utilizando procedimentos padronizados. Pulmonar foi realizada secção para abranger 1,5 mm do parênquima do pulmão; seções frontais foram coletadas em 15 níveis, com 100 mm de espaçamento) de distância sagital para cobrir adequadamente ambas as regiões periféricas e centrais. As secções foram montadas em lâminas e corado com ad hematoxilina eosina e foram avaliadas por microscopia de luz por patologistas veterinários e patologista humana (OP, HF e CM). Para cada tumor o slide com diâmetro máximo da lesão foi identificada e registrada sob o microscópio.

A análise histológica e imunohistoquímica

tecidos pulmonares foram recolhidos e fixados com formalina a 10% e embebidos em parafina usando o padrão procedimentos. Secções (5m) foram montadas em lâminas e corado com hematoxilina e eosina para ser avaliada por microscopia de luz por patologistas (CM) humanos veterinário (OP e HF) ou. A pontuação combinada de lesões hiperplásicas foi calculado adicionando uma pontuação que mede o número de camadas epiteliais (escore Layer) para um percentual de medição pontuação de hiperplasia presente em toda a seção (pontuação global hiperplasia). A pontuação camada foi definida do seguinte modo: marcar um, a presença da camada de 1-2 (s), valor 2, a presença de 2-3 camadas, de classificação: 3, a presença de 4 camadas. A pontuação hiperplasia global foi definida da seguinte forma: escore 1, quando hiperplasia estava presente em 1-20% das seções totais analisados ​​(3 cortes seriados /mouse); escore 2, quando hiperplasia gostava em 21-60% das seções total analisado (3 cortes seriados /mouse); escore 3, quando hiperplasia foi encontrado em 61-100% das seções total analisado (3 cortes seriados /mouse).

A imunocoloração com anti-fosfo-AKT foi realizada com protocolos padrão usando o Vectastain Universal Kit Rápido e DAB Substrato de peroxidase Kit (Vector Laboratories, Burlingame) de acordo com as instruções do fabricante. A recuperação de antígenos foi realizada com o tratamento com microondas em antigénio solução desmascaramento (VectorLaboratory, Burlingame, CA) durante 10 min. De coelho anti-fosfo-AKT (Ser473) (1: 1000, # 4058) foi adquirido a Cell Signaling Technology

imunocoloração para Ki67 foi realizada com protocolos padrão utilizando cola ™ Polímero Refinar Detecção (Leica Biosystem, Buffalo Grove. , IL) de acordo com as instruções do fabricante. Anti-Ki67 de coelho (1: 100, PA5-19462) foi comprado a Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, PA). A imunocoloração de p21 foi realizada com protocolos padrão, utilizando EnVision ™ Detection Systems Dako, de acordo com as instruções do fabricante. Coelho policlonal Ab-5; anti-p21 /WAF1 anti-soro (1:50) foi adquirido a partir de Oncogene Research Products (Cambridge, MA). Ki67 e p21 positividade foi determinada por contagem dos núcleos positivos em 10 campos no X400 ampliação

captura de Laser microdissection (LCM)

Microdissecção foi realizada utilizando o laser Microdissector Leica LMD6 LMD7 (Leica Microsystem, Milan). 5 mícrons secções de tecido de tumor em lâminas de vidro foram inseridos no Microdissector laser para dissecção de tumores pulmonares. áreas selecionadas foram capturados com pulsos de laser infravermelho para CaPSURE Macro LCM Caps.

Direto

Kras

sequenciamento

amostras microdissecadas foram lisadas por Kit SB LysePrep (Silicon Biosystem, Bolonha) de acordo as instruções do fabricante. Alíquotas da solução de lise (2,5 uL) foram utilizados como molde para a amplificação de ADN com os seguintes iniciadores: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA e mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. O programa de amplificação foi utilizado: 95 ° C /5 min; 35X (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) para a desnaturação, emparelhamento e extensão; 72 ° C /7 min para terminar extensão, seguindo-se arrefecimento a 15 ° C. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% e purificados pelo kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen). Os produtos de PCR purificados foram analisados ​​em 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Para todas as análises, os dados foram alinhadas com a sequência de consenso obtida a partir da base de dados GenBank BLAST

Imunofluorescência coloração

secções desparafinadas foram hidratados em soluções de gradiente decrescente de etanol e lavadas em solução de lavagem (TBST, 0,05. mol /L de tampão salino Tris com Tween 20). A recuperação de antígenos foi realizada com tampão de citrato de pH 6 durante 30 minutos a 98 ° C seguido por lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4). As secções foram incubadas com anticorpos contra a SP-C (anticorpo policlonal de cabra anti-SP-C, 1: 200 diluição, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA) ou anticorpo CC-10 (policlonal de cabra anti-CC-10, 1 : 200 diluição, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA) durante 60 min, seguido por incubação com anticorpos secundários Alexa Fluor 488 conjugado anti-IgG de cabra (1: 400 de diluição; Santa Cruz Biotechnology) durante 60 min. As células foram contrastadas com DAPI (2 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), montado utilizando meio de montagem (DakoEnvision Sistema, Inc, CA, EUA) e anti-desbotamento observado na microscopia de fluorescência (Leica Microsystems)

. a análise estatística

os dados apresentados são as médias ± DP de

n

ensaios independentes ou replica como indicado no texto. As variáveis ​​contínuas foram analisadas pelo teste t ou o teste ANOVA de Student, enquanto as variáveis ​​categóricas foram analisadas por χ

2 ou teste exato de Fisher. Significância foi calculada pela Log-rank (Mantel-Cox) teste (GraphPad Prizm 5 Software, San Diego, CA).

Resultados

Mutant AKT1

E17K promove hiperplasia de brônquios e bronquíolos

Geramos uma estirpe de ratinho transgénico (

R26-AKT1

E17K

) que expressa condicionalmente AKT1 mutante humana no pulmão através da utilização de um sistema de knock-in (Cre condicional

Rosa26

,

R26

), que abriga sequências de terminação da transcrição ladeado-loxP a montante de cDNA AKT1 mutante (Fig 1A). CES murino foram alvejados e rastreados por Southern blot para identificar clones que carregavam o alelo recombinante (Fig 1B) e para a expressão induzida por Cre do transgene (Fig 1C). Cre-responsive

R26-AKT1

E17K

mESCs foram então usados ​​para gerar ratos quiméricos. transmissão germinal do bateu-in alelo foi confirmada por PCR (Fig 1D)

Para expressar AKT1 mutante no epitélio pulmonar foram utilizados dois sistemas diferentes:. instilação intranasal de um adenovírus carregando a recombinase Cre (Ad-Cre) ou do acasalamento de

R26-AKT1

E17K

ratos com

TTF1-Cre

ratos [38,39]. O uso de

TTF1-Cre

ratos permitiram a expressão do transgene no epitélio brônquico [39]

, [40] enquanto que a instilação de Ad-Cre apresenta as vantagens de permitir a activação somática do transgene em áreas remendadas e de não selecionar com antecedência o tipo de célula em que o transgene é expresso.

na primeira série de experimentos, nós cruzamos o

R26-AKT1

E17K

ratos com

TTF1-Cre

. Fig 2A mostra a supressão da cassete de loxP em tecidos pulmonares de

R26-AKT

E17K

; TTF1-Cre

ratos; Figura 2B mostra em tempo real de RT-PCR expressão de AKT1 mutante no pulmão e a Figura 2C mostra o aumento dos níveis da Akt fosforilada e /ou substratos de AKT (GSK3α /p, FOXO1) nos pulmões a partir de

R26-AKT

E17K

; TTF1-Cre

ratinhos comparada com

R26-TTF1-Cre

ninhada. Medimos expressão AKT1 por RT-PCR em cinco tecidos adicionais (cauda, ​​músculo, rim, baço, coração e fígado) derivadas a partir de R26-AKTE17K; TTF1-Cre e R26-TTF1-Cre ratinhos da mesma ninhada e os resultados são mostrados na Fig S1. Como mostrado, nenhuma expressão é observada em tecidos diferentes dos pulmões.

. análise de PCR de DNA pulmonar de

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

e de controlo da mesma ninhada. ΔStop TPA: sinal de paragem de terminação da transcrição ladeado lox-P. B. expressão de ARNm de AKT1 Relativa humano por Q-RT-PCR em ARN de pulmões a partir de

R26; TTF1-Cre

,

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

. Os dados são apresentados a partir de análise de replicação como a média ± DP. C. Representante análise immunoblot de pAKT, AKT1 total e proteínas de sinalização a jusante em extratos de proteína total de pulmões inteiros de

R26; TTF1-Cre

e

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

ratos, respectivamente. D-E. Representante H E coloração dos pulmões de

R26; TTF1-Cre

e

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

, respectivamente. Ampliação como indicado. F-G. coloração pAKT representante da pulmões de

R26;. Nkx2

1-Cre

e

R26-AKT1

E17K

; Nkx2

.

1-Cre

, respectivamente. Ampliação como indicado.

Ratos de 2 (n = 10), 6 (n = 8) e 12 (n = 11) meses de idade foram sacrificados como pontos finais.

TTF1-Cre

ratos mostraram nenhuma evidência de doença até 12 meses de idade (n = 7). Por outro lado, a análise histopatológica revelou a presença de lesões hiperplásicas no pulmão de todos os 12 meses de idade,

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

camundongos (Fig 2D e 2E). Esses camundongos mostraram hiperplasia moderada do brônquica e /ou epitélio brônquico terminal com núcleos polarizados. epitélio alveolar estava normal embora atelectasia foi observado em alguns ratos. Imunocoloração com anti-pS473 demonstrou aumento dos níveis de activação AKT nos pulmões hiperplásicas de

R26-AKT1

E17K

; TTF1-Cre

ratos em comparação com o controle ou

TTF1-Cre

camundongos (Fig 2F e 2G).

Nós também activado o AKT1 mutante

E17K transgene por administração intranasal de Ad-Cre (10

6, 10

7 pfu) em 6-12 semanas de idade,

R26-AKT1

E17K

ratos. Depois de 6, 9 e 18 meses (n = 8, 8 e 7, respectivamente) os ratinhos foram sacrificados e os pulmões foram analisados. Não foram observadas alterações pulmonares em

R26-AKT1

E17K

ratinhos tratados apenas com solvente (PBS) (n = 7) (Fig 3A). Por outro lado, praticamente todos os

R26-AKT1

E17K

ratinhos desenvolveram brônquica moderada e /ou hiperplasia bronquiolar terminal de 9 meses após a administração Ad-Cre (Fig 3B e 3C).

AD. Representante H E coloração do epitélio pulmonar de

R26-AKT1

E17K

ratos tratados com veículo sozinho (não infectado) ou infectadas com Ad-Cre (9 e 18 meses de idade , respectivamente). Ampliação como indicado.

Para melhor caracterizar as lesões detectadas em transgênico

R26-AKT1

E17K

ratos, avaliamos hiperplasia pulmonar, analisando o número de camadas epiteliais no epitélio brônquico e a percentagem de hiperplasia em toda a área de 3 cortes seriados derivados do representante

R26-AKT1

E17K

ratos após 6 (n = 3) e 9 (n = 3) meses a partir da administração de Ad-Cre (código ratos # 7a- # 12-A). Como controles que fez uso do mesmo número de

R26-AKT1

E17K

ratinhos tratados apenas com solvente (mouse # código 1a- # 6-A), respectivamente. A quantificação de camadas epiteliais e de áreas hiperplásicas foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Imagens representativas das notas atribuídas para o número de camadas são mostradas na Fig S2.

lesões hiperplásicas foram classificadas com base no número de camadas epiteliais e a percentagem de hiperplasia. Avaliação de camadas epiteliais, marcar 1: 1-2 camadas de células epiteliais, marcar 2: 2-3 camadas de células epiteliais, marcar 3: 4 camadas de células epiteliais (n = 6 ratos /grupo; 3 cortes seriados /rato ). A avaliação do grau de hiperplasia, marcar 1: hiperplasia em 1-20% das seções totais analisados; pontuação 2: hiperplasia em 21-60% do total de secções analisadas; marcar 3: hiperplasia em 61-100% das seções totais analisados ​​(n = 6 ratos /grupo; 3 cortes seriados /ratinho). As lesões foram classificadas de acordo com uma pontuação combinada resultante da soma da pontuação de camadas e pontuação da percentagem de hiperplasia (p 0,05; t de Student).

Entre os ratinhos controlo pontuação Camada foi de 1 para 4 de 6 ratos e 2 para 2 de 6 ratos. pontuação hiperplasia global foi de 1 para 5/6 e 2 para 1/6 ratos. Por outro lado, da

R26-AKT1

E17K

pontuação ratos camada foi 1 para 1/6 ratos e 2 para 5/6 ratos e global pontuação hiperplasia foi de 1 para 2/6 , 2 e 3 para 2/6 para 2/6 ratinhos. Finalmente, descobrimos que

R26-AKT1

E17K

ratos apresentaram uma pontuação combinada de hiperplasia de 3,8 ± 0,4, que foi significativamente maior do que em ratos de controle (2,5 ± 0,3) ( n = 6 /grupo, p . 0,05)

Posteriormente, foi investigado se as lesões hiperplásicas observados foram proliferativa ou por immonostaining de Ki67 e p21 relacionados com a senescência. Os resultados estão resumidos na Tabela 2 e as imagens representativas da coloração de Ki67 e p21 em pulmões de ratinho estão apresentados na Fig S3. Verificou-se que o número médio de núcleos de Ki67-positivas em ratinhos transgénicos R26-AKTE17K (11,1 ± 1,2, n = 5) foi mais do que duas vezes maior em comparação com ratinhos de controlo (4,6 ± 0,49, n = 3). Por outro lado, não foi observada nenhuma diferença significativa de coloração p21. Estes resultados sugerem que as lesões hiperplásicas induzidas por AKT1

E17K no pulmão de camundongos transgênicos são resultado do aumento da proliferação celular.

É digno de nota que, após 18 meses de tratamento, dois de sete

R26-AKT1

+ /E17K

ratos tratados com Ad-Cre desenvolvidos um único nódulo cada um, que foi diagnosticado como adenocarcinoma brônquio-alveolar com padrão papilar consistindo de cabos e ninhos de células epiteliais rodeado por estroma fibrovascular esparso (Fig 3D). análise imunocoloração demonstrou altos níveis de pAKT na hiperplasia e lesões neoplásicas do

R26-AKT1

E17K

camundongos infectados com Ad-Cre em comparação com os pulmões de camundongos não infectados (Fig 4A -4C).

pAKT imunocoloração dos tecidos pulmonares dos

R26-AKT1

E17K

ratinhos tratados apenas com solvente (A) ou infectadas com Ad-Cre depois 9 e 18 meses de infecção, respectivamente (B, C).

em conclusão, parece que a AKT1 mutante

E17K alelo induz hiperplasia moderada dos brônquios e /ou bronquíolos terminais que, a longo prazo e em baixa frequência, pode evoluir para carcinoma evidente.

Mutant AKT1

E17K coopera com agentes cancerígenos químicos

Em células humanas, AKT1

E17K promove a proliferação e migração quando expresso em células brônquicas imortalizadas pela adeno 12 /SV0 vírus híbrido [30]. Para investigar se a mutações AKT1 são capazes de cooperar com outros sucessos oncogênicos também

in vivo

, fizemos uso de carbamato de etila (uretano), um composto químico presente na fumaça que tem sido amplamente utilizado para modelar experimentalmente carcinogênese pulmonar de múltiplos estágios [41].

R26 ou R26-AKT1

E17K

ninhada ou foram infectadas com Ad-Cre (10

6-10

7 UFP) ou tratados por veículo sozinho antes de ser exposto a uretana (1 mg /g) e analisados ​​após 6 ou 9 meses. Multiplicidade e tamanho dos tumores /pulmão foram encontrados para ser significativamente maior em

R26-AKT1

E17K

camundongos infectados com Ad-Cre. Sendo relativamente resistentes à uretano,

R26-AKT1

E17K

ratos que não tinham sido previamente expostos a Ad-Cre desenvolveu nódulos em 1 de 6 ratinhos em 6 meses e em 1 de 4 ratinhos em 9 meses após a administração de uretano, respectivamente (Figura 5A). Por outro lado, quase todos os

R26-AKT1

E17K

ratos que tinham sido infectadas com Ad-Cre antes da administração de uretano, apresentou nódulos pulmonares tanto após 6 (n = 4) e 9 (n = 6) meses de tratamento. O número médio de tumores desenvolvidos pelos ratos mutantes tratados com uretano e infectadas com Ad-Cre foi de 3 /rato em 6 meses e 7 /rato em 9 meses; Por outro lado, os ratos tratados apenas com uretano desenvolvido 0,15 tumor /rato em 6 meses e de 1,6 tumores /rato em 9 meses (Fig 5A). Notavelmente, o tamanho dos tumores desenvolvidos pelos murganhos mutantes após infecção com o Ad-Cre foi dependente da dose de Ad-Cre administrado (Fig 5B).

. Lung multiplicidade de tumores no

R26-AKT1

E17K

infectadas com Ad-Cre (6 e 9 meses após o tratamento, respectivamente). Cada ponto representa um rato; barras representam médias ± DP. ** P 0,01, * p 0,05. B. Diâmetro de tumores pulmonares gerados por uretano em

R26-AKT1

E17K

ratos tratados com doses crescentes de Ad-Cre. As barras representam diâmetro de tumor ± SD dizer. * P 0,05. C, D. Representante H E coloração de lesões pulmonares desenvolvidas no

R26-AKT1

E17K

ratos tratados com solvente ou Ad-Cre, como indicado, 9 meses após a administração de uretano . E, coloração F. Phosporylated AKT de lesões pulmonares desenvolvidas no

R26-AKT1

E17K

ratos tratados com solvente ou Ad-Cre, como indicado, 9 meses após a administração de uretano. Ampliação como indicado.

Os tumores gerados por uretano no

AKT1

E17K

fundo foram diagnosticados como bronco-alveolar adenomas /adenocarcinomas que apresentaram maior frequência padrão papilar (Fig 5C e 5D). Uma observação final foi que, ao contrário de tumores gerados em camundongos de controle que demonstraram coloração pouco ou moderada para pAKT, aqueles gerados em

R26-AKT1

E17K

ratos apresentaram um aumento acentuado na pAKT coloração (Figura 5E e 5F). Por fim, analisamos

Kras

estatuto nos ratinhos tratados com uretano. O DNA foi extraído a partir de tumores embebidos em parafina fixados com formalina microdissecadas de ratinhos tratados com uretano seleccionados (2 ratos tratados apenas com uretano e 4 ratos tratados com uretano mais Ad-CRE). A região que abrange códon 61 no exão 3 de

gene Kras

foi amplificado e submetido a sequenciamento de DNA Sanger. A análise da sequência de tumores demonstraram a presença de um A G no codão de transição 61 que conduz à substituição Q61 com R. Ver Fig S4 para cromatogramas representativos. Estes resultados indicam que AKT1

E17K pode cooperar com os eventos oncogênicos induzidas por uretano no pulmão do rato (ou seja,

Kras

ganho de mutações de função), acelerando assim a progressão para tumores evidentes.

Em o mouse, as células de Clara linha epitélio bronquiolar e expressar a proteína associada às células Clara 10 (CC10) enquanto o tipo alveolar II células (AT2) residem nos alvéolos e expressar a proteína C surfactante (SPC) [42-44].

Portanto, para caracterizar as células que constituem as lesões pulmonares induzidas por AKT1

E17K no rato, foi realizada imunofluorescência indireta para SP-C e CC10 em secções de pulmão FFPE derivados de

R26-AKT1