Abstract
O nosso estudo-piloto utilizando matrizes de miRNA descobriu que miRNA-29c (miR-29c) é diferencialmente expressos no cancro do pulmão linha de células 95C low-metastático emparelhado comparação com a linha de células de câncer de pulmão metastático alta 95D. A análise mostra que Bioinformatics integrina β1 e matriz metaloproteinase 2 (MMP2) poderia ser genes alvo importantes do miR-29c. Portanto, a hipótese de que o miR-29c suprime a adesão de células de câncer de pulmão a matriz extracelular (ECM) e metástase alvejando integrina β1 e MMP2. Os estudos de ganho-de-função que levantadas expressão de miR-29C 95D em células usando seus imita mostraram reduções na proliferação celular, adesão a ECM, a invasão e a migração. Em contraste, os estudos de perda de função, que reduziu o miR-29c utilizando o seu inibidor em células 95C promoveu a proliferação, a adesão à ECM, invasão e migração. Além disso, o ensaio de repórter de luciferase dupla demonstrado que o miR-29c inibiu a expressão do gene de luciferase contendo o extremo 3 ‘UTRs de integrina β1 e ARNm de MMP2. Western blotting indicaram que o miR-29c regulada negativamente a expressão da integrina β1 e MMP2 ao nível da proteína. análise zimografia ainda confirmado que o miR-29c diminuição da actividade da enzima MMP2. camundongos nu com modelos de xenotransplante de células de câncer de pulmão confirmou que miR-29c inibiu a metástase do câncer pulmonar in vivo, incluindo ossos e metástase hepática. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que o miR-29c funciona como um supressor de metástases de tumor, o que suprime a adesão de células de cancro de pulmão de ECM e metástases através da inibição directa da integrina β1 e expressão de MMP2 e reduzindo ainda mais a actividade da enzima MMP2. Os resultados mostram que o miR-29c pode ser um alvo candidato terapêutica para retardar metástases de cancro do pulmão
citação:. Wang H, Zhu Y, Zhao M, Wu C, Zhang P, G Tang, et ai. (2013) miRNA-29c Suprime Lung Cancer adesão celular a Matriz Extracelular e metástase alvejando β1 integrinas e Matrix Metalloproteinase2 (MMP2). PLoS ONE 8 (8): e70192. doi: 10.1371 /journal.pone.0070192
editor: Edward F. Plow, Lerner Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de abril de 2013; Aceito: 17 de junho de 2013; Publicação: 06 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por em parte por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 30.800.631, No. 30.872.553 e nº 81.272.433) e uma bolsa da Ciência e Tecnologia Comitê de Shanghai (nº 09411964800). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Hoje, o câncer de pulmão é um dos cânceres mais comuns. Mais de 90% dos doentes com cancro do pulmão de morrer em vez de metástases a partir dos tumores primários, sugerindo que a metástase é um factor de prognóstico tecla [1], [2]. a progressão do tumor e a metástase é um processo complexo envolvendo muitos jogadores biológicas diferentes. Um dos reguladores críticos que a envolvida no presente processo é um microRNA (miARN) [3].
miARNs maduro são curtos, de cadeia simples, endógena e não codificadora ARN que consiste em cerca de 22 nucleótidos, que regulam genes ao nível pós-transcricional durante o processo de tradução. Eles podem alvejar a 3′-UTR (regiões não traduzidas) do mRNA, o que conduz funcionalmente a uma inibição de translação ou desregulação do alvo ARNm [4]. miARNs tem uma grande influência sobre vários processos biológicos, incluindo a diferenciação celular, proliferação, apoptose, resistência à tensão, o metabolismo da gordura, e desenvolvimento. Portanto, elas desempenham um papel crucial em diferentes doenças, incluindo o cancro [3]. Além disso pesquisas indicam que cerca de miARN pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumores. MiRNAs desempenham um importante papel na tumorigénese e na progressão tumoral, incluindo a proliferação e metástase [3], [5] – [8]. Por exemplo, o miR-10b promove a metástase do tumor da mama, enquanto que o miR-335 e miR-126 suprimir a metástase [9], [10]. Portanto, a próxima geração de alvos terapêuticos para tumores malignos pode ser miRNAs [11].
A família miR-29 é uma família conservada de miRNAs, incluindo miR-29a, miR-29b, miR-29c, e miR -29d. Recentemente, os níveis de diversos membros da família de miR-29 de expressão foram encontrados para ser reduzida numa variedade de cancros. Por exemplo, Sengupta e seus colegas mostraram que miR-29c é regulada em carcinoma de nasofaringe [12], enquanto Fabbri e seus colegas descobriram que a família miR-29, incluindo miR-29c, tem como alvo DNMT3A e DNMT3B em tecidos de câncer de pulmão e as células [13].
no presente estudo, o nosso estudo piloto anterior encontrados uma expressão quase quadruplicou diferencial de miR-29c entre alto (95D) e baixa-metastático (95C) linhas celulares de cancro (detalhes em tabela S1). Vários estudos têm aproveitado esta diferença entre as linhas de células individuais em relação à invasão e metástase [14], [15]. No entanto, o papel de miR-29c no cancro do pulmão tem ainda que ser completamente exploradas e a maior parte de sua função biológica global continua a ser desconhecido. Aqui, mostramos evidências de que funções miR-29C como um supressor de metástase que inibe a adesão de células do cancro do pulmão de ECM e migração
in vitro
, e suprime a célula cancerosa metástases à distância
in vivo
. Nós ainda confirmado que o miR-29c pode regular negativamente diretamente β1 integrina e expressão MMP2, visando a “-untranslation sequência 3, inibir os níveis de proteína de integrina β1 e MMP2, e reduzir a actividade da enzima MMP2. Os resultados mostram que miR-29c pode ser um novo alvo terapêutico ou candidato estratégia para tentar controlar a metástase do câncer de pulmão.
Materiais e Métodos
Ética
Todos os experimentos com animais foram realizado utilizando camundongos nu feminino (6-7 semanas de idade). Os ratos foram adquiridos a partir do animal Ltd. SLAC Laboratory, Co. (Shanghai, China) e tratados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos protocolo experimental animal foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade de Tongji (IACUC No. 1201).
linhas de células e cultura de células
O emparelhado 95C low-metastático e high-metastático linhas de células 95D foram subclonados a partir de uma linha de baixa diferenciada grande humano pulmão de células de células de carcinoma PLA-801. As células foram bem autenticado e publicada por vários grupos de investigação [14], [15]. As células foram gentilmente cedidas pelo Professor Ying-Lin Lu, Departamento de Patobiologia, Instituto de Ciências Médicas Básicas, Academia de Ciências Médicas Militares, Beijing, China, em dezembro 5,2009. Tal como descrito a 95C e 95D células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) com 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina e soro de vitelo bovino a 10%, e cultivada a 37 ° C em atmosfera com 5% de CO
2. As células foram utilizadas para estudos funcionais no prazo de 6 meses após Thawn do tanque de nitrogênio líquido.
MicroRNAs matriz e análise de qRT-PCR
Depois de realizar um ensaio de migração simples para a tela de alta e células low-metastáticos , foi realizado um ensaio transpoço como um índice de Matrigel invasão
in vivo
usando não-invasivo 95C células na câmara superior do não-revestido Transwell insere (24 cavidades de inserção; tamanho de poro de 8 um; Corning, EUA) e 95D células na parte inferior usando um Matrigel (50 ug /ml) revestido Transwell inserir para amplificar a expressão diferencial de miARN. Então miRNAs expressão diferencial entre 95C e 95D foi medido utilizando uma matriz de miR human_01_H10.1_080277 miRNA (Ciências LC Houston, EUA). Todos os dados foram depositados em Gene Expression Omnibus (GEO). O número de acesso é GSE47788. Os miARNs medidos com uma diferença estatística (
P
0,01). Foram considerados significativamente expresso diferencialmente
quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada para medir os níveis de expressão de 95C e 95D células. O ARN total a partir do tipo selvagem 95C e 95D foram isolados utilizando Trizol reagente (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (50 ng) foi transcritos de modo inverso com o miR-29C iniciadores de haste-laçada ou iniciadores RT RT U6 (Xangai prolongado Nature Biotech Co., Ltd), utilizando um Kit ™ RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante para formar ADNc. PCR em tempo real foi realizado utilizando um kit SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara, Japão) com miR-29c ou iniciadores de PCR U6 (Xangai prolongado Nature Biotech Co., Ltd). As reacções foram realizadas utilizando um Real-Time PCR System ABI7500 (Applied Biosystems). Todos os dados de cada amostra foram recolhidos em triplicado e avaliada usando 2
-ΔΔCt análise quantitativa relativa.
Ganho de função e perda de função de miR-29c
A ganho de função de ensaio por imita o miR-29c e o ensaio de perda de função de inibidor de miR-29c
in vitro
foram realizadas por transfecção de células usando o método abaixo mencionado. sequências de oligonucleótidos de imita miR-29C, inibidor e seu controle negativo são:
imita miR-29C (29C):
Sense: 5′- UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 ‘,
Anti-sentido: 5′- UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 ‘;
imita miR-29C controle negativo (MiNC):
Sense: 5′- UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′,
Anti-sentido: 5′- UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘;
inibidor de miR-29c (29ci): 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′
miR-29c controle negativo inibidor (IhNC): 5′- UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘.
Todos estes oligonucleotídeos foram chemosynthesized de Extended Nature Biotech, Xangai.
transfecção celular
As células 95C ou 95D foram cultivadas a cerca de 80 % de confluência em placas de 6 poços e foram transfectadas, com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células em cada poço de uma placa de 6 poços foram transfectadas com 100 imita nM ou 200 nM de inibidor. 24-48 horas após a transfecção, as células foram colhidas para experiências adicionais, incluindo a proliferação, a adesão, migração e invasão.
ensaios de proliferação celular
A proliferação das células transfectadas foram avaliados por MTT ensaio. Cerca de 2 × 103 células foram semeadas numa placa de 96 poços com 100 ul de meio, em cada poço. Após 24 h, 48 h 72 h e 96 h, 20 pi de MTT (5 mg /ml) foi adicionado em uma placa de 96 poços e incubou-se durante 4 h antes da leitura a 530 nm num leitor de placas. Todas as experiências independentes foram executadas em triplicado.
A adesão celular a ensaios de matriz extracelular (ECM)
A adesão celular transfectada de Matrigel foram avaliadas pelo ensaio de MTT e contagem. No ensaio MTT, as placas de 96 poços foram pré-revestidos com 40 ul de 50 ug /ml de Matrigel (BD Biosciences, EUA) e, em seguida, 1 × 104 células foram plaqueadas em cada poço numa placa de 96 poços com 100 meio de ul e as células foram incubadas a 37 ° C durante 2 h. Em seguida foi realizado o ensaio de MTT descrito anteriormente após três vezes lavagem para retirar as células não aderentes com PBS. No ensaio de contagem, a 95D e 95C células foram transfectadas com lentivírus de NF-CMV-GFP-LV (Xangai Genechem) para expressar estavelmente o gene da GFP. As células 95D-GFP e 95C-GFP foram transfectadas com 100 imita nm ou 200 inibidor nM, respectivamente, tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em 1 x PBS, e em seguida, 1 × 104 células with100 forma ul foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços placa pré-revestidas com 40 ul de 50 ug /ml de Matrigel e as células foram incubadas a 37 ° C durante 30 min.The células não aderentes foram lavadas 3 vezes com PBS, e o número de células que aderem a Matrigel foram contadas sob um microscópio invertido (Olympus Corp. Tokyo, Japão) a 100 vezes a partir de 3 campos verdes selecionados aleatoriamente em cada poço. As experiências independentes foram corridos em três vezes.
A migração celular e ensaios de invasão
O potencial para a migração e a invasão de células transfectadas foram avaliados por um ensaio Transwell. No ensaio de migração, 2,5 × 104 células foram cultivadas em 200 ul de meio com soro de vitelo de bovino a 1% na câmara superior de uma pastilha não-revestido Transwell. Na câmara inferior, 600 ul meio com soro de vitelo de bovino a 10% foi utilizado como um quimio-atractor para estimular a migração de células. No ensaio de invasão, a câmara superior das inserções Transwell foram revestidas com 50 ul de 2,0 mg /ml de Matrigel, e 5 × 104 células foram plaqueadas na câmara superior do inserto Transwell Matrigel-revestido. As células de ambos os ensaios foram incubados durante 24 h e as células que não migraram foram removidos ou invadem utilizando um cotonete. Todas as células foram coradas utilizando coloração violeta cristal e contadas sob um microscópio invertido. Foram selecionados quatro pontos de vista aleatórios para contar as células e os experimentos independentes foram repetidas três vezes.
Determinação de miR-29c sequências de direccionamento por previsão computacional
previsão Computacional já foi provado ser uma forma eficaz e um método eficaz na predição de alvos de miRNA. Usamos TargetScan, PicTar e Miranda para prever o miR-29c sequências de direccionamento. Alvos que foram previstas pelas três bases de dados e foram relacionadas com a invasão tumoral e metástases eram considerados relevantes para a nossa investigação.
ensaio de luciferase dupla para determinar os efeitos das sequências alvo da região 3′-UTR de integrina β1 e MMP2
o fragmento 3′-UTR das β1 integrina e genes MMP2, incluindo o local de ligação de miR-29C, foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico de células 95D, utilizando os seguintes iniciadores. iniciadores de PCR para β1 integrina foram:
Intβ1-
Sal
I-UTR1, 5′-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘(para a frente),
Intβ1-
Mlu
I-UTR2, 5′-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 ‘(reverso)
iniciadores de PCR para MMP2 foram:.
MMP2-
Mlu
I-UTR1, 5′ -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 ‘(para a frente), MMP2-
Hind
III-UTR2, 5′-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3′ (reverso).
O β1 integrina e MMP2 mutante gene 3′-UTR fragmento que contém o sítio de ligação de miR-29c foi amplificado a partir do fragmento 3′-UTR utilizando os seguintes iniciadores para a integrina β1 por Intβ1-
Sal I-
UTR1 + Intβ1-
Mlu I-
mut
-UTR3 (5′-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 ‘) e para MMP2 por MMP2-
Mlu I-UTR1 + MMP2-
Hind
III
em> -mut -.
UTR (5′-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 ‘) (bases sublinhadas mostram o local de mutação)
o fragmento amplificado foi clonado no vector de luciferase PMIR-REPORT (Ambion, EUA) no
Sal
I +
Mlu
I
e Mlu
I +
Hind local
III para a integrina β1 e MMP2, respectivamente.
O 95C ou 95D As células foram co-transfectadas em placas de 24 poços contendo 200 ng de vector de pirilampo luciferase, 40 ng
Renilla luciferase
vector pRL-TK (Promega, EUA) e 100 imita nm ou 200 nM de inibidor. Firefly luciferase agiu como um gene repórter e
Renilla
luciferase como controlo normalizado. As células transfectadas foram incubadas durante 48 h. A actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, EUA).
Western blotting
Para o isolamento de proteínas totais, tratados e as células de controlo foram lavadas com 1 x PBS, lisadas com tampão RIPA (50 m mole /L de Tris-base, 150 m mol /L de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 1 m mol /L de ortovanadato de sódio, 10 m mol /L de sódio fluoreto, 1% de mistura de inibidores de protease) durante 15-20 min em gelo. Após centrifugação a 12.000 rpm durante 15 min, os sobrenadantes foram recolhidos. e a concentração de proteína foi quantificado pelo ensaio de proteína BCA. 20-30 ug de proteínas totais foram dissolvidos em tampão de carga de SDS-PAGE, aquecida a 100 ° C durante 5 min, separados em gel de poliacrilamida a 10%, transferidos para membranas de nitrocelulose (Amersham Biosciences). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite magro em tampão TBST (Tris Buffer de solução salina contendo 0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente, e subsequentemente incubadas durante a noite a 4 ° C por os anticorpos primários apropriadamente diluído para monoclonal de coelho anti β1 -sangue humano integrina e MMP2 (diluído 1:1000; Cell Signaling Technology). Após lavagem extensiva com tampão de TBST, as manchas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente. Após extensa lavagem com tampão TBST, proteínas alvo foram detectados por quimioluminescência aumentada reagentes ECL.
Gelatina zimografia da atividade da enzima MMP2
Este experimento procurou detectar MMP2 específico ea actividade enzimática MMP9. Os meios de comunicação sem o soro coletado do 95C transfectadas e 95D células após 24 horas foram analisados utilizando um kit de ensaio zimografia (Applygen, China). actividade de MMP foi medido por SDS-PAGE sob condições não redutoras. O gel continha 1% de gelatina e 30% de acrilamida. A electroforese foi realizada a 4 ° C. Após lavagem com o tampão A (contendo 2% de Triton X-100) a partir do kit, o gel foi incubado em 37 ° C com o tampão B (contendo o ião metálico necessário: 5 mmol /CaCl
2, 1 umol /L ZnCl
2). atividade de MMP foi visualizado por coloração com Coommasie Blue R-250.
In vivo ensaios de metástase em modelo de xenoenxerto de murganhos nus
O 95D e 95C células foram transfectadas com lentivírus de U6-RNAi- (Ubi ) -Luc-LV (Shanghai Genechem) para expressar estavelmente a luciferase de vaga-lume em células de câncer de pulmão. As células 95D-Luc e 95C-luc foram transfectadas com 100 imita nM ou 200 nM de inibidor, respectivamente, tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em 1 x PBS e ressuspensas a uma concentração de 1-5 x 10
6 células /ml em frio 1 × PBS. ratinhos nus fêmea (6-7 semanas de idade) foram anestesiados por injecção intraperitoneal de cetamina (90-110 mg /kg) e xilazina (10 mg /kg), antes das injecções intracardíaca e foram colocados em posição supina. Com uma agulha de calibre 25, 2-3 × 10
5 células foram injectadas no ventrículo esquerdo (volume 0,1 ml) após a visualização do fluxo de sangue arterial para a seringa. Após a injecção, os ratos foram colocados em gaiolas de aquecimento para recuperar da anestesia. Os animais injectados com células foram alojados em condições estéreis em instalação experimental animal da Universidade de Tongji (Xangai, China).
Para o
in vivo
ensaio de metástase, a metástase do câncer de pulmão foi monitorada na animais vivos por imagem de bioluminescência (BLI), utilizando um LB 983 sistema de imagem in-vivo (Berthold) a partir de 3-4 semanas após a implantação. Quinze minutos antes de
In vivo
BLI, os animais foram anestesiados com 1-3% de isoflurano e injectados intraperitonealmente com D-luciferina (150 mg /kg em 1 x PBS). As experiências foram realizadas utilizando 5 ou 6 ratos por grupo e repetido três vezes. O desenvolvimento de metástases ósseas foi monitorizada por meio de radiografia de raios-X durante 6-8 semanas após a injecção. Os ratinhos foram anestesiados, colocado em uma placa transparente em posições prona e lateral, exposta aos raios-X a 30 kV e 10 mA durante 0,5 s em uma radiografia Sistema Fixitron MX-20 no Instituto de traumatologia Ortopedia, Shanghai Academia de Medicina Tradicional Chinesa.
A análise estatística
valores quantitativos foram apresentados como média ± SEM. O Student
t
e χ
2 foram realizados testes para comparar os dados correspondentes. Diferenças com
P
. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
miR-29c é regulada em células de câncer de pulmão high-metastáticos
neste estudo, a 95C e 95D linhas celulares foram selecionadas porque originou-se do mesmo indivíduo e há uma diferença dramática em seu comportamento metastático. Para identificar a expressão diferencial de miARNs entre 95C e 95D células. Primeiro, um rastreio primário foi realizada usando um ensaio de invasão transpoço simples Matrigel antes matriz miRNA. Encontramos uma expressão diferencial significativa de miRNAs entre 95C e 95D células usando matriz de miRNA (detalhes na Tabela S1). Para estudar o possível papel dos miRNAs que inibem a metástase de células de câncer de pulmão e potenciais candidatos como alvo genes, nós nos concentramos em miR-29c porque é regulada em células de alta-metastático 95D e up-regulada em células de baixa metastático 95C. A descoberta pode implicar função miR-29c como um supressor de metástases de tumores. Os dados de qRT-PCR confirmou adicionalmente os diferentes níveis de expressão de miR-29c entre 95C e 95D células. Este resultado é consistente com os resultados de matriz de miARN. (MiR-29c mostrou 3,8 vezes vezes superior em 95 ° C do que 95D a partir da Figura 1A).
qRT-PCR de miR-29C em células 95D e 95C linhas (A). Mudança foi calculado usando 2
-ΔΔCt análise quantitativa relativa; **
p Art 0,01 (Student
t
-teste). As experiências foram repetidas pelo menos três vezes (n = 3). (B) o miR-29c inibe a proliferação celular em células 95D por ensaio MTT. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (C) inibidor de miR-29c aumento da proliferação celular em 95c células por ensaio MTT. **
p
. 0,01 (Student
t
-teste, n = 3)
miR-29c suprime a proliferação de células em células 95D
Para determinar se o miR-29c suprime a proliferação de células de cancro do pulmão, imita o miR-29C (mIR-29C) e imita controlo negativo (MiNC) foram transfectados em 95D células, enquanto inibidor de miR-29C (29ci) e inibidor de controlo negativo ( IhNC) foram transfectados em células 95c. ensaios MTT foram realizados para medir a proliferação celular. Os resultados (Figura 1B) sugerem que o miR-29c tem um efeito inibitório sobre a proliferação de células 95D. Não houve diferença às 24 h na proliferação de células 95D entre os grupos MiNC miR-29c e (
P
0,05). No entanto, houve uma diferença significativa entre os dois grupos após 48 h, 72 h e 96 h de incubação (
p Art 0,01). As eficiências de inibição foi de 37,5%, 54,4% e 40,3% (Figura. 1B), respectivamente. Portanto, a inibição de miR-29c da proliferação de células 95D é um processo dependente do tempo.
95C células transfectadas com o inibidor de miR-29C (miR-29ci), a proliferação aumentou de um modo dependente do tempo. As taxas de proliferação entre os grupos de miR-29ci e IhNC não variou (
P
0,05) no ponto de 24 horas de incubação. No entanto, houve uma estatisticamente significativa entre os dois grupos após 48 h, 72 h e 96 h de incubação com taxas de proliferação de 15,2%, 13,7% e 10,4% (Figura 1C,
P
0,01), respectivamente. Portanto, miR-29c promoveu a proliferação de células 95C de um modo dependente do tempo.
miR-29c inibe a adesão celular a ECM in vitro
Adesão ao ECM é um passo fundamental quando as células cancerosas plantar-se em locais distantes durante a metástase. Matrigel contendo os componentes de membrana basal pode simular a adesão celular
in vitro.
Nós levou vantagem desta propriedade e realizado um ensaio de adesão. Em 95D células transfectadas com imita o miR-29C (MIR-29C) e imita controlo negativo (MiNC), o número de células que aderem à Matrigel diminuiu significativamente (
P
0,01, Figura 2 A-C ) após a transfecção do miR-29C em comparação com as transfectadas com MiNC. No entanto, em 95c células transfectadas com o inibidor de miR-29C (29ci) e inibidor de controlo negativo (IhNC), inibidor de miR-29C aumentou significativamente 95C adesão a matrigel quando as células transfectadas com o inibidor de miR-29C em comparação com as transfectadas com IhNC (
P
0,01, Figura 2 D-F). Estes resultados indicam que o miR-29c pode diminuir o número de células de adesão nas metástases de alta 95D células, enquanto que a inibição de miR-29c pode aumento da adesão celular em células metastáticas de baixa 95C (Figura 2).
( a) 95D células transfectadas com imita o miR-29C adesão ao Matrigel foi medida por contagem como descrito em Materiais e Métodos. campos representativos de 95D 29C e 95D MiNC (ampliação x 100). (B) o número de células média de adesão por campo aleatório. **
P Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (C) o miR-29c inibe a adesão de células 95D (ensaio MTT). **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (D) Campos representativos de 95D 29ci e 95C células de câncer de pulmão IhNC (ampliação x 100). (E) número de células média de adesão por campo aleatório. **
P Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (F) Supressão de miR-29c adesão celular reforçada em 95C células (MTT). **
p
. 0,01 (Student
t
-teste, n = 3)
miR-29c inibe a invasão e migração celular in vitro
ensaio Transwell é amplamente utilizado para medir o comportamento celular durante a migração e invasão, passos-chave na metástase do tumor. Montamos uma membrana Matrigel ou o próprio Transwell com um quimio-atrativo para simular a invasão de células e comportamento de migração
in vitro
. Em 95D células após miR-29c e MiNC transfecção, uma diferença significativa visível foi visto com menos-29C miR células transfectadas contados do que as células MiNC transfectadas (número de células reduziu 104,2% no ensaio de migração e 136% no ensaio de invasão,
p
0,01). Este achado pode indicar que a regulação positiva de miR-29c inibe a invasão de células e de migração (Figura 3A e B). Em contraste, a transfecção de 95C células com inibidor de miR-29c e IhNC mostrou um resultado oposto; inibidores de células transfectadas mais miR-29C passados através do Matrigel e na membrana Transwell (número de células aumentou cerca de 79,7% no ensaio de migração e de 97,4% no ensaio de invasão,
P
0,01) em comparação com as células 95c transefected com IhNC (Figura 3 C e D). Estes dados mostram que o miR-29c influenciado invasão celular e comportamento de migração
In vitro
.
(a) num ensaio de invasão de Matrigel, imita o miR-29C transfectadas células 95D vs MiNC transfectadas células numa 200 × âmbito luz após coloração violeta cristal. (B) a invasão de Matrigel e Transwell migração: 95D células foram contadas num alcance de luz em quatro vistas aleatórios. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 4). (C) Num ensaio de invasão de Matrigel, inibidor de miR-29c 95c células transfectadas versus células transfectadas IhNC num alcance de 200 × luz após coloração com cristal de violeta. (D) a invasão de Matrigel e migração Transwell: 95C células foram contadas num alcance de luz em quatro vistas aleatórios. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 4)
miR-29c atinge diretamente 3′-UTR da integrina. β1 e o gene MMP2
Para explorar melhor os mecanismos pelos quais o miR-29c suprime a invasão de células do cancro do pulmão e metástase, analisou-se os genes relacionados com a metástase de tumor jusante prováveis. previsão computacional foi usado para descobrir o gene alvo mais provável. Nós levou vantagem de os bancos de dados TargetScan, PicTar e Miranda de alvos de microRNA previstos para analisar taregets de miR-29c. Os 3′-UTRs de integrina β1 (Intβ1) e MMP2 suportar locais de ligação-29C miR. 3′-UTR de integrina β1 e MMP-2 de miR-ligação locais de 29C tem sequências altamente conservativas em mamíferos (Figura 4A e D). Os estudos sobre as funções putativas de miR-29c na adesão celular e invasão nos encorajou a mais investigação sobre β1 integrina e MMP2.
(A) segmentação conservado de 3′-UTR do β1 humano int por miR- 29c (sublinhado). A de tipo selvagem e mutantes de sequências de int β1 3′-UTR são listados para comparação. (B) ensaio de repórter de luciferase dupla para o gene alvo β1 int 95D em células transfectadas com imita o miR-29C. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (C) ensaio de repórter de luciferase dupla para gene alvo em 95C β1 int células com ou sem inibidores de transfecção de miR-29C. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). locais na região de MMP2 3’UTR de ligação (D) miR-29c (sublinhado); local de ligação está altamente conservada em vertebrados, incluindo humanos. As sequências de tipo selvagem e mutantes de MMP2 3’UTR estão listados para comparação. (E) ensaio de repórter de luciferase dupla de ARNm 95D MMP2 em células transfectadas com imita o miR-29C. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3). (M) Ensaio de repórter de luciferase dupla de ARNm em MMP2 95c células com ou sem inibidores de transfecção de miR-29C. **
p Art 0,01 (Student
t
-teste, n = 3)
Para determinar se integrina β1 e MMP2 são suprimidas por miR-. 29c através da ligação ao seu ARNm 3′-UTR, foi realizado um ensaio de luciferase dupla para verificar a relação entre o gene alvo dois e miR-29c. A de tipo selvagem e mutante β1 integrina 2 e MMP ARNm 3’UTR foram inseridos na região a jusante de um gene repórter da luciferase a partir do vector PMIR-RELATÓRIO, e nomeadamente a integrina β1 3′-UTR vector do tipo selvagem, MMP 2 3 ‘-UTR vector, vector mutante integrina β1 3′-UTR e MMP2 mutante 3’-UTR vector, respectivamente. Utilizou-se o vector de luciferase PMIR-relatório como um controle uma vez que não seria influenciada por qualquer imita o miR-29C ou inibidor, e pode também actuar como um controlo padrão para eficácia de transfecção. Por conseguinte,
Renilla luciferase
vector (vector pRL-TK) e do vector luciferase do pirilampo foram co-transfectadas com imita ou inibidor. Em células 95D com imita o miR-29C, a actividade de luciferase de tipo selvagem e o vector de integrina β1 MMP2 proporção relativa foi inibida cerca de 2,00 vezes em comparação com o controlo (Figura 4 B e C,
P
0,01) . Embora a integrina β1 mutante e o vector de MMP2 em 95D células mostrou uma actividade de luciferase mais baixo do que o controlo, não havia nenhuma diferença significativa (
P
0,05). Em 95c células, inibição de miR-29c tem aumento β1 integrina e actividade de MMP2 luciferase (Figura 4 E e F
P
0,01) em comparação com células que não foram estimuladas com inibidor de miR-29c, devido à β1 integrina e a actividade da luciferase de MMP2 vector, que foi inibida por endógeno miR-29c. Da mesma forma, β1 integrina mutantes e MMP2 em 95c células não mostrou nenhuma reacção significativa com o controlo (
P
0,05). Aparentemente, o miR-29c alvo β1 integrina e MMP2 directamente desde que o ganho-de-função de miR-29c em 95D células diminuiu significativamente a actividade de luciferase β1 integrina e o vector de MMP2, e perda de função de inibidor de miR-29C em 95C células mostraram integrina que β1 e MMP2 mantém o seu nível de expressão apenas quando as células não são expostos a inibidor de miR-29c (Figura 4).
miR-29c inibe a expressão da proteína endógena do β1 integrina e MMP2
Para investigar ainda mais os efeitos de miR-29c na integrina β1 e proteína MMP2 expressão por Western blotting. Em 95D células transfectadas com imita o miR-29C, a expressão da integrina β1 e MMP2 nos níveis de proteína foram significativamente menos do que a do controlo negativo de células transfectadas com MiNC (Figura 5,
P
0,01) . Em 95c células, em comparação com células transfectadas com IhNC, os resultados de transferência de Western indicou β1 integrina e expressão de MMP2 preotein foram upregulated depois transfectadas com o inibidor de miR-29C em 95C (Figura 5,
P
0,01). Estes dados mostram β1 integrina e MMP2 são alvos diretos de miR-29.
(A) Efeitos de miR-29c sobre integrina endógena β1 proteína.