Abstract

ligando Apo2 (Apo2L) /fator de necrose tumoral relacionada com a indução de apoptose ligante (TRAIL) é um promissor cancro do agente terapêutico. Recombinante de Apo2L /TRAIL humano tem estado sob ensaios clínicos, ao passo que vários tipos de tumores malignos têm resistência a Apo2L /TRAIL. Nós e outros autores mostraram que vários agentes anticancerígenos e flavonóides superar a resistência a Apo2L /TRAIL por regulação positiva do receptor de morte 5 (DR5) em células de tumores malignos. No entanto, os mecanismos pelos quais estes compostos induzem a expressão de DR5 permanecem desconhecidos. Aqui, mostramos que a apigenina flavonóide dietético se liga e inibe a translocase 2-adenina de nucleótidos (ANT2), resultando em aumento de Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela regulação positiva de DR5. A apigenina e genisteína, que são os principais flavonóides, reforçada Apo2L /apoptose induzida por TRAIL em células cancerosas. Apigenina induzida expressão DR5, mas genisteína não o fez. Utilizando o nosso método de identificar os alvos directos de flavonóides, foram comparadas as proteínas de ligação de apigenina com aqueles de genisteína. Descobrimos que ANT2 foi alvo de apigenina, mas não genisteína. Da mesma forma que a apigenina, knockdown de ANT2 reforçada Apo2L /apoptose induzida por TRAIL por upregulating expressão DR5 ao nível pós-transcricional. Além disso, o silenciamento de ANT2 atenuou o aumento da Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela apigenina. Estes resultados sugerem que a apigenina regula positivamente a DR5 e aumenta a Apo2L /TRAIL a apoptose induzida por ligando e inibindo ANT2. Propomos que os inibidores Ant2 pode contribuir para a terapia de Apo2L /TRAIL

Citation:. Oishi M, Iizumi Y, Taniguchi T, Goi W, Miki T, Sakai T (2013) Células apigenina sensibiliza do cancro da próstata para Apo2L /TRAIL ao direcionar nucleotídeo adenina translocase-2. PLoS ONE 8 (2): e55922. doi: 10.1371 /journal.pone.0055922

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de outubro de 2012; Aceito: 03 de janeiro de 2013; Publicação: 19 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Oishi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Grant-in-Aid para Jovens cientistas (Start-up, 21890223) e (a, 20.533.178) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o segundo câncer comumente diagnosticado ea sexta maior causa de morte relacionada ao câncer do sexo masculino no mundo [1]. Embora a terapia de retirada de androgénio é eficaz no tratamento do cancro da próstata avançado, a maioria dos pacientes exibem resistência a esta terapia [2]. Foi relatado que o docetaxel e prednisona foi eficaz para o cancro da próstata refractário a hormonas [3]. No entanto, o resultado deste tratamento é ainda insuficiente [4]. Portanto, são necessárias novas estratégias para o tratamento de câncer de próstata hormônio-refratário.

necrose ligando Apo2 (Apo2L) /tumor apoptose ligando indutor (TRAIL) é uma citocina que pertence à família do factor de necrose tumoral relacionada fator. Apo2L /TRAIL se liga a receptor de morte 4 (DR4) e de receptor de morte 5 (DR5) e induz a apoptose selectivamente em vários tumores malignos, mas não nas células normais [5], [6]. Recentemente, vários recombinantes de Apo2L /TRAIL humano e anticorpos anti-DR5 agonistas foram desenvolvidos, e clínicos de Fase I /II dos ensaios foram realizados em pacientes com muitos tipos de tumores malignos [7]. No entanto, um número de tumores exibem resistência a Apo2L /TRAIL e superar essa resistência é essencial para a quimioterapia usando a via Apo2L /TRAIL [8]. Nós e outros rastreados compostos alimentares sensibilizar células cancerosas para Apo2L /TRAIL e identificou vários polifenóis como indutores DR5 [9] – [14]. No entanto, os mecanismos pelos quais estes polifenóis regulam positivamente DR5 são desconhecidos.

translocases de nucleótidos adenina (formigas) são importantes transportadores na membrana mitocondrial interna e desempenham um papel na troca entre a ADP e ATP [15]. As formigas têm quatro isoformas em seres humanos e cada isoforma exibe uma distribuição tecidular diferente. ANT2 é sobre-expressa em muitas células de tumores malignos e tem propriedades anti-apoptóticas [16], [17]. Por exemplo, tem sido mostrado knockdown de ANT2 para intensificar a apoptose por lonidamina, um agente anti-tumoral de segmentação mitocôndrias [17], e induzir a apoptose em células de cancro da mama humanas com a inibição do crescimento do tumor

In vivo

[18]. Além disso, knockdown de ANT2 sensibiliza células cancerosas da mama para Apo2L /TRAIL via regulação positiva de DR5 [19]. Por conseguinte, ANT2 é considerado para ser um alvo anticancerígeno promissor [20], [21].

para elucidar os mecanismos precisos por meio dos quais os flavonóides induzir a expressão de DR5, utilizou-FG grânulos magnéticos, que revelou recentemente alvo de talidomida e o mecanismo de talidomida teratogenicidade [22], [23]. Identificamos ANT2 como uma proteína de ligação da apigenina flavonóides na dieta que upregulated DR5. Tal como acontece com o tratamento de apigenina, knockdown de ANT2 reforçada Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela regulação positiva de DR5. Além disso, knockdown de ANT2 atenuou o aumento da Apo2L /apoptose mediada por TRAIL de apigenina. No presente estudo, mostramos primeiro que ANT2 é alvo de apigenina, que regula positivamente a DR5 e sensibiliza células tumorais malignas para Apo2L /TRAIL.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

a linha de células de cancro da próstata humano DU145 foi obtido na forma de uma linha de células do NCI-60 a partir do National Cancer Institute (MD, EUA) Developmental Therapeutics Program (NCI DTP). A linha de células de cancro da próstata humano LNCaP foram obtidas de American Type Culture Collection. Confirmámos que estas linhas de células de câncer de próstata são negativas para micoplasma usando MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Rockland, ME, EUA). células DU145 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol /L de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO

2. As células LNCaP foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 4 mmol /L de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO

2.

Reagentes

apigenina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão) e genisteína (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EUA) foram comprados e dissolveu-se em DMSO. Recombinante humana de Apo2L /TRAIL foi adquirido a partir de Pepro Tech (Londres, Reino Unido)

ARNi

O seguinte siRNAs (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram utilizados:. SiANT2 # 1, 5 ‘ -AGAACAUUGGACCAUGCACCCUUGA-3 ‘; siANT2 # 2, 5’-UGUAUUGCUUAUCUGCAGUGAUCUG-3 ‘, eo discrição RNAi controle negativo alta GC. Somente cadeias de sentido são mostrados. células DU145 ou LNCaP foram transfectadas com ARNsi utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen).

Detecção de apoptose

células

DU145 ou LNCaP foram tratados com várias concentrações de cada um dos flavonóides para 24 h ou transfectadas com ARNsi. Recombinante humana de Apo2L /TRAIL (50 ng /ml) foi então adicionado às células. Após 24 h, as células foram colhidas e suspensas em PBS contendo 0,1% de Triton X-100, 50 ng /ml de iodeto de propídio, e 100 ug /ml de RNase A (Sigma, St. Louis, MO, EUA). A percentagem de ADN hipodiploidia (sub-G1) foi quantificada pelo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os dados foram analisados ​​utilizando o software celular Quest (Becton, Dickinson and Company).

Análise Western Blot As células

DU145 ou LNCaP foram tratados com várias concentrações de cada um dos flavonóides ou transfectadas com ARNsi. As células foram lisadas com tampão RIPA (50 mmol /L Tris-HCl [pH 8,0], 150 mmol /L de NaCl, 1% de NP-40, ácido desoxicólico 0,5%, 0,1% de SDS, 1 mmol /l de DTT, 0,5 mmol /G PMSF) a 4 ° C durante 30 min e, em seguida, foram centrifugadas. Os sobrenadantes foram recolhidos e separados por 10,0% de SDS-PAGE e depois transferidos para membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EUA) utilizando o método húmido. As membranas foram embebidas em 5% de leite em TBS a 4 ° C durante a noite e incubadas com anticorpos primários à temperatura ambiente durante 60 min. Os anticorpos primários foram um anti-DR5 anticorpo policlonal de coelho (ProSci, Poway, CA, EUA) em 1:500 diluição em leite 5% em TBS e um anticorpo monoclonal de ratinho anti-β-actina (Sigma) a diluição em 5 1:2,000 % de leite em TBS. As membranas foram, então, incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 1:2,000 diluição em TBS-Tween 20, durante 60 min à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram visualizadas em BioMax XAR Filme (Carestream Health, Inc., Rochester, NY, EUA) utilizando Chemi-Lumi Um G (Nacalai Tesque, Quioto, Japão).

quantitativo em tempo real A análise de RT-PCR células

DU145 ou LNCaP foram tratados com várias concentrações de cada um dos flavonóides ou transfectadas com ARNsi. O ARN total foi extraído das células com Sepasol-I de ARN Super (Nacalai Tesque). O DNA complementar foi sintetizado a partir de ARN total utilizando High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kits (Applied Biosystems, Melbourne, Austrália). O DNA complementar foi amplificado utilizando sondas TaqMan para ANT2, DR5, e GAPDH (Applied Biosystems), e um ABI 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems).

Preparação de Grânulos flavonóides fixo

FG esferas magnéticas com um ligante epóxi foram adquiridos a partir de Tamagawa Seiki (Nagano, no Japão). Fixação de apigenina e genisteína sobre as esferas foi efectuada como descrito (Iizumi et ai., Dados não publicados). Em resumo, os grânulos foram misturados com apigenina em DMF contendo carbonato de potássio a 37 ° C durante 24 horas como a genisteína, a 60 ° C durante 24 h, lavou-se duas vezes com DMF e, em seguida, duas vezes com água desionizada. Os grânulos resultantes foram armazenadas a 4 ° C.

purificação e identificação de proteínas de ligação flavonóides

grânulos flavonóides fixo ou pérolas vazias foram incubadas com extractos celulares DU145 toda a 4 ° C durante 4 h. As proteínas de ligação foram eluídos com corante de Laemmli, submetidas a SDS-PAGE e detectadas por coloração com prata. As proteínas de ligação foram então sujeitas a digestão em gel utilizando Sequencing Grade de modificação tripsina (Promega, Madison, WI, EUA). Os fragmentos de péptidos foram analisados ​​por um espectrômetro de massa Autoflex II (Burker Daltonics, Billerica, MA, EUA).

Resultados

Apigenin Melhora Apo2L /apoptose via regulação positiva de DR5 no Post induzida por TRAIL Nível -transcriptional

Entre os flavonóides mais comuns, apigenina é conhecido para aumentar a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL através de regulação positiva de DR5, enquanto aumenta a genisteína Apo2L /apoptose induzida por TRAIL, sem supra-regulação de DR5 [9], [24 ], [25]. No presente estudo, a combinação destes flavonóides e 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL marcada apoptose induzida, enquanto que cada um dos flavonóides por si só não em células de cancro da próstata DU145 humanos (Fig. 1A, S1 e S2). A apigenina induzida a expressão da proteína de DR5 mas não genisteína (Fig. 1B) fez, enquanto apigenina não upregulate ARNm de DR5 (Fig. 1C e S3). Estes resultados sugerem que a apigenina aumenta Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela pós-transcricionalmente DR5 upregulating.

A, células DU145 foram tratados com várias concentrações de cada um dos flavonóides, durante 24 h, seguido por tratamento com ou sem 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Após 24 h, a população sub-G1 das células foi medida por citometria de fluxo. B, células DU145 foram tratados com as concentrações indicadas de cada um dos flavonóides durante 24 horas e colhidas. Os lisatos foram analisados ​​por meio de Western blotting com um anticorpo anti-DR5. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. C, ARNm de DR5 foi quantificada pelo tempo real de RT-PCR e normalizado pela GAPDH. Colunas, quer dizer; barras, SD (n = 3). **

P

. 0,01 em relação ao controlo

ANT2 é identificado como uma proteína de ligação de apigenina, mas não genisteína

Para elucidar o mecanismo pelo qual apigenina induz a expressão de DR5, explorámos as proteínas que se ligam a apigenina, mas não genisteína, utilizando esferas FG com um ligante epóxi. A apigenina e genisteína foram fixados para estes grânulos (Fig. 2a). As proteínas de ligação de apigenina e genisteína foram purificadas a partir dos extractos de células completas e DU145 foram identificados através de análise de MALDI-TOF MS. Adenina nucleótidos translocase-2 (ANT2) foi identificada como uma proteína de ligação de apigenina, mas não genisteína. Por outro lado, a proteína ribossomal S9 (RPS9) foi identificada como uma proteína de ligação destes flavonóides (Fig. 2B). Estes resultados indicam que ANT2 é uma proteína de ligação de apigenina, que induz a expressão DR5.

A, Fixação de apigenina e genisteína em esferas FG magnéticos. B, Apigenin- e proteínas de ligação a genisteína foram purificados a partir de extractos de células completas de células DU145 com cada flavonóides-fixo ou não (-) e FG grânulos foram analisados ​​por coloração com prata. As proteínas de ligação foram identificados por um espectrômetro de massa.

Knockdown de ANT2 Melhora Apo2L /apoptose via regulação positiva de DR5 no nível pós-transcricional

Tem sido relatado que a induzida por TRAIL knockdown de ANT2 aumenta Apo2L /apoptose induzida por TRAIL através de regulação positiva de DR5 em células de cancro da mama humano [19]. Portanto, foi investigado se o knockdown de ANT2 reforçada Apo2L /apoptose induzida por TRAIL em células DU145 de cancro da próstata humano. ANT2 siRNAs potentemente reprimiu a expressão de ARNm ANT2 (Fig. 3A e S4). Como mostrado na Fig. 3B e S5, siRNAs ANT2 parece ter aumentado Apo2L /apoptose mediada por TRAIL. A seguir, analisou se ANT2 knockdown induzida expressão DR5. expressão induzida por DR5 foi ANT2 ARNic em células DU145 (Fig. 3C), enquanto que o ARNm de DR5 não foi induzido (Fig. 3D e S6). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que knockdown de ANT2, bem como apigenina, aumenta a Apo2L /apoptose induzida por TRAIL por correio transcricionalmente-DR5 upregulating.

células DU145 foram transfectadas com dois siRNAs Ant2 diferentes (siANT2 # 1 e # 2) ou um ARNsi não segmentação (siCtrl) e foram incubadas durante 48 horas. Um, ANT2 mRNA foi quantificado por em tempo real de RT-PCR e normalizado pela GAPDH. B, as células foram tratadas com ou sem 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Após 24 h, a população sub-G1 das células foi medida com a citometria de fluxo. C, os níveis de proteína de DR5 e β-actina foram analisados ​​por transferência de Western. D, os níveis de ARNm de DR5 foram medidos por em tempo real de RT-PCR e normalizado pela GAPDH. Colunas, quer dizer; barras, SD (n = 3). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 em relação ao controlo

Knockdown de ANT2 Atenua Apo2L /TRAIL induzida por apoptose potenciado pela Apigenin

para elucidar o papel do ANT2 na melhoria da Apo2L sensibilidade /TRAIL por apigenina, examinamos se knockdown de ANT2 influenciado este acessório como anteriormente realizada como a outras proteínas-alvo [26], [27]. A apigenina (20 umol /L) aumentou a 50 ng /ml de Apo2L /apoptose mediada por TRAIL de células DU145 introduzidas pelo ARNsi de controlo, mas não em células DU145 introduzidas por ANT2 siRNA (Fig. 4A e S7). O silenciamento de ANT2 reduzido o aumento da expressão de DR5 por 20 umol /L apigenina (Fig. 4B). Estes resultados indicam que a inibição ANT2 é necessário para apigenina para aumentar a expressão de DR5 e Apo2L /apoptose induzida por TRAIL.

células DU145 foram transfectadas com 1 ou # siANT2 siCtrl. Após 48 horas, as células foram incubadas com 20 nmol /L durante 24 h apigenina. Um, as células foram tratadas com ou sem 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Após 24 h, a população sub-G1 das células foi medida por citometria de fluxo. A diferença em populações sub-G1 com e sem Apo2L /TRAIL foi definida como a atividade de Apo2L /TRAIL. A actividade de Apo2L /TRAIL em amostras sem apigenina foi normalizado a 1. B, os níveis de proteína de DR5 e β-actina foram analisados ​​por transferência de Western. Colunas, quer dizer; barras, SD (n = 3). **

P

. 0,01 em relação ao controlo

A seguir, investigou o papel da ANT2 em outra linha de células de câncer, câncer de próstata humano hormono-dependente LNCaP. ARNm ANT2 foi eficazmente silenciados por ARNsi ANT2 (Fig. 5a e S8), e knockdown de ANT2 também induziu expressão de DR5 (Fig. 5B) e aumentada de 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL a apoptose induzida por (Fig. 5C e S9). Além disso, knockdown de ANT2 atenuou o aumento da Apo2L sensibilidade /TRAIL e expressão DR5 em 20 mmol /L apigenina (Fig. 5D, E e S10).

células LNCaP foram transfectadas com siANT2 ou siCtrl e foram incubou-se durante 48 h. Um, ANT2 mRNA foi quantificado por em tempo real de RT-PCR e normalizado pela GAPDH. B, os níveis de proteína de DR5 e β-actina foram analisados ​​por transferência de Western. C, as células foram incubadas com ou sem 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Após 24 h, a população sub-G1 das células foi medida com a citometria de fluxo. D, as células foram incubadas com 20 nmol /L de apigenina, durante 24 h, seguido por tratamento com ou sem 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. A actividade de Apo2L /TRAIL em amostras sem apigenina foi normalizado para 1. E, as células foram incubadas com 20 nmol /L durante 24 h apigenina. Os níveis de proteína de DR5 e β-actina foram analisados ​​por transferência de Western. Colunas, quer dizer; barras, SD (n = 3). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 em relação ao controlo

Discussão

No presente estudo, nós. ANT2 identificada como uma proteína de ligação de apigenina que upregulated DR5 utilizando esferas magnéticas FG (Fig. 2). Knockdown de ANT2 reforçada Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela upregulating DR5 (Fig. 3), semelhante ao tratamento com apigenina (Fig. 1). Além disso, knockdown de ANT2 atenuou o aumento da expressão de DR5 e Apo2L /apoptose induzida por TRAIL pela apigenina (Fig. 4 e 5). Estes resultados sugerem que se liga e inibe a apigenina ANT2, o que induz a expressão DR5 e potencializa Apo2L /TRAIL sensibilidade (Fig. 6). O presente estudo também sugere que a apigenina pós-transcricional induz DR5 inibindo ANT2 (Fig. 1B e C). Supõe-se que vários agentes, que foram relatados para upregulate DR5 ao nível da transcrição [10] – [13], também pode induzir a expressão DR5 ao nível pós-transcricional inibindo ANT2

A apigenina se liga e inibe. ANT2. A inibição da ANT2 aumenta a sensibilidade Apo2L /TRAIL via regulação positiva de DR5.

foi relatado que knockdown de ANT2 eleva os níveis de ROS [17] e ativa JNK e p53 [19], consistente com a apigenina também aumenta os níveis de ROS [25], [28] e activa JNK [29] e p53 [30]. Além disso, o presente estudo mostrou que a apigenina obrigado a ANT2 e regulada DR5 semelhante ao knockdown de ANT2. Estes resultados sugerem fortemente que a apigenina funcionalmente inibe ANT2.

Vários polifenóis, como apigenina, foram relatados para melhorar Apo2L sensibilidade /TRAIL através de diversas vias [25], [31]. No entanto, os mecanismos detalhados através do qual cada polifenol aumenta a sensibilidade de Apo2L /TRAIL permanecem desconhecidos. O nosso método de identificar os alvos de polifenóis podem ser úteis para a elucidação desses mecanismos.

elucidado o mecanismo através do qual apigenina upregulated DR5 comparando as proteínas de ligação de apigenina que upregulated DR5 e genisteína que não (Fig. 2) . A estratégia que compara as proteínas de ligação directa de vários agentes é benéfica. Por exemplo, foi esclarecido que os ligandos de proteínas VDAC induzir selectivamente a morte celular não-apoptótica em células tumorais abrigar mutações nos oncogenes

HRAS

,

KRAS

, ou

BRAF

comparando as proteínas de ligação de erastin A6 e B2 erastin, um análogo erastin que falta a sua actividade [32]. A comparação das proteínas de ligação de agentes diferentes podem revelar as proteínas que causam os efeitos principais ou adversos desses agentes. Além disso, o controle farmacológico destas proteínas de ligação podem desenvolver quimioterapia corrente.

Até à data, vários anticorpos anti-DR5 humano recombinante agonísticas e Apo2L /TRAIL foram desenvolvidos e estão sob ensaios clínicos, ao passo que alguns cancros exibiram resistência à esses agentes [7]. No presente estudo, knockdown de ANT2 sensibilizados células cancerosas para Apo2L /TRAIL por upregulating DR5. Este estudo também sugere que a apigenina pode ser um inibidor ANT2. Assim, os inibidores da apigenina e romance Ant2 podem aumentar os efeitos destes agentes ao superar a resistência a Apo2L /TRAIL.

Informações de Apoio

Figura S1.

Os histogramas da Figura 1A como a apigenina.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s001

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Figura S2.

Os histogramas da Figura 1A como a genisteína.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s002

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Figura S3.

As curvas de amplificação da Figura 1C.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s003

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Figura S4.

As curvas de amplificação da Figura 3A.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s004

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Figura S5.

Os histogramas da Figura 3B.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s005

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Figura S6.

As curvas de amplificação da Figura 3D.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s006

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Figura S7.

Os histogramas da Figura 4A.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s007

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Figura S8.

As curvas de amplificação da Figura 5A.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s008

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Figura S9.

Os histogramas da Figura 5C.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s009

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Figura S10.

Os histogramas da Figura 5D.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0055922.s010

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Reconhecimentos

Estamos gratos a M. Horinaka e Y. Sowa para a discussão útil