Abstract
A /testículo (CT) da família antígeno Cancer de genes são transcricionalmente reprimida na maioria dos tecidos humanos, mas são atipicamente re-expresso em muitos tipos de tumores malignos. Seu perfil de expressão restrita faz CT antígenos alvos ideais para a imunoterapia do cancro. Como pouco se sabe sobre se antigénios CT pode ser regulamentada por processamento pós-translacional, que investigou os mecanismos que regem a degradação do NY-ESO-1 e MAGE-C1 em linhas celulares de cancro selecionados. Os inibidores da degradação mediada por proteassoma induzida a compartimentação de NY-ESO-1 e MAGE-C1 numa fracção insolúvel em detergente. Além disso, este tratamento também resultou num aumento da localização de NY-ESO-1 e MAGE-C1 no centrossoma. Apesar da sua interacção, quer deslocalização de NY-ESO-1 ou MAGE-C1 para o centrossoma poderia ocorrer independentemente uma da outra. Usando uma série de fragmentos truncados, as regiões que correspondem ao NY-ESO-1
91-150 e MAGE-C1
900-1116 foram estabelecidos como importante tanto para controlar a estabilidade e a localização destes antigénios CT. Os nossos resultados demonstram que os níveis de estado estacionário de NY-ESO-1 e MAGE-C1 são regulados por degradação proteossómica e que tanto se comportam como proteínas de agregação propensa em sua acumulação. Com inibidores de proteassoma que está sendo cada vez mais utilizado como tratamento de primeira linha no cancro, estes dados levantam questões sobre processamento de antigénios CT para apresentação antigênica e, portanto, a imunogenicidade em pacientes com câncer
Citation:. Pagotto A, Caballero OL, Volkmar N, Devalle S, Simpson AJG, Lu X, et al. (2013) Centrosomal Localização do Câncer /testículo (CT) Antígenos NY-ESO-1 e MAGE-C1 é regulada por Proteasoma Atividade em células tumorais. PLoS ONE 8 (12): e83212. doi: 10.1371 /journal.pone.0083212
editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japão
Recebido: 08 de agosto de 2013; Aceito: 31 de outubro de 2013; Publicação: 10 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Pagotto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Cancer Research Ludwig. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
envolvendo o sistema imune para reconhecer e eliminar células de tumores /cancro continua a ser uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento do cancro. A abordagem baseia-se intrinsecamente na identificação de assinaturas moleculares capazes de forma eficaz e coerente diferenciar a população maligno. O cancro /Testículos (CT) antigénios são um conjunto de mais de 100 famílias de genes com membros múltiplos e variantes de splicing [1-3] que foram identificadas através de uma vasta gama de técnicas, incluindo: clonagem epitopo de células T [4-7] ; análise sorológica de bibliotecas de expressão de cDNA (SEREX) [1], o diferencial de análise de expressão gênica [8,9]; e bioinformática métodos [10,11]. A sua expressão é normalmente restrito para as células germinativas do testículo [12-15] e, ocasionalmente, ovário [16] e [17] trofoblastos. No entanto, em uma variedade de tipos de tumores (e.g. melanoma, cancro de células pequenas do pulmão, sarcoma, etc …) expressão atípica de um ou mais antigénios CT pode ser observado [3,18,19]. As consequências fisiológicas da expressão de antigénios CT para a progressão do cancro não são completamente compreendidos, mas vários antigénios CT foram mostrados para ser moduladores de ubiquitinação através de complexos formados com ubiquitina ligases do tipo anel [20].
O CT antígeno NY-ESO-1 /CTAG1 /CT6 foi identificado pela primeira vez por SEREX no carcinoma epidermóide esofágico [1,21]. NY-ESO-1 exibe uma arquitectura relativamente único, com um domínio PCC-1 na extremidade C-terminal (aa 89-164) homóloga a um factor de transcrição de levedura envolvidos na progressão do ciclo celular e crescimento polarizada [22], sendo a sua única conservada característica. Um papel biológico definitivo para NY-ESO-1 permanece indeterminada, mas tem sido mostrado para interagir especificamente com outro antigénio CT, MAGE-C1 [23]. MAGE-C1 é parte da família maior
MAGE
(Genes Melanoma Antigen), que é composta por mais de 50 genes em várias subfamílias (
MAGE-A a -L
). A característica predominante dessas famílias é o domínio apropriadamente chamado MAGE homologia (MHD), uma grande região central conservada entre seus membros [24-26]. O MHD está presente na maioria das proteínas MAGE metazoários, mas o grande ausente no
C. elegans
, bem como eucariotas unicelulares. Identificado por SEREX e análise de diferença representacional (RDA) [8], MAGE-C1 /CT7 é quase três vezes maior do que qualquer outro membro da família MAGE (1142 aa). A sua extremidade N-terminal alargada tem pouca ou nenhuma arquitectura apreciável domínio previsto, para além de várias sequências de repetição de 14, 16 e 21 AA [8]. MAGE-C1 é geralmente expressa no mieloma múltiplo (MM) [27], bem como o sarcoma, o melanoma e o cancro da bexiga [3,18]. A função para MAGE-C1 ainda não foi determinada, mas vários estudos têm relacionado com a apoptose em MM [28,29].
Entre as famílias de genes CT antigénio, pelo menos, 19 membros foram encontrados para provocar respostas imunitárias humorais e /ou celulares em pacientes com cancro [19,30]. proteínas antigénicas de CT processados em peptídeos pelo proteassoma e apresentadas na superfície celular por moléculas de MHC, são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogo. expressão restrita ao tumor e de alta imunogenicidade fez antigénios CT alvos atraentes para as estratégias de imunoterapia no tratamento de cancros seleccionados [19,31-36]. NY-ESO-1 é considerado como sendo um dos antigénios CT mais imunogénicos e tem sido um foco de investigação para a formulação de vacinas terapêuticas [37]. Ao contrário de outros antigénios, é comum observar anticorpo simultânea e a resposta de célula T para o NY-ESO-1, o qual é capaz de provocar uma forte CD4 integrada
+ e CD8
+ T resposta imune celular [38-40] . A análise sistemática identificou um epitopo “hot spot” para a resposta de células T na parte central da proteína NY-ESO-1 entre os aminoácidos 80-110 [41-44].
Enquanto a regulação da transcrição da expressão de antigénios CT tem atraído muita atenção, entendendo sua regulação pós-translacional e função biológica também devem ser considerados para delinear seus papéis no cancro. Como alvos de vacinas atraentes, determinando mecanismos celulares que controlam os níveis de proteína em estado estacionário NY-ESO-1 e MAGE-C1 é importante, uma vez que pode fornecer informações sobre os meios que podem modular a sua expressão ou processamento pela apresentação de antígenos e, consequentemente, a resposta imune contra as células de tumor que expressam esses antigénios CT. Aqui, nós fornecemos evidências de que os níveis de estado estacionário, solubilidade e localização do CT antígenos NY-ESO-1 e MAGE-C1 são regulados pela degradação pelo proteassoma. Os domínios específicos de cada proteína envolvida na regulação dessas facetas também são identificados e discutidos.
Resultados
inibição de proteassoma induz insolubilidade e enriquecimento centrosomal de NY-ESO-1 |
Para determinar se a degradação através do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) pode estar envolvido na pós -translational regulação CT antigénio, os níveis de NY-ESO-1 e MAGE-C1 expressão foram determinadas em primeiro lugar em um painel de linhas celulares de cancro. Observou-se que a SK-MEL-37 de melanoma e linhas celulares de carcinoma do pulmão de células pequenas H146 (SCLC) expressam níveis elevados de NY-ESO-1 (Figura 1A e S1A, respectivamente). Ambas as linhas celulares foram posteriormente tratadas com o inibidor de proteassoma MG132. Os lisados celulares foram separados em fracções solúveis (SOL) e insolúveis (INSOL) em tampão de lise RIPA, recolhidas e separadas por SDS-PAGE. Embora não quantitativas, as transferências Western sondadas para NY-ESO-1 detectados níveis elevados nas fracções RIPA-insolúveis de ambas as linhas celulares após o tratamento MG132 quando comparado com não tratadas (Figura 1B, S1B), reflectindo uma solubilidade diminuída com a perda de actividade de proteassoma . Com esta mudança na solubilidade, suspeitou-se que o NY-ESO-1 localisation também poderia ter sido alterado. Em ambas as células SK-MEL-37 e H146, NY-ESO-1 foi observada por imunofluorescência a acumular-se no único ponto lacrimal após o tratamento MG132, para além da localização predominantemente citoplasmática visto em células não tratadas. Reminiscente do centrossoma, a presença de NY-ESO-1 a este organismo foi confirmada por colocalisation de NY-ESO-1 com pericentrin, uma proteína bem caracterizado que marca esta estrutura (Figura 1C, S1C). Além disso, pontos lacrimais ubiquitina, uma característica da formação aggresome, também foram observados para colocalise com NY-ESO-1 a esta estrutura (Figura 1D). Com alguma frequência, localizada centrossoma-NY-ESO-1 poderiam ainda ser detectadas em células não tratadas H146 (Figura S1C, parte superior, 2D), levantando a possibilidade de uma função fisiológica bona fide neste corpo sob condições normais. Estes dados indicam NY-ESO-1 pode localizar o centrossoma e que exige que as UPS para a degradação eficiente.
A) Detecção de endógena MAGE-C1 e NY-ESO-1 por Western blot (CT7.33 e NY-41 anticorpos, respectivamente). Os lisados celulares foram preparados a partir de SK-MEL-37, U2OS e células H1299 e separadas por SDS-PAGE. β-tubulina serviu como um controlo de carregamento. B) Detecção de NY-ESO-1 a partir de SK MEL-37 células tratadas com DMSO (controlo negativo) e MG132 (40μM, 4hrs). Quantidades iguais de RIPA-solúvel (SOL) e -insoluble (INSOL) de material (20 ug) foram detectados. C) micrografias de imunofluorescência de endógena NY-ESO-1 (verde) e pericentrin (vermelho) em células SK-MEL-37 são mostrados, juntamente com as suas imagens fundidas. micrografias D) imunofluorescência de endógena NY-ESO-1 (verde) e ubiquitina (vermelho) em células SK-MEL-37 são mostrados, juntamente com as suas imagens fundidas. setas brancas indicam centrossomas e barras de escala = 20 um.
NY-ESO-1 e colocalise MAGE-C1 no centrossoma sobre a inibição do proteosoma
NY-ESO-1 é frequentemente co-expressa com MAGE-C1 em células cancerosas onde eles são capazes de interagir. Para determinar se as alterações para o NY-ESO-1 solubilidade e localização subcelular induzida por tratamento MG132 também afectada MAGE-C1, SK-MEL-37 células que expressam endogenamente tanto MAGE-C1 e NY-ESO-1 (Figura 1A) foram tratados com MG132. Como o NY-ESO-1, inibir a actividade de proteassoma marcadamente elevados níveis de proteína MAGE-C1 na fracção insolúvel RIPA, com muito pouca variação observada na fracção solúvel em RIPA (Figura 2A). Colocalisation com pericentrin demonstrado que, como NY-ESO-1, MAGE-C1 acumula no centrossomas, quando a actividade do proteassoma é comprometida (Figura 2B) e colocalisation de MAGE-C1 e NY-ESO-1 em pontos lacrimais semelhante suporta a sua presença simultânea lá (Figura 2C). Colocalisation com pericentrin aumentou significativamente em SK MEL-37 células tratadas com MG132, atingindo mais de 75% tanto para MAGE-C1 (p = 0,00222, 2-tailed t-teste) e NY-ESO-1 (P = 0,00013) ( Figura 2D) e que indica uma resposta robusta para a inibição de proteassoma. NY-ESO-1 colocalisation com pontos lacrimais ubiquitina apresentaram uma diferença marcada em células SK-MEL-37 (p = 0,01139), mas não H146s, que exibiu a formação de menos consistente (Figura 2E). SK-MEL-37, quer com as células tratadas epoxomicina, um inibidor de proteassoma mais selectiva (Figura S2A), ou reduzidas concentrações MG132 (Figura S2B) originou resultados comparáveis. Acumulação de qualquer MAGE-C1 ou NY-ESO-1 a puncta e em frações RIPA-insolúveis era reversível, refletido por um retorno à localização dispersa e solubilidade detergente seguinte MG132 washout (Figura S2C, S2D). Em conjunto, estes dados indicam que tanto o NY-ESO-1 e MAGE-C1 transitoriamente acumular pelo centrossomas em resposta a uma via de degradação prejudicada.
A) Western Blot de MAGE-C1 a partir de lisados de SK-MEL-37 células tratadas com DMSO (controlo negativo) e MG132 (40μM, 4hrs). RIPA-solúvel (SOL) e frações -insoluble (INSOL) são mostrados. B) micrografias de imunofluorescência de endógena MAGE-C1 (verde) e pericentrin (vermelho) em células SK-MEL-37. imagens fundidas também são mostrados. Barras de escala = 20 um) C micrografias de imunofluorescência de endógena MAGE-C1 (verde) e NY-ESO-1 (vermelho) em células SK-MEL-37. Barras de escala = 10 um. Em todas as imagens, setas brancas indicam centrossomas. D) Os gráficos de barras apresentando a percentagem de NY-ESO-1 e MAGE-C1 pontos lacrimais colocalised com pericentrin para SK-MEL-37 (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 0,42 ± 0,72 e MG132: 76,94 ± 6,61, p = 0,00222; NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 5,77 ± 3,74 e MG132: 75,77 ± 1,73, p = 0,00013), U2OS (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 2,75 ± 1,74 e MG132: 69,28 ± 6,79, p = 0,00212), HC33 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 21,32 ± 2,39 e MG132: 70,23 ± 6,86, p = 0,00312) e H146 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 57,86 ± 18,53 e MG132: 80,95 ± 1,80, P = 0.16289) células. Embora as células H146 expressam MAGE-C1, ele não foi incluído nesta análise. gráficos E) de barras apresentando a percentagem de colocalised NY-ESO-1 e pontos lacrimais ubiquitina para SK-MEL-37 (DMSO: 0,65 ± 1,12 e MG132: 30,81 ± 6,09, p = 0,01139), HC33 (DMSO: 4,09 ± 2,52 e MG132 : 23,06 ± 6,70, p = 0,02739) e H146 (DMSO: 2,14 ± 1,43 e MG132: 20,00 ± 18,03, p = 0,22733) células. Média, desvio padrão e significado são mostrados.
localização independente de antígenos CT na
centrossoma
Desde NY-ESO-1 e MAGE-C1 pode formar complexos, nós próxima testaram se a interação era necessária para conferir particionamento para uma fração RIPA insolúvel ou localização no centrossoma sobre a inibição do proteosoma. células de osteossarcoma U2OS expressar MAGE-C1, mas não o NY-ESO-1, enquanto que as células HC33 SCLC expressam NY-ESO-1, mas não MAGE-C1 (Figura 1A, S1A). Após o tratamento com MG132, foi observada cada antigénio CT para acumular de forma independente em fracções insolúveis em RIPA (Figura 3A, 3C) e localizar a centrossomas (Figura 3B, 3D). Estes dados foram apoiados por silenciamento mediado por siRNA de genes de ambos os antigénio em células SK-MEL-37, que demonstrou que a depleção de NY-ESO-1 não afectou localização centrosomal de MAGE-C1 (Figura S3, esquerda) e vice-versa ( Figura S3, à direita). Ambos MAGE-C1 e NY-ESO-1 pontos lacrimais formado que colocalised com pericentrin em U2OS (p = 0,00212) e HC33 (p = 0,00312), as células, respectivamente, com níveis de cerca de 70% e significativamente maior do que as células tratadas com DMSO (Figura 2D ). Como os H146s, mais elevados os níveis basais de NY-ESO-1 pontos lacrimais também foram observados na linha celular HC33. Colectivamente, estes dados indicam que o NY-ESO-1 e MAGE-C1 pode acumular e localizar o centrossoma independentemente um do outro, durante os períodos de actividade de proteassoma prejudicada.
A) Detecção de endógena NY-ESO-1 por western blot a partir de células HC33 CPPC tratados com DMSO e MG132 (40μM, 4 horas). RIPA-solúvel (SOL) e frações -insoluble (INSOL) são mostrados. B) micrografias de imunofluorescência de endógena NY-ESO-1 (verde) e pericentrin (vermelho) em células HC33 tratados com DMSO e MG132, como na Figura 1C C) Detecção de endógena MAGE-C1 a partir de células de osteossarcoma U2OS sob as mesmas condições que no Figura 2A. micrografias D) de imunofluorescência de endógena MAGE-C1 (verde) e pericentrin (vermelho) em células U2OS tratados com DMSO e MG132, como na Figura 2B. setas brancas indicam centrossomas. Barras de escala = 20 um.
NY-ESO-1
91-150 contribui para a estabilidade global
Nós demonstramos que NY-ESO-1 é um substrato do proteassoma mas que regiões influenciar a sua degradação não é conhecido. Para identificar os domínios responsáveis pela partição em fracções e localização do centrossoma RIPA insolúvel, nós construídos fragmentos de NY-ESO-1 (NY-ESO-1
1-90, NY-ESO-1
e 91-180 NY-ESO-1
50-150, Figura 4A) e expressa-los individualmente, juntamente com a forma de comprimento completo (NY-ESO-1
FL) no rato derivado células NIH3T3, que não expressam nem MAGE-C1 nem NY-ESO-1. A seguir ao tratamento e solubilização regime MG132 descrito acima, a expressão relativa e localização subcelular foram analisadas por Western blot e imunofluorescência, respectivamente. Ambas as fracções solúvel e RIPA–insoluble de NY-ESO-1
FL, NY-ESO-1
91-180 e NY-ESO-1 foram estabilizadas
50-150 por MG132, enquanto NY- ESO-1
1-90 única acumulada na fracção solúvel em RIPA (Figura 4B). acumulação acentuada do NY-ESO-1
91-180 fragmento com MG132 implica a UPS no volume de negócios rápida do fragmento e sugere NY-ESO-1 a estabilidade é derivado de uma região fora do domínio PCC1. O NY-ESO-1
1-90 fragmento apareceu concentrada no núcleo, enquanto que o NY-ESO-1
91-180 e NY-ESO-1
50-150 localizada tanto ao nuclear e citoplasmática regiões independentemente de se endógeno NY-ESO-1 e MAGE-C1 estavam presentes (SK-MEL-37, A Figura 4C) ou não (NIH3T3, Figura S4). Localização subcelular de uma das truncagens expressos em NIH3T3s (Figura S4) ou NY-ESO-1 1 NY-ESO-
1-90 em SK-MEL-37 (Figura 4C) foi não significativamente alterada pela MG132. No entanto, como endógeno NY-ESO-1, tanto o NY-ESO-1
91-180 e NY-ESO-1
50-150 acumulado no centrossomas em SK-MEL-37 células (Figura 4C). Juntos, esses dados destacam a região entre aa 91-150 tão influente na estabilidade NY-ESO-1 e em localização no centrossoma.
A) Representação esquemática do V5 /His6 epitopo marcado comprimento e truncagem construções completas de NY-ESO-1. NY-ESO-1
1-90, NY-ESO-1
91-180 e NY-ESO-1
50-150 são apresentados, juntamente com o domínio conservado PCC1. B) Detecção de NY-ESO-1 construções expressos transitoriamente em células NIH3T3 por Western blot com anticorpos anti-V5 e anti-β-tubulina (controlo de carga). As células foram tratadas com MG132 e fracções recolhidas como na Figura 1B. C) micrografias de imunofluorescência de células SK-MEL-37 (± MG132) que expressam transitoriamente NY-ESO-1 fragmentos (anti-V5, verde) e pericentrin (vermelho), com núcleos identificados por coloração DAPI (azul). setas brancas indicam centrossomas. Barras de escala = 20 um.
O MHD contribui para a estabilidade MAGE-C1
Como NY-ESO-1, os aspectos que afetam os níveis de estado estacionário MAGE-C1 não estão bem caracterizados. Para determinar a região /s de MAGE-C1 influenciar sua estabilidade, que gerou uma série de fragmentos, incluindo: MAGE-C1
1-138, MAGE-C1
600-901, MAGE-C1
902- 1029 e MAGE-C1
1030-1142 (Figura 5A). Não foi possível construir fragmentos que abrangem todo o comprimento do MAGE-C1, como o elevado número de repetições ricas em GC entre os aminoácidos 139 e 600 de amplificação excluída desta região. Quando transitoriamente transfectado em ambos NIH3T3 (Figura 5B) e H1299 células (Figura S5), MAGE-C1
1-138 e MAGE-C1
600-901 exibido mais elevados níveis de estado estacionário de faixas predominantemente individuais, em comparação com outras truncagens. Além disso, cada pareceu migrar com um peso molecular que era mais elevado do que o esperado. Isso poderia representar a formação de oligômeros MAGE-C1 ou poderia refletir a migração retardada devido à composição polipeptídica. Em contraste, ambos os fragmentos C-terminais (MAGE-C1
902-1029 e MAGE-C1
1030-1142) apresentaram redução dos níveis de estado estacionário de RIPA-solúveis, em que foram detectadas duas bandas distintas. As bandas mais elevadas do que o esperado podem reflectir uma modificação pós-tradução (por exemplo, ubiquitinação) ou potencialmente uma espécie oligomérica. Fragmentos contendo porções do MHD (MAGE-C1
902-1029, MAGE-C1
1030-1142) acumulada em ambos os RIPA fracções solúveis e -insoluble com adição de MG132. Por outro lado, MAGE-C1
600-901 foi apenas modestamente estabilizado com MG132 enquanto que o fragmento N-terminal (MAGE-C1
1-138) pareceu ser afectada em grande medida (Figura 5B). Em células NIH3T3, MAGE-C1
1-138 e MAGE-C1
600-901 apareceu tanto no núcleo e no citoplasma, ao passo que os fragmentos contendo MHD (MAGE-C1
902-1029 e MAGE- C1
1030-1142) foram totalmente excluídos do núcleo (Figura 5C). Localização dos fragmentos de MAGE-C1 em células NIH3T3 não foi marcadamente alterada após o tratamento MG132. Para determinar se o MHD sozinho foi suficiente para particionamento MAGE-C1 e a localização, o domínio isolado (MAGE-C1
900-1116) foi expressa em células H1299, uma linha de células de carcinoma de pulmão humano que expressa NY-ESO-1, mas não MAGE-C1. Tal como os fragmentos que continham porções do MHD, MAGE-C1
900-1116 acumulada em ambas as fracções de RIPA-solúveis e insolúveis com MG132 como duas bandas imunorreactivas detectado por Western blot (Figura 5D). Consistente com os fragmentos relacionados, MAGE-C1
900-1116 foi predominantemente citoplasmática em células H1299 e MG132 não nomeadamente alterar essa localização (Figura 5E). Estes dados implicam o domínio MAGE homologia altamente conservado no processamento dependente do proteassoma e localização citoplasmática de MAGE-C1.
A) representações esquemáticas de V5 /His6 epitopo marcado comprimento e truncagem construções completas de MAGE-C1. MAGE-C1
1-138, MAGE-C1
600-901, MAGE-C1
902-1029, MAGE-C1
1030-1142 e MAGE-C1
900-1116 são mostrado e o domínio de homologia de MAGE (MHD) é indicado. B) Expressão transiente de fragmentos de MAGE-C1 em fibroblastos de ratinho NIH3T3 detectadas por Western blot com anticorpos anti-V5 e anti-β-tubulina (controlo de carga). As células foram tratadas e lisadas como na Figura 1B. Os asteriscos indicam possíveis formas oligoméricas. micrografias C) de imunofluorescência de fibroblastos de ratinho NIH3T3 expressando fragmentos de MAGE-C1 (anti-V5, verde) onde TOPRO foi incluído para manchar núcleos (vermelho). As células foram tratadas com MG132 (40μM, 4h) ou DMSO (controlo negativo). D) A expressão transiente de MAGE-C1
900-1116 em células NSCLC H1299 e detectada sob as condições usadas na Figura 5B. Asterisco indica possível forma oligomérica. E) micrografias de imunofluorescência de H1299 células que expressam MAGE-C1
900-1116 como na Figura 5C. Para todas as imagens, barras de escala = 20 um.
Discussão
estratégias imunoterápicos para o tratamento do câncer dependem efetivamente discriminar entre células normais e malignas com base em padrões de expressão diferencial de proteínas da superfície celular ou apresentado antigénios. O Câncer /testículo (CT) da família antígeno de genes tem mais de 100 membros diferentes, cuja expressão normalmente restrito nas células da linha germinal do testículo fica desregulada em muitos tipos de câncer, efetivamente diferenciá-los a partir do tecido normal, envolvente. genes de antigénios CT são normalmente silenciado por metilação nos seus promotores ricas em CpG e assim por desmetilação de tais regiões, bem como acetilação da histona, é parcialmente responsável pela sua re-expressão aberrante em cancro (revisto em 19). No entanto, estes mecanismos são totalmente incapazes de explicar a falta de expressão de antigénios CT em alguns tipos de tumores caracterizados por hipometilação global (por exemplo, cancro do cólon) [45,46], nem a heterogeneidade muitas vezes observada em amostras de tumores [47]. Tais padrões de expressão complexos exigem múltiplos níveis de regulação que não são susceptíveis de ser imputável unicamente aos mecanismos de transcrição. Por esta razão, foi investigada a regulação pós-translacional estudado de antigénios CT. Aqui, são apresentados dados que implicam a degradação, por meio da proteassoma 26S, como um importante regulador dos níveis de estado estacionário de antigénios CT e demonstram que, quando fica comprometida, a solubilidade e a localização subcelular de tanto o NY-ESO-1 e MAGE-C1 são drasticamente alteradas.
O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um mecanismo principal de degradação da proteína regulada em eucariotas (revisto em 48). Para verificar como a degradação através da UPS impactado níveis de estado estacionário de NY-ESO-1 e MAGE-C1 em linhas celulares de cancro, que trataram células com inibidores de proteassoma, enquanto monitora mudanças para solubilidade e localização de cada proteína. Os inibidores do proteassoma causada endogenamente expressa NY-ESO-1 e MAGE-C1 a acumular-se, quer sozinho (HC33, U2OS), em que ambos os antigénios CT estavam presentes (SK-MEL-37), ou quando cada um foi transitoriamente expresso em linhas celulares de falta ou ( NIH3T3). De nota, a acumulação foi predominantemente detectada como um aumento na fracção insolúvel em detergente-do lisado celular. Embora nem NY-ESO-1 nem MAGE-C1 tem sido relatada previamente para ser propensa a agregação, a propensão para antigénios CT para se tornar insolúvel sugere que as capacidades da rede chaperona (e degradação) /S ter sido excedido. Ambos MAGE-C1 e NY-ESO-1 foram observados a acumular-se no centrossoma sob as mesmas condições. Este teste padrão é reminiscente de outras proteínas propensas à agregação tais como CFTRΔF508 [49] e huntingtina [50] cuja acumulação na centrossomas é agravada com a inibição do proteassoma (revisto em 51,52). Centrossomas servir como centro organizador dos microtúbulos primário (MTOC) e desempenham um papel importante como regulador da progressão do ciclo celular [53]. O MTOC também se torna um hub para os componentes de ambos os chaperones citosólicas (por exemplo, Hsp40, Hsp70) eo UPS (por exemplo, ubiquitina, 19S e 20S subunidades) [49,54,55], que se acumulam em resposta às proteínas deformadas entregues por meio de transportes directo em microtúbulos que formam o corpo intracelular referido como o aggresome [49,56,57]. Neste papel, centrossomas funcionar como plataformas de triagem para decisões de controle de qualidade da proteína. Há evidências de que os componentes do UPS localizada-centrossoma são capazes de se envolver na degradação activa [54,58,59]. O particionamento insolúvel e acumulação de centrossomas de tanto o NY-ESO-1 e MAGE-C1 sugerem uma propensão destes antigénios CT para se agregar, uma característica exacerbada quando a actividade do proteassoma é comprometida.
Acumulação de tanto o NY-ESO-1 e MAGE-C1, pelo centrossomas, na ausência de actividade de proteassoma provavelmente reflecte a segregação de proteínas deformadas (possivelmente como agregados insolúveis) para um local central onde aguardam reparação. A detecção de clusters de ubiquitina concentradas em centrossomas (Figura 1D) e o acúmulo de materiais polyubiquitinated na fração INSOL (Figura S2D) apoiar este modelo. Níveis mais elevados de NY-ESO-1 pontos lacrimais em centrossomas em células H146 não tratadas (e, em menor HC33s grau) contra SK-MEL-37 também podem reflectir as diferenças entre as suas redes de degradação chaperona e, fazendo agregação mais prevalentes nas células com capacidade reduzida. Uma explicação alternativa para este pode ser qualquer um que o NY-ESO-1 ou MAGE-C1 (ou ambas) tem um papel funcional bona fide no centrossoma (isto é, NY-ESO-1 em células H146, Figura S1C, 2D). Por exemplo, inibidores de proteassoma prejudicar volume de negócios de proteínas centrosomal, afetando tanto a nucleação de microtúbulos e organização [60,61]. A presença quer de MAGE-C1 ou NY-ESO-1 (ou de ambos) a centrossomas pode modular as taxas e /ou a estabilidade dos factores essenciais lá de degradação. Os MHDs de vários membros da família MAGE interagir com tipo anel ligases de ubiquitina E3 (por exemplo TRIM28) e modulam ubiquitination [20]. Em MM, onde MAGE-C1 e NY-ESO-1 são frequentemente sobre-expressa, a amplificação do centrossoma é encontrado em ~ 30% dos casos e tem sido associada com a sobre-expressão de genes do CT da família MAGE [62]. Assim, um ganho de função efeito de NY-ESO-1 e /ou MAGE-C1 no centrossoma não pode ser excluída.
Um complexo documentada entre o NY-ESO-1 e MAGE-C1 significa que a localização de cada antigénio para centrossomas CT ou sua insolubilidade poderia ter sido dependente da interacção. No entanto, desde linhas de células que expressam individuais antigénios CT ainda acumulados no centrossomas após o tratamento MG132, uma interação não parece ser um pré-requisito. Isto foi confirmado usando SK-MEL-37 e células antigénio-alvo ARNi CT individualmente (Figura S3) e suporta um modelo no qual tanto o NY-ESO-1 e MAGE-C1 são intrinsecamente capaz de localização centrosomal independente. Além disso, as regiões que regulam esta localização poderia ser mapeado para AA 91-150 de NY-ESO-1 e aa 900-1116 de MAGE-C1. Esta região de NY-ESO-1 é parte de um “hot spot”, identificado aproximadamente entre os aminoácidos 80-110, para a resposta imune celular contra o NY-ESO-1 no cancro [37,63]. Uma vez que estes MHC de Classe I apresentou epitopos são os subprodutos da degradação do proteossoma, para identificar esta região como importante para a rotatividade e localização após tratamento MG132 é consistente. O MHD (aa 908-1106) de MAGE-C1 é conservada dentro da família MAGE mas apresenta pouca homologia com outros domínios conhecidos. Mesmo que a sua função ainda não está bem compreendida, a MHD para alguns MAGEs representa um sítio de interacção proteína-proteína [20,23]. Na verdade, MAGE-C1 parece ligar-se o NY-ESO-1 por meio de seu MHD [19,23,30]. Dois epítopos MAGE-C1 apresentados por moléculas do MHC-I em culas do MM são capazes de induzir uma resposta de células T CD8 +, [64] e os péptidos são derivados a partir da MHD (AA 959-968 e 1083-1091). A presença comum do MHD em todos os membros da família MAGE sugere que esta característica de MAGE-C1 pode ser relevante para a compreensão da resposta imunológica a outras proteínas da família MAGE.
No geral, nossos resultados destacam a nível de pós-translacional de regulação de NY-ESO-1 e MAGE-C1 que pode afectar a resposta imunitária contra células tumorais que expressam os antigénios CT. Estas observações são particularmente relevantes para MM. A utilização de inibidores de proteassoma por exemplo Velcade selectivos (/bortezomib) tem sido um grande avanço no tratamento de MM. Nós mostramos que os inibidores de proteassoma são susceptíveis de induzir a localização e acumulação de centrosomal insolúvel MAGE-C1 e NY-ESO-1 como parte de aggresomes em culas do MM. Que conseqüência fisiológica CT acumulação antigénio pode ter em MM ainda não está claro. Ambos MAGE-C1 e NY-ESO-1 são frequentemente expressas em mm (66% e 22% dos casos, respectivamente), com 93% de mielomas MAGE-C1-positivas que desencadeiem uma resposta imunitária humoral e celular detectável contra este antigénio [65, 66]. A acumulação de qualquer antigénio de CT (ou ambos) pode ser citotóxico e exacerbar o programa apoptótico resultante induzida por inibidores do proteassoma [67]. Nós se observou coloração reduzida MAGE-C1 no núcleo quando as células foram tratadas com MG132. Mielomas com núcleo-citoplasmática ou nuclear somente MAGE-C1 tem um pior prognóstico quando comparados com aqueles com MAGE-C1 apenas no citoplasma [27]. Embora a apresentação de antigénio seria comprometida, o CT localização antigénio restrito que resulta da inibição do proteassoma pode de fato contribuir positivamente para um melhor prognóstico. Este benefício potencial que deve ser ponderado contra os efeitos pleiotrópicos bem documentados sobre as funções celulares essenciais que surgem com a inibição do proteassoma. O papel central desempenhado pelo UPS em todas as células, incluindo as células tumorais, faz com que a definição de uma chave de janela terapêutica para a utilidade destes compostos. Mais estudos são necessários para determinar os papéis fisiológicos dos antigénios CT e as potenciais consequências para a eficácia da imunoterapia contra tumores que frequentemente expressam-los, como o melanoma, carcinoma do pulmão e mieloma múltiplo.
Materiais e Métodos
cultura de células, anticorpos e reagentes
melanoma humano (SK-MEL-37) [1] e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) linhas celulares (H146, HC33, H69, H209, H524, H889, e