Abstract

Fundo

Estudos de pacientes com distúrbios neurológicos paraneoplásicos (PND) revelaram que o tumor apoptótica serve como um potencial gatilho potente para o início de ocorrência natural imunidade tumor. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, segurança e imunogenicidade de uma vacina de células dendríticas apoptótica tumor autólogo (DC).

métodos e resultados

tumor PND

Temos modelado imunidade um ensaio clínico em que as células de tumor da próstata alogénica apoptóticas foram usadas para gerar uma vacina de células dendríticas autólogas de tumor-apoptótica. Vinte e quatro pacientes com câncer de próstata foram imunizados em uma Fase I, duplo-cego, randomizado, controlado por placebo, para avaliar a segurança e imunogenicidade da vacina. Vacinas foram segura e bem tolerada. Importante, também descobrimos que a vacina era imunogénica, induzindo respostas de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) e a proliferação de células CD4 + e CD8 + T, com nenhum efeito sobre FoxP3 + células T reguladoras. Um aumento estatisticamente significativo em respostas de proliferação de células T a células de tumor da próstata in

in vitro

(p = 0,002), diminuir de antigénio específico da próstata (PSA), inclinação (p = 0,016), e um aumento de duas vezes na PSA tempo de duplicação (p = 0,003) foram identificados quando comparamos os dados antes e após a vacinação.

Conclusões

uma vacina de células cancerosas por apoptose modelado em que ocorre naturalmente respostas imunes de tumores em pacientes PND fornece um cofre e vacina imunogénica do tumor. (Número ClinicalTrials.gov NCT00289341)

Registro de Estudos

ClinicalTrials.gov NCT00289341

Citation:. Frank MO, Kaufman J, Tian S, Suárez-Fariñas M, Parveen S , Blachère NE, et ai. (2010) Aproveitamento ocorrência natural imunidade tumoral: Uma vacina ensaio clínico em câncer de próstata. PLoS ONE 5 (9): e12367. doi: 10.1371 /journal.pone.0012367

editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 01 de março de 2010; Aceito: 22 de junho de 2010; Publicação: 01 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Frank et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Burroughs Wellcome e Doris Duke Foundation (MLA), os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (R01 CA85784 para RBD), do Hospital da Universidade Rockefeller Clínica e Prêmios Science Translational (CTSA) (conceder UL1 RR024143) da National centro de pesquisa de Recursos no NIH, o Fundo Memorial Misrock Leslie, e David H. Koch. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

imunidade do tumor em pacientes com distúrbios neurológicos paraneoplásicos (PND) foram estudadas com a esperança de princípios descobrindo que pode ser aplicado para a população geral de pacientes com câncer [1], [2]. Estes estudos demonstraram células tumorais específicas do antigénio CD8

+ T no sangue periférico de pacientes de PND [3], [4], mas também gerou um paradoxo. antigénios DPN são normalmente expressos no cérebro, e são ectopicamente expressa em tumores, mas não são expressos em células dendríticas (DC), que são necessárias para as respostas de células T naive primos. [5] Com base nas observações feitas com antigénios lúpus [6], a hipótese de que células em apoptose pode servir como um meio eficaz de transferência de antígeno em DCs e apresentação sobre MHC I para a activação de CD8 células

+ T [7]. Isto provou ser correcta para ambas tumoral [3] e antigénios virais [8], e é provável que a fagocitose de células apoptóticas servir como um meio geral pelo qual as pesquisas antigénios do sistema imunológico ao longo da vida. Insights de estudar a imunidade tumoral natural no PND fornecer uma base convincente sobre a qual para modelar estudos clínicos [2], [9], [10].

Várias observações apoiam a sugestão de que as células tumorais em apoptose pode servir como um potente fonte de antigénio para estimular a resposta imune do hospedeiro

in vivo

. Teoricamente, todas as potenciais antigénios tumorais dentro de uma célula de tumor, apoptose e múltiplos epitopos de cada antigénio, pode ser cruzada apresentados por DC, onde o antigénio processado pode ser colocado em todos os seis (tipicamente) alelos MHC I. Isto oferece vantagens consideráveis ​​em relação aos protocolos de DC pulsadas com péptido, em que o investigador deve ter conhecimento do antigénio tumoral e deve escolher péptidos MHC I-restritos específicos para a estimulação com antigénio. a apresentação de antigénios a partir de células apoptóticas foi estimada como sendo mais eficiente do que 10,000-50,000 péptido livre em carregar as moléculas de MHC de um DC [11], [12]. material de apoptótica é processado por uma via natural: células em apoptose são internalizados pelos receptores DC-restritas, incluindo a α

vp

5 integrina receptor [13], em seguida, processadas dentro de DCs por vias distintas [14]. Estas DCs em seguida, gerar tanto de MHC I e MHC de epitopos peptídicos II [13], que conduz à activação de ambos CD8

+ e CD4

+ células T. Uma vez que a capacidade das células apoptóticas apresentadoras transversais DCs para activar efectora CD8

células + T requer sinais a partir de células auxiliares T CD4 + [15], a capacidade do material apoptótico para ser carregado em ambas as moléculas MHC I e MHC II é de particular importância em considerar o seu potencial em imunoterapia.

DCs que apresentam células tumorais apoptóticos estimulam respostas de células T em animais e

in vitro

[16]. Clinicamente, vários estudos têm usado células tumorais mortas em ensaios de vacinas, incluindo glial [17] – [21], próstata [22], melanoma [23], de mama [24], ovário [25] e células de tumores sólidos pediátricos [26] (revisto em [9], [16], [27]). Estes estudos não têm incidido sobre a morte apoptótica de per si, mas sim mataram células de tumor por diversos meios (por exemplo, congelamento-descongelamento, ou grandes quantidades de UVB e irradiação gama), conduzindo a misturas incompletamente caracterizado de morte celular por necrose e apoptose. A interpretação destes estudos é complicada pela controvérsia em relação à potência imunogénica de diferentes formas de células mortas [28]. No entanto, alguns estudos têm indicado o potencial de respostas imunológicas e clínicas para autólogo DC apresentando células tumorais mortas [19], [23]. Aqui nós nos propusemos a testar mais precisamente a relação entre a indução de respostas imunes tumor PND-like e desenvolvimento de uma vacina contra a clínica. Nós induzida morte apoptótica de células de cancro de próstata LNCaP, e permitiu-lhes ser fagocitados pelas DCs autólogas geradas a partir de monócitos do sangue periférico dos pacientes com cancro da próstata; tais DCs foram mostrados anteriormente para estimular tanto CD8

+ e CD4

+ células T

in vitro

[29], e em um B16 DCs modelo melanoma rato cross-apresentando tumor apoptótica foram eficazes na prevenção crescimento do tumor (Blachere et ai., dados não publicados). Aqui nós relatamos a segurança e imunogenicidade de DC /células tumorais LNCaP próstata apoptóticos em um estudo controlado de pacientes com câncer de próstata 24.

Resultados

Estudo da População

Vinte e quatro consecutivos pacientes elegíveis foram vacinados com DC /LNCaP, juntamente com as vacinas de controle. Um total de 28.4-78.9 milhões de células de tumor (média 50,3 milhões) DCs apresentadoras transversais LNCaP apoptótica foram dadas por paciente, ao longo de 4 doses divididas, cada intervalo de 2 semanas (Figura 1). No momento da entrada no estudo, 11 dos 12 pacientes no braço 1 e 10 de 12 pacientes no Braço 2 tinha apenas recidiva bioquímica com nenhuma outra evidência de doença metastática (Tabela 1). A idade média dos pacientes foi de 62,5 ± 6,7 e 65,7 ± 9,2 anos ea média de pontuação de Gleason no início do estudo foi de 7,25 e 7,17 nos braços 1 e 2, respectivamente.

Os pacientes foram selecionados e divididos aleatoriamente em 1 de 2 braços , cada um com 12 pacientes. Os pacientes em ambos os braços eram cegos durante as fases de vacina /placebo até a semana 8. Os pacientes no braço 1 prossegue na fase de pós-vacina, enquanto as pacientes do Braço 2 atravessou para a fase de vacina antes de entrar em fase de pós-vacina.

características da vacina DC

DCs foram co-cultivados com LNCaP ou células LNCaP-M1 que eram 90% de apoptose (Figura 2). Todas as preparações vacinais DC administrados preencheram os critérios para a viabilidade e maturidade (Tabela 2 e Figura 2). função DC foi monitorizada por alo-MLR; DC estimuladas 2 × 10

5 células T alogeneicas para incorporar ≥10

5 CPM de

3H-timidina no dia 5 depois de 18 horas

pulso de timidina 3H (dados não mostrados).

irradiação UV (+ UV) induziu apoptose especificamente em células LNCaP, tal como indicado por 96% Caspatag TOPRO + + 38 horas após a coloração de UV. DC co-cultivadas com células em apoptose LNCaP (vacina) são maduros, com 96% de células positivas CD83. Os dados apresentados são representativos de todas as 24 vacinas preparadas.

Segurança

A incidência de injecção local e reações sistêmicas à vacina são apresentados na Tabela 3. Nenhuma vacina relacionada grave foram observados eventos adversos. Apenas 1 toxicidade foi significativamente diferente entre os grupos placebo e vacinas na fase cega única do estudo: grau 1 ou 2 reações injeções do site que ocorreram em 11 dos 12 pacientes no grupo da vacina (p 0,001), atribuível à vacina (mas não placebo) geração de respostas de DTH semelhantes. Não houve evidência sintomático da doença auto-imune em qualquer doente, incluindo vasculite, tiroidite, colite, doença neurológica, endocrinopatia ou cardiomiopatia.

A resposta imune

Todos os pacientes que receberam o DC /vacina hemocianina de lapa (KLH) apresentaram uma resposta DTH positiva a KLH. Nenhum dos 24 pacientes tinham uma resposta ao lisado de LNCaP na linha de base (semana 0). Todos os 24 pacientes foram dadas LNCaP lisado como parte de painéis de DTH nas semanas 3, 5, 7 e 9. Dezesseis dos 24 pacientes (67%) tiveram uma resposta DTH para LNCaP lisado em pelo menos 1 destes 4 pontos de tempo, com o proporção mais elevada dos doentes (54,2%) de responder ao lisado de LNCaP em 2 semanas após o último reforço (9 semanas). As respostas foram mantidas em 9 dos 13 pacientes (69%) em 22 semanas após o último reforço (Semana 29, figura 3). As respostas ao lisado de LNCaP foram estatisticamente significativa em todos os pontos de tempo com um intervalo de confiança de 95%. soro fisiológico normal, dado como um controle, foi negativa em todos os momentos em todos os pacientes.

vacina induziu resposta DTH para lisados ​​celulares LNCaP injetado por via intradérmica foram medidos nos horários indicados. Semana 1 foi de linha de base, em que não há tempo os pacientes tiveram respostas de DTH (dados não mostrados). respostas de DTH foram considerados positivos em ≥5 mm eritema lido às 48 horas após a colocação. As barras indicam o número de pacientes com respostas positivas em cada ponto de tempo. As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%. A linha a tracejado representa tendência da percentagem de doentes com respostas positivas em cada ponto de tempo. respostas de DTH positivos estatisticamente significativos para ligado celular LNCaP apareceu na Semana 3 (ponto primeira vez depois da linha de base) e as respostas ainda estavam presentes em 9 dos 13 pacientes (69%) em 22 semanas após a última dose de reforço (Semana 29).

a

ensaio de proliferação de timidina 3H foi utilizado para avaliar a reactividade das células T à proteína KLH e para células de tumor da próstata (ambos os utilizados na vacinação (LNCaP) ou para outra linha de células de tumor da próstata (PC3) ). antígenos de controlo negativo incluído monócitos autólogos e uma linha de células irrelevantes (3T3). 3T3 infectadas com gripe foi usada como controlo positivo. As células T foram recolhidos na semana 0 (pré-vacinação) leucaferese e na semana 13 (pós-vacinal) leucaferese (Figura 1). Para ser válida, cada ensaio de proliferação indivíduo deve ter tido uma pré-resposta influenza detectável e pós-vacina. Dois dos 24 pacientes não tiveram resposta detectável da gripe e, assim, foram excluídos da análise. Os 22 pacientes avaliáveis, considerados como um grupo, tinham diferença estatisticamente significativa na resposta das células T à gripe, pré-vacina contra o poste (P = 0,310, dados não mostrados). Houve uma resposta estatisticamente significativa das células T a KLH pós-vacina contra o pré-vacina (p = 0,008), bem como a apoptose LNCaP (p = 0,017) e as células tumorais PC3 apoptóticas (p = 0,011) (Figura 4A). Não houve diferenças estatisticamente significativas na pré-vs respostas de células pós-vacinal T para células apresentadoras de antígenos (APCs) sozinho (p = 0,160), para controlar antígenos, 3T3 (p = 0,070) ou monócitos autólogos (p = 0,156) (Tabela 4, a Figura 4a e dados não mostrados).

Comparação das respostas de células T grandes quantidades pré- e pós-vacina para antigénio da próstata. uma. células tumorais apoptóticas (LNCaP e PC3, ou uma linha celular irrelevante (3T3)) ou proteína KLH foram co-cultivadas com o paciente monócitos do sangue periférico e células T singeneicas granel obtidos a partir de pacientes pré ou pós-vacinação. Os monócitos sem antigénio exógeno (n Ag) ou células 3T3 apoptótica (Ctrl Ag), serviram como controlos negativos. A proliferação foi avaliada no dia 5 após uma de 18 horas

pulso de 3H timidina. Os dados são apresentados em 22 de 24 pacientes. A diferença na proliferação (pós- menos pré-vacina) para cada grupo de antigénio é mostrado em gráficos de caixas. Os valores reportados são contagens médias por minuto (CPM) de poços em triplicado. A diferença mediana para cada grupo de antigénio é mostrado pela linha na caixa. Cada paciente que é um outlier é indicado por um símbolo único. Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na pré-vacina contra a resposta proliferativa das células T pós-vacina para KLH (p = 0,008), LNCaP (p = 0,017) e PC3 (p = 0,011). b. As células T em massa obtida pós-vacinação foram coradas com CFSE e cultivados com antígenos próstata apresentadoras cruz DCs, LNCaP e PC3, ou uma linha irrelevante celular (células 293, Ctrl Ag). A proliferação celular no dia 5, avaliada por diluição corante CFSE, é mostrada no eixo dos x e expressão de CD8 é mostrado no eixo dos y. Percentagens indicadas representam as células CD8 + que dividiram dentro da população de células T em massa. Quatro de cinco pacientes adicionais testados apresentaram CD8 + respostas semelhantes; os dados apresentados são para o paciente # 15.

Com base nos dados de DTH (Figura 3) e o

dados proliferação 3H timidina (Figura 4a), foi calculado e classificado como um índice de DTH e um índice de proliferação para determinar se houve uma associação entre os dois. Uma correlação positiva foi encontrada (0,55 usando o teste de correlação de Spearman (p = 0,008)), indicando que os pacientes que tiveram respostas de DTH positivas para LNCaP lisado também tendem a ter respostas de proliferação de células T a células LNCaP apoptóticos

in vitro

.

A resposta de proliferação foi também avaliada por ensaio de diluição de corante CFSE [30]. Em cinco de seis pacientes, foi observada uma resposta de células T CD8 + específicas para antigénios da próstata (Figura 4b e dados não mostrados). Nós confirmamos que todos os seis pacientes testados também tinha uma resposta de células CD4 + T aos antígenos próstata.

Nós consideramos a possibilidade de que o aumento da proliferação de células T resposta pós vacinação poderia se relacionar a um declínio nas células T reguladoras em circulação. Para determinar a percentagem de células T CD4 + que são células T reguladoras em amostras de sangue de pré e pós-vacinados, os PBMCs foram coradas e avaliadas quanto à expressão de Foxp3 (Figura 5). Não houve diferença (p = 0,924) foi encontrada na expressão Foxp3 comparando células pré e pós-vacinação T CD4 + de 15 pacientes (Tabela 4).

a. perfil FACS de expressão Foxp3 no sangue pré e pós-vacinados periférica com delimitação de linfócitos T CD4 +. Um paciente representante (# 13) é mostrado. b. Os diagramas de caixa da percentagem Foxp3 + células (fechado em células CD4 + T) pré e pós-vacinação em 15 pacientes representativos, incluindo aqueles em toda a gama de respostas proliferativas e alterações na inclinação PSA. A mediana é mostrado pela +. Outliers são indicados por •. Não foi observada diferença na pré-vacina contra a expressão de células T pós-vacinal de Foxp3 (p = 0,924).

PSA resposta

O antígeno específico da próstata tempo de duplicação (PSADT) foi calculado para cada paciente durante cada fase de estudo. A mediana tempo de duplicação durante a fase de pré-vacinal foi de 4,5 meses, e este número aumentou para 5,4 e 8,9 meses durante os vacina e pós-vacinais fases, respectivamente. Houve diferenças estatisticamente significativas na PSADT entre as fases pré e pós-vacina (p = 0,003) e entre as fases de vacinas e pós-vacina (p 0,001), mas não entre as fases pré-vacinais e vacinas (p = 0,915) .

também comparamos a inclinação da subida PSA entre as 3 fases do estudo. Dezoito dos 23 (78%) pacientes avaliados tiveram uma diminuição no inclinação PSA entre as fases pré e pós-vacinais. Ao considerar todos os 23 pacientes, houve uma diminuição estatisticamente significativa na inclinação PSA entre os pré-vacina e pós-vacinais fases de -0,093 /mês (p = 0,016, Figura 6 e Tabela 5). Não houve diferença estatística na inclinação PSA entre os pré-vacinais e vacinas fases (-0,018 /mês, p = 0,681) ou as fases de vacinas e pós-vacina (-0,075 /mês, p = 0,098). Nós avaliamos se esta mudança inclinação PSA pode resultar do desenvolvimento de anticorpos anti-PSA no soro. Antes e no soro pós-vacina foi avaliada por medição da reactividade dos anticorpos do soro para a proteína de PSA purificado por transferência de Western, utilizando anticorpos monoclonais de PSA como um controlo positivo. Não foi encontrada nenhuma evidência de reactividade do anticorpo para o PSA (dados não mostrados). No entanto, não se pode descartar que os anticorpos não são detectáveis ​​devido ao antígeno /anticorpo complexos sendo formados e que estes alguma forma ajudou na limpeza PSA do soro.

Gráfico do log médio

2 (PSA) inclinação por fase de estudo (linha sólida); para comparação, uma extrapolação de log média do pré-vacinação

2 (PSA) inclinação é mostrado (linha pontilhada). Com base no modelo de spline linear, a variação média de inclinação PSA de 23 pacientes de pré fases de pós-vacinais é -0,093 /mês (p = 0,016). os valores de PSA de um paciente não foram incluídos na análise, como seus valores pré-vacinais foram afetadas por outro tratamento perto do início da participação no estudo. Três outros pacientes começaram a outro tratamento durante ou após a vacinação; os valores de PSA obtidos após este ponto não foram incluídos na análise

Em seguida, estratificada da população do estudo, com mais dois efeitos fixos em um modelo misto e realizou um teste da razão de verossimilhança.; os doentes que tiveram uma resposta de DTH ao lisado de LNCaP teve uma variação PSA inclinação significativamente diferente quando comparado com aqueles que não tiveram resposta de DTH ao lisado LNCAP (p = 0,004). Dezasseis dos 24 pacientes apresentaram respostas de DTH para LNCaP em, pelo menos, um ponto de tempo. Este grupo de pacientes teve uma variação estatisticamente significativa na inclinação PSA entre as fases pré-vacinais e pós-vacina (-0,105 /mês, p = 0,020, Tabela 6). Oito dos 24 pacientes não tiveram resposta a LNCaP ligado em qualquer ponto do tempo, e esses pacientes não teve alteração estatisticamente significativa na inclinação entre as fases pré e pós-vacina (-0.033 /mês, p = 0,631). Quando estratificada da população do estudo em 2 grupos com base no valor de PSA no início do estudo, o teste da razão de verossimilhança indicou uma mudança PSA inclinação significativamente diferente entre os dois grupos (p 0,001). Com o modelo misto, descobrimos que aqueles que tinham uma PSA ≥1 ng /ml no início do estudo (15 pacientes) tiveram uma mudança significativa PSA inclinação entre a fase pré para pós-vacina (-0,099 /mês, p = 0,031, Tabela 6) enquanto o grupo de pacientes que tinham um PSA 1 ng /mL na entrada do estudo (8 pacientes) não o fizeram (-0,078 /mês, p = 0,279). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que os pacientes do estudo tomado como um grupo tiveram uma redução significativa na taxa de aumento do PSA após a vacinação, e que este efeito foi particularmente evidente nos doentes com resposta imunológica e doenças mais facilmente mensurável.

Discussão

Os pacientes com PND desenvolver tumor supressão eficaz de tipos de câncer comuns [2] que são susceptíveis de ser desencadeada por reconhecimento imunológico da expressão ectópica de proteínas neuronais por esses tipos de câncer. Para acionar tais respostas imunes, a hipótese e demonstrou que o tumor apoptótica serve como uma poderosa fonte de antígeno para apresentação por APCs [7], [29]. O foco deste estudo foi avaliar a segurança e imunogenicidade de imitar este meio de desencadear imunidade tumoral utilizando DCs dos pacientes com câncer de próstata cross-apresentando células tumorais apoptóticos como uma vacina contra o câncer.

Apesar da ligação conceptual entre a desenvolvimento de células em apoptose como uma vacina e imunidade tumor no PND, não encontramos nenhuma evidência de que esta abordagem desencadeada doença auto-imune em nossos pacientes. Fizemos notar pequenas elevações ANA postar vacina em 5 pacientes (título de 1:160 em um paciente, ≤1:80 em quatro pacientes) que recuperaram ao longo do tempo em 4/5 pacientes. No entanto, também notar-se que de 7 pacientes com níveis detectáveis ​​ANA pré-vacinação, 5 tornou-se menor depois de vacinação. A análise estatística dos ANA muda pré ante pós vacina /placebo em Braço 1 versus Arm 2 não revelou diferenças significativas (teste exato de Fisher), e concluímos que as mudanças ANA não foram clinicamente significativa; Além disso, essas respostas transientes têm geralmente sido visto em vacinas baseadas DC [26], [31], [32]. Uma razão que escolhemos o câncer de próstata como um tumor inicial para o estudo usando esta abordagem vacina é que esses tumores são raramente associada à PND. Apesar da segurança da vacina aqui, é preciso tomar cuidado em estender esta abordagem para pacientes com tumores que se sabe estarem associados com PND (para tumores exemplo ginecológicas que expressam a CDR2 ou antigénios Nova e cancros pequenas do pulmão de células que expressam o antigene Hu) [1], [2].

A nossa vacina tumor de células dendríticas /apoptótica foi imunogênica. Sessenta e sete por cento dos pacientes desenvolveram respostas de DTH aos antígenos LNCaP. Além disso, essas respostas de DTH foram positivamente correlacionados com pós-vacinais respostas de proliferação de células T em massa. Este alto nível de imunogenicidade foi semelhante à relatada em outros estudos de células associada vacinas DC pulsadas com péptido ou tumorais. Mais importante, estas respostas incluíram as respostas de células T CD8 + para as células de tumor da próstata (Figura 4b). Isto é significativo, como um determinante crítico de vacinas contra tumores de sucesso é provavelmente a indução de respostas de células T CD8 + [33]. A capacidade para detectar estas respostas aqui é consistente com a observação de que a apresentação cruzada de células apoptóticas são capazes de estimular respostas naive e de memória de células T CD8 + para as células tumorais de células [3] ou infectadas por vírus [8]

ex vivo

. Devido à natureza da doença, as células tumorais autólogas não estavam disponíveis para as respostas de células T de teste. No entanto, ambas as respostas de proliferação de células CD4 e CD8 foram detectados às linhas de células de tumor da próstata, apesar das elevadas respostas de fundo observados em células T após a vacinação (Figura 4a). Tais respostas fundo têm sido vistos antes em vacinas baseadas em DC e são de etiologia incerta [34], e pode ser refletido em aumentos transitórios da ANA observados em alguns pacientes. É provável que os doentes tiveram respostas imunológicas à vacinação tumoral variáveis, quer resultantes de diferenças intrínsecas no repertório imunológico, ou a partir de medidas do tumor em si para modificar as respostas imunitárias dos pacientes [35].

De forma significativa, verificou-se que o PSA pistas diminuiu e PSADT aumentada após vacinação na nossa população de doentes em geral (P = 0,016). Colocámos a hipótese de que se esta correlação foi relacionada com a imunogenicidade da vacina, as alterações de PSA deverá estar presente no subgrupo de doentes que mostram resposta imunogénica à vacina, mas não para aqueles que não o fazem. Na verdade, os pacientes que tiveram respostas de DTH para LNCaP após a vacinação teve reduções significativas na inclinação PSA (p = 0,020), em comparação com pacientes que não tiveram respostas de DTH (p = 0,631). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que as mudanças observadas na inclinação PSA representam uma resposta imune às células tumorais de pacientes

in vivo

.

Embora imunológica variável e respostas clínicas foram relatados para vacinas usando tumor mortos células como uma fonte de antigénio, estes estudos não têm focado na utilização de populações puras, bem definidas de células tumorais apoptóticas. Utilizou-se irradiação UV-B para induzir a morte apoptótica (não necrótico) em 90% da linha de células de próstata usado para a vacina; no entanto, o nosso perfil de efeitos colaterais foi muito baixa, semelhante a outras vacinas tumorais. A maior parte dos outros estudos têm utilizado a irradiação gama ou por congelamento-descongelamento, a geração de misturas variáveis ​​de células apoptóticas e necróticas, os quais podem estar subjacentes diferenças de potencial imunogénico [28].

Tomados em conjunto, os resultados apresentados neste estudo fornecem segurança inicial e dados de imunogenicidade para uma vacina imitando o que acreditamos ser um gatilho crítico para a ocorrência natural respostas imunes tumorais eficazes observados em pacientes PND. Estas respostas correlacionam-se com uma resposta clinicamente relevante para tumorais do doente, tal como avaliado por efeitos altamente estatisticamente significativas na inclinação de PSA e tempo de duplicação. Estas observações sugerem que esta abordagem de vacinação garante uma maior exploração como um meio seguro e potentes de desencadear tumor resposta imune na população geral de pacientes com câncer. modificações futuras vacinas a serem considerados são a adição de adjuvantes imunológicos, durante a preparação da vacina ex vivo ou em conjunção com a administração da vacina in vivo, [9], [36], ou a utilização de tumor autólogo como fonte de antigénio apoptótica. Além disso, um meio seguro de vacinar contra próstata (ou outros) cancros podem servir de forma sinérgica com outros agentes imuno-estimulantes, tais como CTLA4-Ig, que são mostrando promessa em imunoterapias combinados de próstata [37] e outros cancros [ ,,,0],38]

Métodos

O protocolo para este ensaio e apoiando lista de verificação CONSORT estão disponíveis como informação de apoio.; veja Checklist S1 e Protocolo S1.

Pacientes e Estudo Design by

Declaração de Ética.

O estudo foi aprovado pela Universidade Rockefeller Institutional Review Board (RDA-0466) eo FDA (IND 10710). consentimento por escrito foi obtido de todos os pacientes. Não

de novo

linhas celulares foram gerados neste estudo

Design Estudo

O estudo foi realizado na Universidade Rockefeller, em Nova York..; vinte e quatro pacientes com idades entre 53-81 foram inscritos entre Novembro de 2003 e Fevereiro de 2006. Todos os autores atestar a integridade e precisão dos dados e sua análise e participaram da elaboração do artigo.

Vinte e quatro pacientes foram aleatoriamente atribuídas a um de dois braços para efeitos de avaliação da segurança da vacina, o nosso objectivo primário (Figura 1). Todos os pacientes eram cegos. Doze pacientes designados para o Braço 1 recebeu vacina, seguido de 3 impulsos de vacina em intervalos de duas semanas, para um total de quatro injecções ao longo de oito semanas, e foram unblinded após o último reforço. Doze pacientes designados para Braço 2 receberam placebo (veículo (DMSO a 5% em solução salina)) para cada uma das quatro injecções, foram não cego, cruzado até a fase de vacina, e recebeu vacina, seguido de 3 impulsos a intervalos de 2 semanas. Após o último reforço, os pacientes em ambos os grupos foram acompanhados por até 22 semanas. Todos os pontos de tempo em ambos os braços para cima, e incluindo, o dia da primeira vacinação com a vacina DC foram considerados fase de pré-vacina. Todos os pontos de tempo a partir do primeiro reforço através da primeira visita de acompanhamento após a vacinação final (semana 9) foi considerada fase vacina. Todos os restantes pontos de tempo do estudo foram considerados como fase de pós-vacina. Os dados de segurança foi comparada entre os 2 braços do estudo, enquanto os dados imunes e PSA foram avaliadas por comparações feitas entre as fases pré e pós-vacinais em todos os 24 pacientes.

Seleção de Pacientes e vacinação.

Os pacientes eram elegíveis para participar se eles forneceram consentimento informado, tinha câncer biópsia comprovada de próstata e doença progressiva: PSA documentado estar a aumentar em 3 ocasiões, quer apesar níveis de castração de testosterona (abaixo de 50 ng /dl) ou, apesar de terapia local definitiva (prostatectomia , radiações, etc). Os critérios de exclusão incluíram terapêutica prévia biológico com as células dendríticas, doença auto-imune, ou doença de órgão major significativo.

vacinas DC foram dadas em conjunto com painéis de DTH e os pacientes foram cuidadosamente observados durante uma hora. Os pacientes retornaram para a clínica em 48 horas, altura em que foram examinados clinicamente e as suas respostas de DTH foram lidas. As vacinas foram administradas a uma dose de células que varia 2-10 × 10

6 DCS /vacinação, administrada por via subcutânea na face interna da parte superior do braço, aproximadamente 6-8 cm a partir dos nodos linfáticos axilares. Os pacientes receberam um priming e três vacinações de reforço quinzenais. Durante as duas primeiras injecções, os pacientes também receberam 2-10 × 10

6 DC /KLH.

Vaccine

Vaccine foi fabricado em uma instalação BSL-2 mantido e auditoria independente para atender especificações Tissue de boas Práticas. Para preparar as DCs autólogas, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidos por leucaferese, aderida à endotoxina pratos de cultura de tecidos livres (Falcon), e diferenciadas

In vitro

a imaturas DC ao longo de seis dias em meio RPMI-1640 suplementado com 1% de plasma autólogo, GM-CSF (180 ng /ml; Bayer HealthCare Pharmaceuticals) e IL-4 (10 mg /mL; R D Systems) como descrito [29], [39]. células tumorais da próstata LNCaP foram obtidas a partir da cultura celular Tipo americano e um banco de células foi feita e rastreados por BioReliance Corporation (Rockville, MD), para impedir a contaminação ou agentes adventícios. células LNCaP do estoque mestre (congeladas em meio AIM V (Invitrogen) mais soro isento de BSE fetal bovino (FBS a 20%; Hyclone) e 5% de DMSO (Edward Life Sciences)) foram expandidas em meio AIM V /1% FBS, e as células foram tratadas com irradiação com UV-B de tal modo que 90% de células foram submetidos a morte apoptótica (Caspatag positiva, como descrito [29]). DCs imaturas e apoptóticos de LNCaP foram co-cultivadas a uma razão de 1:01 para 36-48 horas na presença de PGE 2

(20 mM; Sigma) D systems; e TNF-a (150 ng /mL; R para passar critérios de liberação a fração de células HLA-DR (DC) tiveram que ser 70% CD83 +, 15% CD14 + e 20% iodeto de propídio (PI) + (Serologicals). Todos os anticorpos foram adquiridos da BD Pharmingen. A esterilidade foi testada por coloração de Gram, por cultura de contaminação bacteriana e fúngica (BacT /ALERTA, Biomereux), e por fluorocromo ADN para micoplasma (Bionique Testing Laboratories, Inc.). O método de LAL (Associates of Cape Cod) foi utilizado para testar a endotoxina. O produto final foi dividida em 4 alíquotas iguais, cada uma contendo 2-10 × 10

6 DCs cada.