Abstract

As anomalias cromossómicas fornecer utilidade clínica no diagnóstico e tratamento de doenças hematológicas, e podem ser preditivos de maligna transformação em indivíduos sem quadro clínico aparente de um cancro hematológico. Em um esforço para confirmar relatórios anteriores de uma associação entre mosaicismo clonal e câncer hematológico incidente, foi aplicado o algoritmo anomDetectBAF para chamar anomalias cromossômicas em dados de genótipos de Estudos realizados anteriormente Genoma larga associação (GWAS). Os genótipos foram inicialmente recolhidos a partir de ADN derivado do sangue periférico de 12.176 participantes no estudo Grupo Eletrônico de Saúde Medical Records e Genomics (emerge) e da Iniciativa de Saúde da Mulher (WHI). Detectamos mosaicismo clonal em 169 indivíduos (1,4%) e grandes eventos mosaico clonais ( 2 mb) em 117 (1,0%) indivíduos. Apesar de apenas 9,5% dos portadores do mosaico clonais teve um diagnóstico de cancro incidente hematológica (mieloma múltipla, síndrome mielodisplásica, linfoma ou leucemia), os transportadores tinha um IC 5,5 vezes risco aumentado (95%: 3,3-9,3; p = 7,5 × 10

-11) de desenvolver esses tipos de câncer posteriormente. Portadores de grandes anomalias mosaico mostrou risco particularmente pronunciada de leucemia subseqüente (HR = CI 19,2, 95%: 8,9-41,6; valor p = 7,3 × 10

-14). Assim que confirmar de forma independente a associação entre mosaicismo clonal detectável e câncer hematológico encontrados anteriormente em duas publicações recentes

Citation:. Schick UM, McDavid A, Guindaste PK, Weston N, Ehrlich K, Newton KM, et al. (2013) Confirmação da Association of Clonal mosaicismo cromossômico com um risco aumentado de cancro da Incident hematológicas. PLoS ONE 8 (3): e59823. doi: 10.1371 /journal.pone.0059823

editor: Jose Angel Martinez Climent, da Universidade de Navarra, Centro de Investigação Médica Aplicada, Espanha |

Recebido: 23 Março, 2012; Aceito: 21 de fevereiro de 2013; Publicação: 22 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Schick et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A inicial ADPR foi financiado pela U01AG06781 eo estudo inicial ACT também é financiado pelo U01AG06781. O estudo emergem foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) prêmio HG004610, AG06781 (Group Health Cooperative). Genotipagem de emergir amostras foi financiado pela U01HG004438 concessão. O programa WHI é financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute, NIH, do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos por meio de contratos N01WH22110, 24152, 32100-2, 32105-6, 32108-9, 32.111-13, 32115, 32118 -32119, 32122, 42107-26, 42129-32, e 44221. os autores agradecem os investigadores do WHI e funcionários por sua dedicação, e os participantes do estudo para tornar o programa possível. Uma lista completa de investigadores do WHI podem ser encontradas em: https://www.whiscience.org/publications/WHI_investigators_shortlist.pdf. estudo de câncer colorretal WHI GECCO foi financiado pela U01CKA137088 e R01CKA059045. Os autores gostariam de agradecer o apoio do Collaborative Research Group GRANDADA. apoio financeiro para WHI-GRANDADA foi fornecido através do NHGRI Genómica e ensaios randomizados Network (GARNET) (Grant Número U01 HG005152). Assistência com harmonização fenótipo e genótipo de limpeza, bem como com a coordenação geral do estudo, foi fornecido pelo Centro Coordenador de romã (U01 HG005157). Financiamento suporte para genotipagem, que foi realizado no Instituto Broad do MIT e Harvard, foi fornecido pelos genes NIH, Meio Ambiente e Saúde Initiative [GEI] (U01 HG004424). Suporte adicional para UMS autor foi fornecido pela concessão R25CA094880 do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cromossómico mosaicismo é a presença de diferenças no teor cromossómico de células no mesmo indivíduo, derivada de um único zigoto [1]. O calendário do evento mutacional em influências de desenvolvimento tanto a extensão e os tipos de células do mosaico (somáticos e /ou germinal) [2]. Uma mutação de pós-zigótico precoce pode resultar em mosaicismo cromossómica em células somáticas, células germinais, ou, ocasionalmente, ambos os tipos celulares [2], ao passo que eventos que ocorrem mais tarde na vida tendem a ser restringida a uma linhagem celular particular, [3]. Mosaicismo cromossômico contribui para a diversidade inter-individual e é uma causa comprovada de hipopigmentação da pele [4], abortos espontâneos [5] – [7], defeitos de nascimento [8], defeitos cognitivos e desenvolvimento do cérebro [9], [10] e vários tipos de câncer [11] – [13], incluindo cânceres hematológicos [3], [14], [15]

cancros hematológicos são um grupo heterogêneo de condições neoplásicas afetam o sangue ou tecidos formadores de sangue.. dados observacionais sugerem que cerca de metade dos pacientes com cancros hematológicos abrigar anormalidades cromossômicas clonais [15], que frequentemente caem em locais característicos ao longo do genoma [3], [15] – [18]. Notavelmente, cromossômico aneuploidia tais 20q-, 13q-, 11q-, 17p-, 12+ e 8+ são comumente observados em indivíduos afetados [3], [15]. Clinicamente, a identificação de aberrações cromossómicas é importante em oncologia hematológica para o diagnóstico, prognóstico, tratamento e acompanhamento [19], [20].

Dois estudos recentes de base populacional identificaram uma associação entre mosaicismo cromossômico clonal ( duplicações, deleções e copiar perda neutra de heterozigosidade) detectadas em dados de matriz SNP do genoma e cancros hematológicos incidente [3], [15]. Empregando o método de detecção de uma anomalia previamente descrito por Laurie et al. [3], foi realizada uma investigação independente que procura quantificar a associação entre o mosaico e hematológicas cancros cromossómicas detectáveis ​​em amostras genotipadas através dos registros médicos eletrônicos e de rede Genomics (emerge) e Iniciativa de Saúde da Mulher (WHI). mosaicismo detectável identificada por este método requer uma proporção relativamente elevada de células com o mesmo cariótipo anormal (estimado em 5-10% de células anormais [3]), assim, enfatizamos ao longo do texto que nosso estudo é limitado a apenas o mosaicismo nós são capazes de detectar. Este trabalho encontra associação entre mosaicismo clonal detectável e câncer hematológico incidente, consistente com os estudos anteriores.

Resultados

A nossa população de estudo de 12.176 indivíduos de ascendência predominantemente européia tinha sido previamente genotipados pela WHI e a rede emergem para uso em estudos de demência, fraturas de quadril, cancro colorectal, e metabólico e resultados cardiovasculares (Tabela 1) caso-controle. As amostras de DNA foram extraídas de amostras de sangue recolhidas na ou próximo à linha de base para o primário do estudo e foram genotipados em uma plataforma Illumina. idade do participante no início do estudo variou de 50-89 anos, com uma média de idade entre os estudos de 69 anos (Tabela 1, Figura S1). Os participantes elegíveis necessário para ter chamadas de genótipos de alta qualidade e ser livre de câncer hematológico na linha de base, entre outros critérios, consulte Métodos. A maioria dos indivíduos (60%) tinham mais de uma década de acompanhamento, com todos os participantes elegíveis que tem pelo menos um ano de follow-up.

autossômica mosaicismo cromossômico clonal foi detectada em 1,4% ( n = 169) dos 12.176 indivíduos genotipados através dos estudos emergem e WHI. Mosaicismo foi mais freqüente entre os 229 indivíduos com um cancro hematológico incidente de qualificação (definição de caso na Tabela S1 S1 Arquivo), com 7,0% dos casos abrigar uma anomalia, em mosaico detectável. Freqüência de anomalias mosaico foi observado a aumentar com a idade na coleta de amostras, variando de 0,9% para indivíduos com menos de 60 anos de idade no início do estudo para 2,7% para indivíduos acima de 79 anos de idade (Figura S2). Também pode haver a sugestão de uma relação entre a idade de coleta e anomalia comprimento (Figura S3).

A maioria detectados eventos de mosaico eram grandes (tamanho médio = 9,4 megabases, MB). Das anomalias mosaico detectados em sujeitos do estudo, 8,0% de anomalias foram ganhos, perdas de 41,5% e 50,5% cópia perda neutra de heterozigosidade (CN LOH) (Tabela 2). comprimentos médios de anomalias foram 1,8 Mb para perdas mosaico, 30,3 Mb para eventos neutros e 37,8 Mb para ganhos de mosaico. características Resumo da variação estimada de cópia (ganho, perda, CN LOH), tipo cromossômica (acrocêntrico, metacentric), localização cromossômica, e distribuição de mosaico para anomalias não-mosaico são plotados na Figura 1 A, B, C, D, respectivamente.

) métricas BAF e LRR para anomalias de mosaico por variação estimada cópia de estado disomic (vermelho = perda, azul escuro = ganho, = laranja copiar perda neutra de heterozigosidade. B) métricas A BAF e LRR anomalias mosaico por localização (azul escuro = intersticial, turquesa = terminais p, terminais rosa = q ou cromossómicas vermelho = inteiro). C) métricas BAF e LRR para anomalias de mosaico por tipo de cromossomo (círculo verde = acrocêntrico, cruz roxa = metacentric). D) BAF e LRR métricas de mosaico (vermelho) e não-mosaico (preto) anomalias.

anomalias mosaico inteiro cromossômicas foram detectadas nos cromossomos 8 (1 CN LOH, 2 ganho), 12 (2 ganho), 13 (1 CN LOH), 14 (1 CN LOH), 15 (3 ganho), 17 (1 CN LOH), 19 (1 ganho) e 22 (1 CN LOH). anomalias cromossómicas toda mosaico representou apenas 6,5% das anomalias detectadas, enquanto a maioria das anomalias detectadas mosaico eram ou intersticial (60,0%) ou terminal (33,5%). Todos os eventos de mosaico são mostradas graficamente por cromossoma na Figura 2 e informações adicionais sobre as anomalias detectadas mosaico é fornecida nas Tabelas S2 S3 em S1 Arquivo.

A caixa vermelha em torno do ideograma representa a região de interesse para o enredo localizado abaixo. Cromossoma 21 é omitido devido à ausência de anomalias detectadas mosaico no cromossoma. (Nota: Os terrenos não estão em escala)

regiões recorrentemente excluídos incluídos 2p, 4T, 13q, 17q e 20q, que freqüentemente sobreposto com genes que tenham sido previamente associados ao câncer hematológico (Figura 2. ). Em 2P existe uma região minimamente excluído de 751 quilobases (Kb) que é observado em 4 indivíduos. Esta região sobrepõe-se com a maior parte da DNMT3A

,

um gene mutado comumente no linfoma de células T e leucemia mielóide [21]. Perdas de 148 Kb no 4T, contendo o

TET2

gene, foram observados em 6 indivíduos. A perda de mutações de função do gene da

TET2

são recorrentemente observada em mielodisplasia, desordens mieloproliferativas e leucemia mielóide aguda [22]. Dos 6 pessoas, com perdas de cópia em

região do gene TET2

, 2 destes indivíduos tinham um diagnóstico de câncer hematológico incidente (1 síndrome mielodisplásica 1 mieloma múltiplo). As deleções de 13q foram observadas em 7 indivíduos com uma região minimamente excluído de 714 kb que contém o

gene DLEU7

, que se pensa desempenhar um papel como supressor de tumor no tratamento da leucemia linfocítica crónica [23]. eliminações mosaico de

DLEU7

foram observados 2 casos de leucemia, um linfoma não-caso linfoma e 4 indivíduos sem um cancro hematológico. eliminações mosaico de 1 MB de 17q foram observados em indivíduos sem câncer 5 hematológicas. A região recorrentemente excluído em 17q se sobrepõe a

NF1

, que está correlacionada com o aumento do risco de leucemia pediátrica [24]. Por último, foi observada uma região suprimida repetidamente de 129 Kb de 20q em 8 indivíduos. Não há genes candidatos envolvidos na neoplasia hematológica foram localizados na região minimamente excluído de 20q.

No total, foram observados 229 casos de câncer incidente hematológica nos 12.176 participantes que não tenha gravado o câncer hematológico antes da inscrição ou dentro 1 ano de inscrição. Dos 229 casos, houve 51 leucemia, linfoma 6 Hodgkin, 120 linfoma não-Hodgkin, 46 mieloma múltiplo, e 6 casos de síndrome mielodisplásica. casos de câncer hematológico tinha características semelhantes aos indivíduos sem câncer hematológico detectado, no entanto casos tendem a ser mais velhos no início do estudo e tendiam a ter mais curto estudo de seguimento (Tabela 3). Usando modelos de risco proporcional de Cox, avaliamos o risco de câncer incidente hematológica associada ao transporte de uma anomalia, em mosaico de 5,5 (IC 95%: 3,3-9,3, p = 7,5 × 10

-11) após ajuste para idade na ingestão de estudo e estudo de coorte. Considerando-se apenas que não sejam a leucemia cancros hematológicos incidente, as estimativas de risco associados com anomalias de mosaico foram atenuadas (HR = CI 3.2, 95%: 1,5-6,8, p = 0,003). Risco de leucemia associada a uma anomalia, em mosaico foi maior do que o risco de cancro da outra hematológica com 9 dos 51 casos de leucemia com uma anomalia identificada versus 7 de outros 177 casos de cancro uma anomalia hematológica com (p-valor = 0,002) identificado.

dos 16 casos de câncer hematológico com mosaicismo detectável, 9 dos casos foram diagnosticados com leucemia. Frequência de mosaicismo entre os casos de leucemia diagnosticada foi de 17,6%, o que é consideravelmente maior do que a observada em outros cancros hematológicos (3,9%) e muito maior do que as taxas observadas na amostra putativamente hematológica livre do câncer (1,3%). Considerando apenas a leucemia como o resultado, a taxa de risco associado com uma anomalia, em mosaico foi de 19,2 após ajuste para idade de admissão e de coorte (IC 95%: 8,9-41,6, valor p = 7,3 × 10

-14). A associação entre grandes anomalias de mosaico e outros do que a leucemia resultados incidente hematológicas é muito atenuada, se mantém em todos (HR = CI 2,7, 95%: 0,98-7,2, valor-p = 0,056). Para todos os cancros hematológicos e, especificamente, para a leucemia, a probabilidade de permanecer sem diagnóstico diferiram entre as transportadoras de mosaico e não-mosaico (Figura 3A B, respectivamente).

Discussão

Nós confirmar a associação entre mosaicismo cromossômico detectado em DNA de leucócitos no sangue e um diagnóstico de câncer hematológico na década seguinte. Um relatório anterior por Laurie et al. [3] estima o risco de doença maligna hematológica associada com uma anomalia, em mosaico que ser 10 vezes maior do que o risco experimentada por indivíduos sem uma anomalia detectada. Usando uma população com um número consideravelmente mais casos de câncer hematológico, a nossa estimativa de um risco 5,4 vezes maior é confirmação de uma forte associação entre anomalias de mosaico e câncer hematológico. Jacobs et al. [15] relataram um 35 vezes maior risco estimado de diagnóstico da leucemia subsequente associado com o transporte de um grande mosaico detectável anomalia ( 2 Mb). Encontrámos o risco de leucemia associada a uma grande anomalia em mosaico para ser 19,2 vezes maior do que o risco de indivíduos não-mosaico. Embora as estimativas de risco são um tanto menor em comparação com os resultados anteriores, estes resultados proporcionam forte confirmação, independente dos resultados relatados (Tabela 4). Semelhanças entre anomalias detectadas mosaico e anomalias recorrentes anteriormente observado em câncer hematológico (deleções envolvendo as regiões 2p-, 4T, 13q-, 17q- e 20q-) prestar apoio adicional para a associação.

nossa análise de meia-idade para os adultos mais velhos (média de 69 anos; intervalo 50-89), observou-se aumento da frequência de mosaicismo detectável com o aumento da idade. Este resultado confirma as conclusões dos dois estudos mosaicismo baseados em GWAS anteriores [3], [15] que relatam que frequência de eventos de mosaico são baixos em indivíduos com idade inferior a 50 anos (0,23-,5%), mas subir cerca de 2-3% em indivíduos em seus meados dos anos 70. Estas observações podem estar relacionadas à acumulação mutação somática relacionada com a idade ou recusa da eficiência dos mecanismos de reparo do DNA [25].

O nosso estudo de confirmação inclui o maior número de casos de câncer incidente hematológica como os dois estudos anteriores combinados (229 casos vs . 105 [3] e 115 casos [15]). A associação entre mosaicismo cromossômico detectado e câncer hematológico que observamos é tanto estatisticamente significativa e substancial em magnitude, sugerindo esse achado é robusto através dos estudos. No entanto, neste e em outros estudos, o tipo de câncer com a associação mais forte foi leucemia, com a associação entre os outros cancros hematológicos mais fraca, se presente em todos. Avaliação dos cancros hematológicos não-leucemia adicionais em uma comparação bem-powered ajudariam a esclarecer a existência ea magnitude de uma associação sem fins leucemia. A caracterização adicional da associação entre outras alterações somáticas, incluindo transvers�s equilibradas e translocações que não podem ser detectadas usando este método poderia ser uma extensão útil deste trabalho.

Há também permanecem dúvidas sobre a detecção de anormalidades cariotípicas do sangue derivado ADN. estudos de genotipagem longitudinais ou hibridização genômica comparativa poderia explorar a trajetória de expansão clonal entre os indivíduos com anomalias de mosaico. Seria de interesse para determinar se essas trajetórias diferentes entre indivíduos que desenvolveram cânceres diagnosticados clinicamente e aqueles que não o fez. Em indivíduos com mosaicismo putativo, também seria de interesse para testar outros tecidos para detectar a presença da anomalia do mosaico. Embora nos conjecturar que mosaicismo de boa-fé seria normalmente confinado aos leucócitos, estudos até à data têm sido incapazes de testar esta hipótese como eles não tinham acesso a outros tecidos de indivíduos afetados.

Em resumo, nosso estudo fornece a confirmação do Laurie et al. [3] e Jacobs et al. [15] estudos. Estes três estudos, um relatório um risco considerável de cancro hematológico associada a anomalias de mosaico detectado no sangue, porém os mecanismos subjacentes a esta associação não são claras. Embora tumorigênese é muitas vezes acompanhada de instabilidade cromossômica e alteração de número de cópias do cromossoma, os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela mosaicismo cromossômico e as inter-relações entre mosaicismo cromossômico e hematológicas cancros continuam a ser mal compreendido. proteínas supressores tumorais e genes que controlam a formação adequada do centrossoma, a sinalização checkpoint mitótico, e o movimento dos cromossomas duplicados podem ser envolvidos em ambos os fenómenos [26]. Em leucemias infantis, anomalias cromossómicas e clones de pré-leucêmica parecem surgir pré-natal, sugerindo que os acontecimentos genéticos secundárias que ocorrem após o nascimento são necessários para o desenvolvimento da doença [14]. Nos cancros hematológicos adultos, é possível que vários eventos patogénicos (genéticos e ambientais) ao longo do tempo, em conjunto com uma acumulação de mutações somáticas, promove a tumorigénese, e, finalmente, a ocorrência de doença já instalada. Mais estudos são necessários para identificar e caracterizar os mecanismos subjacentes a esta associação.

Materiais e Métodos

emerge Estudo População

A amostra emergem foi recrutado a partir do Health Cooperative Group (GHC) organização de manutenção da saúde na área de Seattle-Puget Sound. Os participantes do estudo matriculados em qualquer Conservatória do Registo Universidade de Washington /do Group Health Cooperative Alzheimer Disease Patient (ADPR) [27] ou as Alterações adultos em estudo Thought (ACT) [28]. Ambos ADPR e ACT foram inicialmente proposto para estudar demência. O ADPR foi um caso incidente encontrar estudo de demência, que começou em 1986, para tanto demonstrar a viabilidade do registo de dados para a pesquisa e buscar marcadores de doença de Alzheimer e demências relacionadas. O estudo ACT começou em 1994 como um sucessor planejado para o ADPR. O estudo ACT inicialmente inscritos 2.581 indivíduos de ascendência principalmente europeu sem demência entre os indivíduos com idade superior a 64 anos. A predominância de indivíduos de ascendência europeia é uma característica da população da região de Puget Sound, em vez de um critério de seleção. ACT, desde então, evoluiu para um estudo de coorte de base comunitária de aproximadamente 2.000 indivíduos cognitivamente intactas através de inscrição contínua. Um conjunto de 2.357 participantes não relacionados com idade 50-89 anos foram genotipados usando DNA derivado de amostras de sangue periférico, como parte do projeto emergem, e esses indivíduos foram incluídos em nosso estudo. Ambos os casos e controles do estudo demência foram incluídos na população estudada (Tabela S4 no arquivo S1, Tabela S5 em S1 Arquivo).

Os dados de acompanhamento clínico, sob a forma de abrangente clínica médica, laboratorial e registros de farmácia, estão disponíveis para todos os participantes de ACT e ADPR, com mediana de 6,1 anos de registro de acompanhamento médico eletrônico após a inclusão no estudo. Assuntos consentido genotipagem como parte do estudo emergem e aprovação para estes análise particular foram obtidos a partir do Group Health Cooperative Institutional Review Board.

WHI Estudo População

Iniciativa de Saúde da Mulher (WHI) é um grande estudo de coorte com um foco principal na doença e câncer de mama cardiovascular, mas com desfechos secundários que incluem vários cancros hematológicos adjudicados [29]. participantes do WHI com dados Illumina GWAS estavam disponíveis a partir de três de caso-controle separado estudos GWAS dentro WHI: um estudo de câncer colorretal (GECCO; Peters, PI), um estudo de fraturas de quadril (fratura de quadril; Jackson, PI), e um estudo de tratamento hormonal e doença cardiovascular /resultados metabólicos (GARNET; Reiner, PI). aprovação WHI foi obtido para a inclusão destas amostras neste estudo. No total, 9,819 previamente genotipados participantes WHI de descida essencialmente europeia foram incluídos na análise. Mais uma vez, a descida não foi um critério de selecção, mas sim refere-se aos dados demográficos da população subjacentes. participantes do WHI eram do sexo feminino, com idades entre 50-79 anos no momento da inscrição, consentido para a pesquisa sobre problemas de saúde relacionados com a idade, com uma média de 12 anos de acompanhamento após o recrutamento. Observou-se há correlação entre o estado de caso e quer detectadas anomalias ou posterior câncer hematológico, e, portanto, incluiu todos os casos e controles elegíveis em nossas análises (Tabela S4 no arquivo S1).

Classificação de desfechos clínicos de interesse e co-variáveis ​​relevantes

Os resultados clínicos preliminares de interesse neste estudo foram cancros hematológicos, incluindo leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásica e mieloma múltiplo. Os resultados clínicos dentro da amostra emergem foram apurados por meio de relatórios médico eletrônico da Classificação Internacional de Doenças, nona revisão (CID-9) códigos 200.0-208.9, 238.6, 238.72-238.75 e 238.79 (Tabela S1 no arquivo S1). classificação ICD-9 diagnóstico para cancros hematológicos foi obtido a partir das definições Registro de Câncer do Estado de Washington [30] com classificação de médico de síndrome mielodisplásica ICD-9 codificação.

resultados clínicos adjudicada durante WHI acompanhamento incluiu leucemia, linfoma e linfoma não-Hodgkin e mieloma múltiplo. Verificação de resultados clínicos ocorreu de acordo com os métodos anteriormente descritos WHI [29]. Resumidamente, os resultados do câncer hematológicas foram verificados por auto-relato no follow-up anual ou bi-anual com os participantes, com a subsequente julgamento médico baseado em registros médicos e relatórios de patologia para confirmar casos de câncer hematológicas e atribuir uma Classificação Internacional de Doenças para Oncologia, 3

código ª edição, quando apropriado. Com exceção do mieloma múltiplo, história auto-relatada de câncer hematológico antes da inscrição WHI estava disponível para os participantes.

Foram considerados os participantes a serem supostamente hematológica cancer-livre no início do estudo se eles não relataram história de um cancro hematológico a ingestão, e não tinha diagnóstico de câncer hematológico no primeiro ano de estudo de acompanhamento. Participantes que relataram uma história de câncer, o diagnóstico precoce, história em falta, ou menos de um ano de follow-up foram excluídas todas as análises e as contagens de assunto.

A genotipagem e controle de qualidade

O emergir amostras foram genotipados na matriz Illumina Humano 660W-Quadv1_A no Centro de Doenças hereditárias Research na Universidade Johns Hopkins. amostras WHI foram genotipados nas seguintes plataformas Illumina: HumanOmni1_Quad_v1_0_B, HapMap Humano 550 mil e humanos CYTOSNP-12 no Instituto Broad do MIT e Harvard, e do Translational Genomics Research Institute (Tabela 1). B-Alelo Frequência (BAF) e log razão R (LRR) métricas foram calculados utilizando o software Illumina BeadStudio.

controle de qualidade padrão foi conduzido para eliminar amostras de identidade inseguro ou a qualidade do DNA [31]. Nós selecionados para amostras discordantes sexo usando estimativas de heterozigosidade cromossoma X, e duplicatas não intencionais (controles de genotipagem e amostras duplicadas entre os estudos) através de uma estimativa global da identidade proporção em estado [32]. Foram excluídos amostras de análise, se as taxas de chamadas genótipo foram inferiores a 98% ou se o desvio padrão BAF de cromossomos autossômicos não anômalos excedeu 0,06. No total, 723 amostras foram excluídos da análise. Do total de excluídos, 23 amostras foram excluídos em alta BAF desvio padrão não-anômalo de cromossomos autossômicos, 610 duplicatas não intencionais, 86 para taxa de chamada baixa genotipagem, e 4 para o sexo-incompatibilidade. A maioria das duplicatas não intencionais são atribuíveis a sobreposição substancial entre coortes genotipados em WHI.

Detecção de anomalias e Controle de Qualidade

anomalias cromossômicas foram detectados através do método “anomDetectBAF” e todo o controle de qualidade foi realizado usando o método “anomIdentifyLowQuality” do pacote GWASTools versão 1.2.1 disponível para R versão 2.15 através do repositório Bioconductor [33]. Uma descrição detalhada destes métodos pode ser encontrada em Laurie et al. [3].

O método “anomDetectBAF” é capaz de detectar o ganho de cópia e para a perda de segmentos de comprimento superior a 50 kb de dados de genotipagem de SNP de alta densidade Illumina, bem como o mosaico CN LOH. Em resumo, o método de detecção de “anomDetectBAF” baseia-se na segmentação binário circular [34] para cromossomas segmento com base em mudanças de pontos na intensidade relativa alélica (frequência B-alelo; BAF). Em cada cromossomo, heterozigotos e falta genótipos SNPs são identificados, ea BAF nestes loci é transformada (TBAF:. Sqrt (min (BAF, 1-BAF, abs (BAF-mediana BAF))) segmentos anômalos são chamados com base no desvio a partir da linha de base não-anómala. Isto implica que a passagem tem pontos estimados incertezas que dependem da densidade de SNPs em torno da anomalia que são heterozigóticos no indivíduo da causa. Uma estimativa conservadora do ponto de extremidade incerteza seria da ordem de 10- 50 kilobases normalmente. Somente anomalias nos autossomos foram incluídos nas análises devido à inerente diferença copy-número entre machos e fêmeas.

Após a detecção de anomalias, o gasoduto de controle de qualidade detalhado na Laurie et al. [3] foi utilizada para filtrar anomalias falsos positivos. O gasoduto controle de qualidade utilizado ambas as abordagens de bioinformática e análise manual, composto por triagem visual de anomalias detectadas através LRR e parcelas BAF, para identificar anomalias falsos positivos e impropriamente segmentados. Anomalias foram rastreados com o “anomIdentifyLowQuality” usando os parâmetros sugeridos para anomalias BAF (sd.thresh = 0,1, sng.seg.thresh = 0,0008, auto.seg.thresh = 0,0001). Baixa qualidade anomalias BAF foram os que tiveram alta variância (BAF ou LRR desvio padrão superior a 0,1) ou foram altamente segmentado (número de segmentos /número de SNP 0,0001 para um autossomo). amostras de baixa qualidade foram considerados inelegíveis e foram excluídos da análise. Usando a revisão manual, anomalias adjacentes ( 300 sondas entre anomalias) com valores LRR semelhantes foram incorporadas e pontos de interrupção de anomalias incorretamente segmentados foram ajustados. Anomalias que medem o centrômero foram rastreados usando revisão manual com os critérios que as anomalias BAF ter pelo menos 500 sondas em cada lado do centrômero e pontos de interrupção foram ajustadas, como necessário a partir de cromossomas falhando o ajuste dos critérios para um centrômero-medindo anomalia. Anomalias foram obrigados a ter pelo menos 50 sondas elegíveis BAF a serem incluídos no estudo. revisão manual foi realizado em todas as anomalias mais de 2 MB e todas as anomalias classificados como mosaico.

Nós classificados anomalias como constitutiva (potencialmente germinal CNV) e mosaico (somática adquirida) com base na observação de que anomalias constitutivos caem principalmente dentro o espaço 3N (trisomic) [3]. A fim de definir anomalias mosaico, nós plotados por disciplina cromossomo LRR desvio (mediana (anômala LRR) – mediana (LRR nonanomalous)) vs. BAF desvio absoluto médio (MAD, Median | anômala BAF-Mediana (BAF nonanomalous) |), e depois usou agrupamento k-médias (k = 3) para distinguir entre a grande centroid constitutivo e as anomalias mosaico putativamente.

Foi definido anomalias constitutivos como aqueles dentro de dois de assistência médica da mediana do cluster. revisão manual de anomalias mosaico putativamente foi usado para distinguir entre anomalias de mosaico e artefatos técnicos (indevidamente segmentados ou anomalias, falsos positivos). Anomalias definidas como constitutivo ou artefatos foram excluídos e, portanto, não é considerado em análises posteriores. Consistente com Laurie et al. [3], que só tentaram detectar mosaicos em que uma das populações de mistura foi diplóide. Clustering de anomalias constitutivos é exibido na Figura 1D.

anomalias mosaico foram classificados como cópia de perda neural de heterozigose, perda ou ganho baseado em LRR e métricas de desvio BAF (Figura 1A). Anomalias com um desvio LRR (| anômala LRR- LRR não anômala |) inferior a 0,05 foram classificadas como cópia perda neutra de heterozigosidade. Anomalias com um desvio LRR maior que 0,05 ou inferior a -0,05 foram classificados como ganhos ou perdas, respectivamente. revisão manual foi usado para confirmar a classificação em casos ambíguos.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas em R versão 2.15.0 [35]. Anomalia chamada foi efectuada utilizando o invólucro “anomDetectBAF” das funções “anomSegmentBAF” e “anomFilterBAF” localizadas no pacote GWASTools. amostras de baixa qualidade foram removidos usando o “anomIdentifyLowQuality” no pacote GWASTools. Nós utilizamos a função “coxph” com o pacote de “sobrevivência” para as estimativas de razão de riscos proporcionais de Cox e para caber curvas de Kaplan-Meier, ea função “kmeans” das “estatísticas” pacote para agrupar anomalias constitutivos putativos.

Foi avaliada a associação entre detectáveis ​​anomalias cromossómicas mosaico com câncer incidente hematológica através de modelagem de Cox razões de riscos proporcionais, 95% intervalos de confiança e valores p. Para manter a consistência com os relatórios anteriores, relatamos taxas de risco para a associação entre anomalias de mosaico e todos os cânceres hematológicos e taxas de risco para a associação entre grandes anomalias mosaico ( 2 Mb) e leucemia incidente.