Sumário

O objetivo deste estudo foi explorar marcadores moleculares específicos que poderiam levar a novos insights sobre a identificação de tratamentos inovadores. Foram identificados o papel de DNMT3B e seu poder preditivo no prognóstico do câncer bucal. Foram selecionados linhas celulares de cancro orais humanos, incluindo SCC4 e SCC25 para experimentos celulares. Alterações no crescimento do tumor, agressividade e a via de sinalização responsáveis ​​foram investigados

in vitro

e

in vivo

. Além disso, 125 amostras de tecido de câncer orais foram analisados ​​utilizando coloração imuno-histoquímica em lâminas de tissue microarray, e correlações calculadas entre o nível de DNMT3B eo desfecho clínico dos pacientes. Nossos dados revelaram que a inibição da DNMT3B resultou no crescimento tumoral mais lenta, capacidade de invasão tumoral atenuada e mesenquimais transição epitelial, conforme determinado pelo

in vitro Comprar e

in vivo

experimentos. Activado IL-6 de sinalização pode ser responsável para a indução de DNMT3B superexpressão sobre o câncer oral. Com relação aos dados clínicos, a incidência de DNMT3B imunorreactividade em amostras de cancro oral foi significativamente mais elevada do que no epitélio não-maligna, e positivamente ligada à expressão de IL-6. Além disso, a expressão de DNMT3B foi significativamente associada com o risco de comprometimento dos linfonodos, a recorrência da doença e menor sobrevida em pacientes com estágio patológico III-IV de câncer oral. Em conclusão, IL-6 eixo -DNMT3b poderia ser utilizado para prever o prognóstico de câncer oral em clínicas, e visando DNMT3B poderia representar uma estratégia de tratamento promissora

Citation:. Chen WC, Chen MF, Lin PY (2014 ) a significação do DNMT3B no câncer oral. PLoS ONE 9 (3): e89956. doi: 10.1371 /journal.pone.0089956

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 30 de outubro de 2013; Aceito: 24 de janeiro de 2014; Publicação: 13 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi o apoio de Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, conceder CMRPG6A0222-3. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os cânceres mais frequentes oral são carcinomas orais de células escamosas (CEs), que são os tumores mais malignos da cabeça e pescoço. Esta neoplasia epitelial agressiva está associada com morbidade grave. Pós-operatórias quimioradioterapia (CCRT) resulta em melhor controle loco-regional e sobrevida para pacientes com câncer de cabeça e pescoço localmente avançado com fatores de alto risco [1]. Apesar dos avanços consideráveis ​​no tratamento, 40-50% dos pacientes com recidiva da doença localmente avançada com a progressão da doença local ou distante [2]. Investigando marcadores moleculares específicos relacionados com o desequilíbrio entre a morte e proliferação celular, a capacidade de invasão de tecidos e sensibilidade tratamento, poderia fornecer novas perspectivas para a identificação de tratamentos inovadores.

CEB é uma doença multifatorial, que é principalmente associada com o tabaco crônica, uso de álcool e betel porca [3]. A predisposição genética também tem sido implicada em tumorigénese por via oral, e várias alternâncias genéticos e ambientais estão envolvidos no crescimento do cancro [4]. metilação anormal do DNA desempenha um papel chave na carcinogénese, levando ao silenciamento epigenético de genes supressores de tumores envolvidos na regulação do ciclo celular, apoptose e de reparação do ADN [5], [6]. hipermetilação DNA ocorre frequentemente em tecidos pré-cancerosos e câncer [7]. Em CCEO, p14, p16, MGMT, DAP-quinase e E-caderina eram frequentemente e extensivamente estuda genes metilados [8] – [12]. metilação de ADN é tipicamente mediada por ADN metiltransferases (DNMT) e em genomas de mamíferos há três genes DNMT; DNMT3a DNMT3B e são responsáveis ​​por metilação de novo e modificar ADN não metilado, e DNMT1 se pensa ser responsável por manter padrões de metilação [13] – [15]. DNMT3B tem sido relatada a participar na carcinogênese de vários tipos de câncer, incluindo esôfago, estômago e câncer de pulmão [16] – [18], mas o papel do DNMT3B em CCEO requer uma investigação mais aprofundada. Nós relatado anteriormente que ativada a sinalização de IL-6 foi associada com o comportamento agressivo do tumor no câncer oral [19]. Em células de cancro oral, IL-6 foi relatado para promover a tumorigénese por alterinig de metilação de ADN [20]. Assim, nós examinamos a expressão de DNMT3B em CCEO e sua ligação com a IL-6 de sinalização no presente estudo. O papel da DNMT3B em CCEO

in vitro

e

in vivo

, ea correlação com os resultados clínicos de pacientes com CEB usando análise de coloração imunoquímico também foram investigados.

Materiais e Métodos

os espécimes de tecido e as características dos pacientes

o Conselho de revisão Institucional (IRB) de Chang Gung Memorial Hospital aprovou o estudo (número de autorização: 98-3546B). A autorização por escrito assinada pelos pacientes para a sua amostra e informações a serem armazenados no hospital e utilizadas para a investigação. O processo de aprovação foi aprovado pelo IRB. Os espécimes foram coletados retrospectivamente de pacientes diagnosticados com CCEO localmente avançado que receberam tratamento curativo, e construído em microarrays de tecido (TMA) blocos para análise imunoquímica. No estudo, os blocos de TMA foram consistiu de 125 casos CEs com patológica fase III-IV (bucal, n = 48; gengival, n = 24; lábio, n = 10; língua, n = 35; palato, n = 8) pela AutoTiss 1000 (sempre biotecnologia, Canadá). Quando os blocos estavam disponíveis, hematoxilina e lâminas coradas-eosina foram reavaliados por um patologista para avaliar a qualidade das lâminas TMA. Dados relativos ao diagnóstico inicial, encenação, fatores patológicos, recidiva e sobrevivência foram coletados (Tabela 1). análises de probabilidade de sobrevida foi realizada utilizando o método de Kaplan-Meier. Significado diferenças entre os grupos foi avaliada pelo teste de Sperman-rank. análises multivariadas foram realizadas utilizando um modelo de regressão de Cox para sobrevida global. Todos os testes estatísticos foram dois lados, com significância definida como p . 0,05

coloração imuno-histoquímica (IHQ)

As secções de tecido a partir de blocos de TMA e, tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina foram cortadas em seções de 4 mm, montadas em lâminas, desparafinados com xileno e desidratadas usando uma série de etanol graduada. A recuperação de antígenos, com a utilização de ácido cítrico (pH 6,0) durante 30 minutos, foi seguido por tratamento with3% de peróxido de hidrogénio. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos contra as proteínas específicas. Os anticorpos específicos para a p-H2AX, MMP-9, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e CD31 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Chemicon (Temecula, CA), Research Diagnostics Systems, Inc. (Minneapolis, MN EUA), e DNMT1 DNMT3B e foram adquiridos a partir de Abcam (Cambridge, MA), respectivamente. Eles foram usados ​​em 1:100 diluições. Após três lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS), as secções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado for10 min e corados com peroxidase-avidina e lavou-se novamente em PBS; em seguida, foi adicionada uma solução de 3-amino-9-etilcarbazole. As secções foram contrastadas com hematoxilina. Os dados foram analisados ​​utilizando IHC Imagem Pro Plus 6.3 (IPP). A densidade microvascular (MVD) foram medidas utilizando a coloração de CD31 Cada grupo de células endoteliais imunorreactivo em contacto com o campo seleccionado foi contado. Os dados de IHC foi examinado por Boa velocidade plataforma de digitalização de slides de digitalização, e analisados ​​por Image Pro Plus 6.3 (IPP). Esta análise demonstrou que as proteínas de anticorpos que foram altamente expresso em células epiteliais de tumor alvo (Fig. 1) em comparação com o tecido não canceroso adjacente. Para a avaliação histológica de DNMT1 e coloração DNMT3B, em complemento da análise IPP, as lâminas foram re-verificada por um único patologista. DNMT1 e DNMT3B imunorreactividade de uma amostra de tecido foi contada para as células mostraram coloração nuclear positiva, independentemente de espécimes staining.The citoplasmáticos foram avaliados utilizando a pontuação imunorreativo semi-quantitativa (IRS). O IRS foi calculado multiplicando a intensidade da coloração (classificado como: 0 = não, 1 = fraco 2 = moderado e 3 = forte coloração) e a percentagem de células coradas positivamente (0 = menos de 10% de células coradas, 1 = 11-50% de células coradas, 2 = 51-80% de células coradas e 3 = mais de 81% de células coradas). O critério para a coloração positiva é um espécime com um grau de pontuação IRS 2.

A. Níveis de DNMT1 DNMT3B e foram examinadas no cancro (CA) e o tecido não-maligna (NT) por análise de transferência de Western. B. Níveis de DNMT1 e DNMT3B foram examinados em seis amostras (cancro emparelhado (CA) e o tecido não maligno adjacente (NT);. Por RT-PCR O eixo y mostra a proporção de proteína alvo no tecido de cancro em que dividida pela . a amostra não-malignas Colunas, com média de três experiências separadas; Bares, desvio padrão (SD); *, P . 0,05 lâminas C. representativos de coloração positiva IHC com anticorpos DNMT1 e DNMT3B são mostradas por imagens usando IPP (NT, epitélio adjacente não maligna;. CA, tecido de câncer oral) Imagens de diapositivos representativos são mostrados em ampliações de × 100 (linha superior) e × 200 (linha inferior) * (+) significa coloração positiva no cancro .. NT adjacente

cultura de células e reagentes

As linhas celulares de cancro orais humanos, SCC4 e SCC25, foram obtidos a partir Coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (BCRC). anticorpo recombinante humano IL-6 foi obtido a partir de R .. D (Minneapolis, MN) o DNMT inibidor de 5-aza-2′-desoxicitidina foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO) o DNMT3B-GFP vector de silenciamento (vector psiRNA-h7SK expressando siRNA alvejando DNMT3B humano do humano 7SK promotor de ARN-polimerase III, e o gene de fusão que confere GFP:Zeo repórter e actividades de resistência a antibióticos) e o vector de controlo de GFP (não-eficaz mexidos siARN GFP no vector) foram adquiridos a Invivogen. células cancerosas silenciados-DNMT3B estáveis ​​foram gerados por transfecção de células SCC4 e SCC25 com o vector de silenciamento DNMT3B e seleccionadas por cultura em meio contendo Zeomycin durante 4 semanas.

crescimento celular e ensaio clonogénico

Os efeitos de DNMT3B sobre a taxa de crescimento das células foram avaliados utilizando células transfectadas com um vector de silenciamento DNMT3B ou controlo de vector. Para medir o crescimento celular, 1 × 10

4 células por poço foram plaqueadas em placas de 6 poços. Nos pontos de tempo indicados, as células foram tripsinizadas, recolhidas e as células sobreviventes contadas utilizando exclusão com azul de Tripano, a partir do qual foram estabelecidos os curvas de sobrevivência para os transfectantes SCC. Além disso, foi usada ensaio clonogénico. Exponencialmente as células em crescimento foram incubadas a 37 ° C durante 10 dias, e as placas foram coradas com violeta de cristal (Sigma) para ajudar a contagem de colónias. As colónias contendo . 50 células foram marcados para determinar chapeamento eficiência e sobreviver frações para cada linha de células

Immunoblotting

Para western blot de células inteiras e extratos de tecidos orais, as amostras foram homogeneizadas e /ou tratou-se com tampão de lise (Calbiochem, La Jolla, CA). As amostras de tecidos orais composta de seis amostras de tecido de câncer e seis amostras de epitélio não-malignas. Um kit NE-PER (Pierce, Rockford, IL) foi utilizada para separar as proteínas nucleares e citoplasmáticos. Para determinar o

In vitro

efeitos da IL-6 Ab, e um inibidor DNMT, as proteínas foram extraídas de células na presença ou ausência de anticorpos /ml de IL-6, 5 ug de neutralização durante 24 h ou 5 uM 5- aza-2′-desoxicitidina, durante 36 h, respectivamente. A quantidade igual de proteína foi carregada num gel de gradiente de SDS-PAGE a 4-20%, a proteína foi transferida para filtros de nitrocelulose depois separadas no gel. As membranas foram bloqueadas em BSA a 2% em TBST durante 1 h, as membranas foram incubadas durante a noite (4 ° C) com anticorpos contra DNMT1, DNMT3B, VEGF, E-caderina, STAT3, pSTAT3

Tyr705, e MMP-9. As membranas foram incubadas com conjugado de HRP anti-secundário de cabra, anti-rato, ou anticorpos anti-coelho (diluição 1:1,000-1:2,000), respectivamente, durante 1 h à temperatura ambiente. As proteínas foram visualizadas por quimioluminescência aumentada. As membranas foram sondado com um anticorpo contra o R-tubulina ou lâmina nuclear para normalizar a carga de proteína.

RT-PCR em tempo real (RT-PCR)

em tempo real de RT-PCR foi realizada em RNA extraído de células e as amostras de tecido (as amostras de tecido de cancro de seis e seis tecidos orais não-malignas; duas amostras são executados em cada pista). ARN (2 ug) foi transcritos de modo inverso com um iniciador aleatório para obter a primeira cadeia de cDNA. As sequências dos iniciadores para DNMT3B foram 5′- GACTCGAAGACGCACAGCTG -3 ‘/5’CTCGGTCTTTGCCGTTGTTATAG’. Para controlar as diferenças de carga, um iniciador β-actina foi utilizado como um controlo. A PCR optimizadas foi realizada num sistema de detecção de PCR iCycler Iq multicolor em tempo real. PCR sinais fluorescentes significativas em comparação com os tecidos de carcinoma foram normalizados ao valor médio dos sinais obtidos a partir dos tecidos e células não-malignas em condições de controlo.

Imunofluorescência coloração (SE)

Células demonstrando crescimento exponencial foram semeadas em lamelas de coloração por imunofluorescência, com ou sem tratamento. Nos tempos indicados, após o tratamento, as células foram fixadas, permeabilizadas com 2% de paraformaldeído por 5 minutos e lavadas com PBST. As lâminas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com os anticorpos contra a E-caderina, DNMT3B, VEGF e MMP-9, durante 1 h com um anticorpo secundário conjugado com vermelho do Texas. As lâminas foram contrastadas com DAPI para visualizar núcleos. Após duas lavagens com PBST, as proteínas alvo específicas foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência.

A migração celular e invasão da célula de ensaio

capacidades para a invasão de células foram determinados utilizando um Ensaio de Invasão celular (Trevigen, Gaithersburg, MD). Após incubação durante 24 h, o número de células na câmara inferior foi determinada através da medição da calceína anião fluorescente, calceína libertada a partir acetoxymethylester intracelular. Para validar as experiências relativas à migração celular, ensaios de raspadinhas foram realizadas. Uma grande scratch 2 mm foi elaborado através de cada camada de células utilizando uma ponta de pipeta. As placas foram fotografados nos horários indicados.

Tumor modelo de xenotransplante

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, promulgada pela Institutes of Laboratory animal Resources, National Research Council, EUA o protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação animal de Chang Gung Memorial Hospital (número de autorização: 2012080902). ratinhos nus atimicos fêmeas com oito semanas de idade foram utilizados como o modelo de xenoenxerto de implantação do tumor. No modelo de implantação do tumor ectópica, as células (1 x 10 células

6 tumorais foram injectadas por via subcutânea, por implante, cinco animais por grupo) foram implantados na região dorsal bilateral glútea. O tamanho do tumor foi medido a cada três dias após a implantação (dia 0). O volume do tumor foi calculado assumindo uma forma elipsóide.

Resultados

Níveis DNMT3B em tecidos de câncer oral

A expressão de DNMT3B nas amostras de tecido (malignos contra adjacente não-malignas ) foi examinado por transferência de Western, enquanto que o ARNm foi demonstrada por em tempo real de RT-PCR (Fig. 1A-B). Por os dados, cancro demonstrou um nível significativamente mais elevado de DNMT3B de amostra não-malignas. Os dados de IHC de lâminas TMA confirmou este achado que DNMT3B foi sobre-expresso em tecidos de tumor do que os tecidos epiteliais não-malignas adjacentes (Fig. 1C). Dos 125 tecidos de câncer oral ensaiadas para DNMT3B e DNMT1 usando a análise IHC, 76 (61%) deu DNMT3B imunorreatividade positiva, mas apenas 36% (45/125) com a coloração DNMT1 positivo. Além disso, o papel do DNMT3B na evolução clínica de CCEO humano foi ainda avaliada por meio da coloração IHC. Os pacientes foram ainda classificadas como DNMT3B (+) ou DNMT3B (-) na base dos resultados de IHC. Houve uma correlação positiva entre a incidência de metástases em linfonodos, a recorrência da doença e coloração positiva DNMT3B (Tabela 1). Oitenta e três por cento (40/46) dos pacientes com recorrência da doença (incluindo falha local-regional e metástases à distância) demonstraram coloração positiva para DNMT3B. Em contraste, 46% (36/79) dos pacientes classificados como tendo status de livre de doença expressa DNMT3B. As descobertas sugerem que DNMT3B coloração pode ter o valor preditivo no prognóstico do câncer bucal.

Papel do DNMT3B no crescimento do tumor

Para investigar se alternando expressão DNMT3B desempenhou um papel no crescimento do tumor agressivo, células cancerosas orais foram transfectadas com um vector de silenciamento DNMT3B-GFP. Como demonstrado na Figura 2A, o vector de silenciamento de expressão DNMT3B DNMT3B significativamente inibidas em células cancerosas por transferência de Western e análise de coloração imunoquímico. O efeito de DNMT3B sobre o crescimento de células tumorais foi determinada por contagem de células viáveis ​​ao longo de seis dias e a formação de colónias. Os dados de experimentos celulares mostraram DNMT3B silenciar vetores proliferação de células tumorais inibiu significativamente a

in vitro

(Fig. 2B). A alteração da distribuição do ciclo celular foi novamente medido. O vector de silenciamento DNMT3B resultou em paragem do ciclo celular (Fig. 2C). Como mostrado na Figura 2D pela observação de tumores de xenoenxerto, a inibição da DNMT3B utilizando vectores de silenciamento diminuiu significativamente a taxa de crescimento do tumor.

. Efeitos da DNMT3B vector de silenciamento do nível de DNMT3B em SCC4 e SCC25 demonstrado por Western blot e coloração imunoquímico

in vitro

. Imagens de lâminas representativas são mostrados e a seta indica a coloração positiva de DNMT3B em células. (C-V, as células com o vector de controlo; DNMT3B-SV, as células transfectadas estavelmente com DNMT3B vector de silenciamento; DNMT-I, as células tratadas com o inibidor DNMT). B. Efeito de DNMT3B sobre a proliferação de células cancerosas por via oral, tal como determinado por contagem de células viáveis ​​e formação de colónias. O mesmo número de células (10

4) foram plaqueadas em cada placa no dia 0 e deixou-se crescer nas respectivas culturas. Contamos o número de células viáveis ​​após incubação de 2, 4 e 6 dias. O eixo Y representa o número de células viáveis. Point, meio de três experimentos separados; Barras, DP. *,

p Art 0,05. C. As células foram analisadas por FACS para o teor de ADN em condições de controlo ou com a inibição DNMT3B. Os dados foi demonstrada por imagens representadas. D. Efeitos da DBMT3b vector de silenciamento sobre os níveis de DNMT1 e DNMT3B avaliados por IHC e crescimento do tumor xenoenxerto. Cada ponto representa a média de três experiências separadas; bares, SD; *,

P Art 0,05. imagens representativas são mostrados.

Papel do DNMT3B no tumor invasão

Houve uma correlação positiva entre a coloração DNMT3B e LN metástase e insuficiência da doença em pacientes com câncer oral (Tabela 1). como demonstrado usando zero migração e ensaios de invasão, DNMT3B vetores silenciamento atenuou a capacidade de invasão das células cancerosas orais

in vitro

(Fig. 3A-B). mesenquimais transição epitelial (EMT) é um evento chave na invasão de um tumor [21]. Por isso, determinou-se se este era o mecanismo subjacente os efeitos da DNMT3B sobre invasão de câncer oral. O vector de silenciamento DNMT3B induzida células cancerosas orais para aumentar suas características epiteliais, conforme determinado por mudanças na expressão de E-caderina, uma característica da EMT [22] e vimentina (Fig. 3C-D). EMT é relatado para ser associado a um número de factores relacionados com a invasão incluindo VEGF e MMP-9. Os dados revelaram que a inibição da DNMT3B pelo vector de silenciamento resultou em menor expressão de VEGF e MMP-9. A angiogénese é um dos mecanismos que promovem a progressão do tumor, e as interacções célula-célula endoteliais mediada por CD31 estão envolvidos na angiogénese [23]. Por conseguinte, a rede vascular dentro do tumor foi medido por coloração com VEGF e análise de densidade microvascular (MVD), após coloração com CD31. Quando células cancerosas orais com vectores de controlo e com os vectores de silenciamento DNMT3B foram implantadas subcutaneamente em ratos, verificou-se que o efeito inibidor do crescimento induzida por DNMT3B vector de silenciamento associado com baixos níveis de expressão de EMT- e factor relacionado com a angiogénese (Fig. 3E). Assim, sugerimos que a sobre-expressão DNMT3B desempenha um papel na promoção de tumores, e a indução de angiogénese e EMT podem ser os mecanismos underling.

. A capacidade invasiva de células de cancro oral, com ou sem o vector de silenciamento DNMT3B foi avaliada por ensaios de migração zero. Os resultados representativos são mostrados lâminas. Coluna, com média de três experiências separadas. Bares, SD. *, P 0,05. B. As capacidades invasivos de células de cancro oral com ou sem regulação DNMT3B foram avaliadas pelo ensaio de invasão em células de câncer oral, SCC4 e SCC25. Os resultados são mostrados por lâminas representativas e dados quantitativos. *,

P Art 0,05. C. As mudanças de E-caderina nas células são avaliados e os resultados são apresentados por lâminas representativas (linha superior, imagem de imunofluorescência corados com Ab para DNMT3B e DAPI para núcleo; fileira inferior, imagine imunofluorescência corados com Ab para E-caderina e DAPI por núcleo); (Azul: DAPI; Verde: GFP-vector; Vermelho: proteína alvo). D. As alterações em proteínas associadas EMT em células com regulação DNMT3B foram avaliados por análise de Western blot (C-V, as células com o vector de controlo; DNMT3B-SV, células com DNMT3B vector de silenciamento). E. IHC utilizando MMP-9, coloração de CD31, e o VEGF em tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina a partir de tumores de xenoenxerto. vetores de silenciamento DNMT3B foram significativamente reduzidos pela angiogênese e alterações relacionadas com EMT, em comparação com o vector de controlo.

DNMT3B e IL-6 estão relacionados com a evolução clínica de CCEO

Anteriormente, informamos que a ativação de IL-6 /sinalização STAT3 induzida tumor agressivo comportamento e EMT mudanças no cancro oral [19]. Portanto, a correlação entre DNMT3B e IL-6 no desfecho clínico de fase III-IV CCEO humano foi ainda calculado usando IHC em TMAs constituído por 125 amostras. Das 125 amostras de tecido ensaiadas para DNMT3B e IL-6, tanto a 59 (61%) foram positivas. Como mostrado na Figura 4A, uma correlação positiva significativa foi observada na amostra de cancro que coraram positivamente para DNMT3B e IL-6. Usando a análise univariada, a recorrência da doença e coloração positiva para DNMT3B e IL-6 foram todos significativamente associados com a sobrevida mais curta (Tabela 2 e Figura 4B). Utilizando análise multivariada, a expressão de DNMT3B e recorrência da doença foi preditores significativos para a sobrevida global em 125 pacientes com câncer bucal (Tabela 3). Os resultados destacam a contribuição de coloração DNMT3B de mau prognóstico no câncer oral. Por análise de proteína, a inibição da sinalização de IL-6 resultou numa diminuição da expressão DNMT3B e factores relacionados com o EMT, associado com STAT3 atenuada e a activação de Akt (Fig. 5A-B). Além disso, a Figura 5C demonstra que a diminuição da DNMT3B por IL-6 do anticorpo aumentou danos no ADN e morte celular. Portanto, sugere-se que a ativação de IL-6 de sinalização pode ser responsável para o aumento da DNMT3B em cancros orais.

A. nível DNMT3B foi positivamente correlacionada com a expressão de IL-6, em amostras humanas orais câncer (P 0,0001). lâminas representativas de um espécime de tumor coradas positivamente seleccionados tanto para a IL-6 e DNMT3B é mostrado na × 100 e 400 de ampliação. B. diferenças de sobrevivência de acordo com o desenvolvimento de doença de falha ou não, a coloração positiva de DNMT3B e coloração positiva para ambas DNMT3B e IL-6. As curvas de sobrevida global de Kaplan-Meier mostra que os grupos positivos foram relacionados com menor sobrevida comparada com a de respectivo grupo negativo.

A. Efeito de IL-6 sobre os níveis de DNMT3B e proteínas relacionadas com EMT são avaliadas por análise de imunofluorescência

In vitro

e os resultados são mostrados por lâminas representativas. B. Influência de bloqueio de IL-6 sobre o nível de DNMT3B, STAT3 /activação AKT e proteínas relacionadas com EMT são avaliadas por análise de transferência de Western. C. Efeitos da IL-6 sobre o nível de DNMT3B e proteínas de morte celular em SCC4 e SCC25 demonstrada por coloração imunoquímico

in vitro

.

Discussão

foi relatado que um interruptor para acumular hipermetilação DNA poderiam ser causados ​​por sobre-expressão de metiltransferases de ADN [15]. silenciamento do gene epigenético, promovido por DNMTs, tem sido observada em várias doenças malignas, apoiando a reivindicação de que os genes DNMT são sobre-expressa em cancros humanos e durante a transformação celular [24] – [26]. No presente estudo, IHC de lâminas TMA revelou que o nível de expressão foi mais elevado DNMT3B em 76 amostras (61%) de cancro do que em epitélio oral não-maligno adjacente. Nós ainda avaliado se DNMT1 foi sobre-expresso em CCEO usando IHC de lâminas TMA. Os dados revelaram que apenas 45 (36%) amostra de cancro tiveram maior DNMT1 em comparação com os tecidos epiteliais não-malignas adjacentes. Identificação, desenvolvimento e seleção de alvos moleculares são importantes na terapia do cancro. Os poderes de previsão de DNMT3B foram ainda examinadas em termos da evolução clínica do câncer bucal. Usando a análise univariada, reforçada expressões de DNMT3B foram significativamente associados com uma maior incidência de metástase ganglionar, a maior taxa de recorrência após o tratamento e menor sobrevida. Utilizando análise multivariada, o fracasso da doença e maior expressão da DNMT3B foram significativamente associados com a sobrevida global mais curto. Para investigar se DNMT3B foi responsável pelo crescimento do tumor agressivo de CCEO, que suprimiu DNMT3B em células de câncer oral, utilizando um vector de silenciamento. Os dados obtidos a partir de experiências celulares e crescimento de tumor de xenoenxerto de experiências revelaram que a inibição da DNMT3B resultou em crescimento tumoral mais lenta. Além disso, a inibição da DNMT3B foi associada com invasividade atenuada. As alterações moleculares e fenotípicas envolvidas na transformação de uma célula epitelial de um tipo de células mesenquimais parecem ser funcionalmente relevantes para as características invasivas de tumores epiteliais [21]. Tem sido relatado que está associado com EMT progressão CEB [27], [28]. Ao nível do marcador molecular, EMT é caracterizada por uma perda de E-caderina e aumento da expressão de vimentina e factores relacionados com a invasão. Os vetores de silenciamento DNMT3B induziu um aumento da E-caderina e diminuição do VEGF e MMP-9 em células de câncer bucal. Além disso, a angiogénese é um dos mecanismos que promovem a progressão do tumor, e CD31 mediada por interacções célula-célula endoteliais envolvidas na angiogénese. Pelos nossos dados, a inibição da DNMT3B atenuado o crescimento do tumor, associada à diminuição expressões CD31 e VEGF em tumores. Estes resultados indicaram que DNMT3B pode mediar o crescimento do tumor agressivo no câncer oral, e a promoção da EMT e angiogênese é um dos mecanismos subjacentes.

desenvolvimento CEB é, em parte facilitada por irritações epiteliais crônicas e este tumor é mais freqüente em fumante ou que consomem álcool quantidade excessiva. IL-6, é uma citocina pró-inflamatória que medeia a inflamação crónica e tem sido relatada a desempenhar um papel importante na carcinogénese oral, dirigido-a inflamação [29], [30]. Nós previamente relatado que a IL-6 activado vias poderiam ser responsáveis ​​pelo crescimento de tumor mais agressivo observado no cancro oral, e elevado nível STAT3 e p-AKT activadas foi induzida por IL-6 e IL-6 que liga a tumorigénese [19]. É relatado que a IL-6 níveis são elevados em esta neoplasia e IL-6 é considerado um fator de mau prognóstico no câncer oral. Secreção de IL-6 no cancro epidermóide oral é facilitado por o microambiente, em particular por estromal derivada factor-1 [29]. Além disso, numerosos projectos têm demonstrado que a IL-6 induzida por hipermetilação e silenciamento de gene pode ser mediada por DNMTs [18], [20], [31] – [33]. Tomados em conjunto, propusemos que o estresse inflamação crônica na cavidade oral pode promover tumorigênese mediada pelo aumento da IL-6 para induzir a metilação do DNA aberrante através de um aumento da actividade DNMT3B. No presente estudo, os dados obtidos a partir de amostras de IHC clínicos demonstraram que a expressão DNMT3B foi significativamente correlacionado com a IL-6 coloração. A agressividade do tumor observado em IL-6 CCEO positiva pode ser em parte através da superexpressão de DNMT3B. Para testar a hipótese, a relação entre IL-6 de sinalização e DNMT3B em CCEO voltou a ser examinada no presente estudo para ver se o regulamento dos resultados IL-6 de sinalização em mudanças de expressão DNMT3B. Pelas experiências em que a IL-6 de sinalização foi suprimida pelo anticorpo de IL-6, verificou-se que a IL-6 activado sinalização desempenha um papel importante na activação DNMT3B associada com STAT3 activado e PI3K em células de cancro oral. Os dados obtidos a partir do presente estudo revelou que o aumento da DNMT3B induzida pela IL-6, a qual pode ser mediada pela activação da STAT3 e sinalização de PI3K, é crítico na agressividade do tumor e o prognóstico de cancro oral. Por isso, delineou as principais vias de sinalização que são pensados ​​para ligar IL-6 e DNMT3B ao câncer bucal (Fig. 6).

Em conclusão, inflamação e metilação são ambos acreditados para jogar um papel chave na via oral tumorigênese, no entanto, efeitos orientado a inflamação na metilação precisar de mais investigação nesta doença. Este projecto estabelecido eixo de IL-6-DNMT3B é provável que seja importante para o prognóstico de CEB. Identificação, desenvolvimento e seleção de alvos moleculares são importantes na terapia do cancro. Os dados confirmam a hipótese emergente que o eixo IL-6-DNMT3B é um preditor significativo, e visando DNMT3B pode representar uma estratégia de tratamento promissora para a CEB.