Abstract

O cancro do cólon é um tumor maligno que se desenvolve no cólon e tecidos retais. O prognóstico para o câncer de cólon metastático continua pobre, e novas opções terapêuticas são necessárias para reduzir a mortalidade por câncer de cólon. Recentemente, os níveis intracelulares de AMPc foram sugeridos para influenciar o comportamento das células cancerosas. Curiosamente, ácido fosfatídico cíclico (CPA) e os seus análogos estruturais inibir o crescimento de várias linhas de células de cancro, e o nosso trabalho anterior sugeriu que a produção de cAMP aumenta a CPA. Fosfodiesterase (PDE) tipo 3 e isoformas PDE3A PDE3B são expressos principalmente em tecido cardiovascular e no tecido adiposo, respectivamente. Além disso, o aumento dos níveis intracelulares de AMPc tem sido associado com a inibição do crescimento de células cancerígenas do cólon. Estas descobertas sugerem que a CPA pode ser utilizado na terapia do cancro do cólon. Neste estudo, verificou-se que CPA inibiu o crescimento de células HT-29, que expressam elevados níveis de PDE3B, mas não o crescimento de células DLD-1, que expressam níveis baixos de PDE3B. Além disso, CPA inibiram a fosforilação de Akt em células HT-29 de forma dependente da dose. Os nossos resultados sugerem que a expressão PDE3B e os níveis de AMPc intracelular estão correlacionadas com a proliferação de células cancerígenas do cólon. Estes resultados demonstram pela primeira vez que a CPA pode servir como um útil uma molécula na terapia-alvo para câncer de cólon

Citação:. Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H (2013) cíclica Fosfatídicos Ácido Estimula cAMP Produção e inibe O crescimento em células de cólon humano. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10.1371 /journal.pone.0081139

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de junho de 2013; Aceito: 18 de outubro de 2013; Publicação: 25 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tsukahara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a investigação científica (C) 22591482 (a TT) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, Grant-in-Aid da Takeda Science Foundation (a TT), fundação Astellas para a pesquisa sobre desordens metabólicas (com TT) e Sociedade Nagano para a Promoção da Ciência (para TT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fosfodiesterase de nucleótido cíclico (PDE) é uma enzima que degrada ligações fosfodiéster [1]. Nos seres humanos, as PDEs são codificadas por 21 genes de PDE [1], que são divididas em 11 famílias com base nas semelhanças estruturais, como homologia de sequência de proteínas. As PDEs são um grupo de enzimas que clivam a ligação fosfodiéster no segundo mensageiro cAMP, que desempenha um papel central nas respostas celulares a diversos estímulos extracelulares [2]. Níveis intracelulares de cAMP são regulados normalmente pelo balanço entre as actividades de dois tipos de enzimas, as enzimas geradoras de Camp (adenilato ciclase) e as enzimas de degradação de cAMP (PDE), principalmente em resposta a hormonas e neurotransmissores [3] [4] . PDE3B foi identificado em seres humanos e os seus transcritos são encontradas predominantemente no tecido adiposo [5], e PDE3B tem sido relatada como sendo fosforilada e activada em resposta a insulina e hormonas que aumentam os níveis de cAMP [6].

lípidos bioactivos tais como ácido fosfatídico cíclico (CPA) [7] [8] têm sido sugeridos para aumentar os níveis celulares de cAMP e levar a RhoA inactivação em células de hepatoma [9]. Anteriormente, demonstrou que os níveis de triglicéridos CPA reduzida intracelulares e expressão inibida PDE3B [8]. Além disso, os níveis intracelulares de AMPc em células 3T3-L1 foram encontradas para aumentar após a exposição a CPA. Estes resultados sugerem a via CPA-PDE3B-campo é um alvo molecular específico. Fosfolipase D2 (PLD2) gera CPA a partir de lisofosfatidileolino (LPC), e uma dose baixa de tratamento com insulina de células estimula a actividade PLD2 e aumenta os níveis intracelulares de CPA [7].

Recentemente, PDE3 tem sido sugerido para desempenhar um papel fundamental na invasão de células de cancro e motilidade das células [10]. inibidores de PDE3 tais como cilostazol inibiu o crescimento de células de carcinoma de pulmão de células pequenas [11], a identificação de PDE3 como um alvo para terapia de cancro anti-proliferativo. A redução na actividade PDE3B é acompanhado por aumentos dos níveis intracelulares de cAMP, o qual activa dependente de cAMP de proteína quinase A (PKA) [1]. Em células humanas normais, cAMP promove a proliferação e diferenciação, mas em células de cancro, proliferação de cAMP afecta nitidamente e suprime a proliferação basal a níveis consideravelmente do que em células humanas normais [12]. Além disso, os altos níveis intracelulares de AMPc pode reduzir de forma eficaz no crescimento de células cancerígenas in vitro [1].

Akt (proteína quinase B) tem sido mostrado recentemente para atenuar a sinalização cAMP ativando PDE3B [13]. Desde a sua descoberta como um proto-oncogene, a serina /treonina quinase Akt tornou-se um grande foco de atenção porque Akt regula diversos processos celulares criticamente, incluindo a progressão do câncer [14]. No cancro, a actividade de Akt elevada porque é frequentemente de vários mecanismos, incluindo a perda da função de gene supressor de tumor PTEN [15]. Quando activado, Akt pode fosforilar várias moléculas a jusante envolvidas na regulação da proliferação celular e supressão da apoptose [16]. sinalização de Akt está ligada à formação do tumor, e inibidores de Akt foram desenvolvidos para controlar o crescimento do cancro [14]. No entanto, para o cancro do cólon, as opções terapêuticas são atualmente limitadas, porque estes tratamentos produzem efeitos cardiovasculares e trombóticos adversos [17]. Assim, outras vias de sinalização tem de ser considerado que podem ser utilizados para desenvolver novas estratégias terapêuticas para alvejar o cancro do cólon. Curiosamente, CPA foi reportado para produzir efeitos anti-mitogicos e evitar a invasão de células de cancro in vitro e metástase in vivo [18] [19].

Foi investigada a expressão de isoformas de PDE3 PDE3A 3B e no cancro do cólon humano linhas de células HT-29 e DLD-1. Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) e transferência de Western revelou que PDE3D foi a única isoforma de PDE3 expresso em ambas as linhas celulares. ARNm e proteína PDE3B foram expressos em níveis elevados em células HT-29, e observou-se que os níveis de expressão PDE3B correlacionados com a proliferação de células do cancro do cólon. Descobrimos que o tratamento com CPA elevados de cAMP intracelular e suprimiu a proliferação de células HT-29. Além disso, CPA inibiu a fosforilação de Akt em células HT-29 de forma dependente da dose. Juntos, estes resultados sugerem que a via CPA-PDE3B-cAMP desempenha um crítico na progressão do câncer de cólon

Materiais e Métodos

Reagentes

CPA (18:. 1 ) foi adquirida a partir de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). A dexametasona foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O cilostazol, anticorpo anti-PDE3B (SC-20793), e anticorpo anti-actina β (SC-47778) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) e anti-pAkt S473 (9271S) foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

cultura celular

linhas celulares de cancro do cólon humano HT-29, LOVO, e Caco-2 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). DLD-1, células de adenocarcinoma humano foram obtidos a partir da pesquisa da ciência Saúde Banco de Recursos (Osaka, Japão). As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Nacalai Tesque, Quioto, Japão) ou meio RPMI-1640 (Nacalai Tesque) contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /mL de penicilina, 10 ug /mL de estreptomicina e 2,5 ug /mL plasmocin

TM (Nacalai Tesque) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2.

análise de Western blot

As células foram semeadas em placas de 6 cavidades (Iwaki, Tóquio, Japão) a uma densidade de 1 × 10

5 células /poço. Depois de vários tratamentos (como indicado), as células foram lisadas em gelo durante 30 minutos num tampão de célula-lise (Tris-HCl 20 [pH 7,4], 10% [v /v] de glicerol, 100 mM de NaCl, 1% [v /v] de Triton X-100, 1/100 cocktail de inibidores de protease [Sigma], ditiotreitol 1 mM) e centrifugou-se a 16000 ×

g

durante 20 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram guardados como lisados ​​celulares e analisados ​​quanto ao teor de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os lisados ​​celulares foram então separadas em 5% -20% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) poliacrilamida geles (e-Pagel; ATTO, Tóquio, Japão) e electrotransferidas para membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas durante 1 h com Block Ace (DS Parma Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japão) e incubados com anticorpos primários diluídos em TBS-T com 5% de Block Ace durante 12 h a 4 ° C. As bandas de proteína foram visualizadas usando EzWestLumi mais (ATTO).

análise de PCR quantitativo em tempo real

O ARN celular total foi preparado usando NucleoSpin ARN II (Takara, Shiga, Japão), e 0,5 ^ g de ARN total foi usada para a síntese de ADNc com o kit de RT ReverTra Ás qPCR (Toyobo, Osaka, Japão) de acordo com as recomendações do fabricante. Medimos os níveis de mRNA usando uma Tempo real eco-sistema PCR (Illumina Inc., San Diego, CA) e SYBR Green Realtime PCR Mix Master-Plus (Toyobo) com os seguintes pares de primers sendo usado nas reações: PDE3A, 5′- AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 ‘(F) e 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′ (R); PDE3B, 5’-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 ‘(F) e 5′-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3′ (R); De rRNA 18S, 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ‘(F) e 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’ (R). Todas as reacções de PCR foram realizadas num volume de 10 uL, utilizando 48 placas de poços de PCR (Ilumina). As condições dos ciclos foram 95 ° C durante 10 min (activação de enzimas), seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 15 s, e 72 ° C durante 30 s. Após a amplificação, as amostras foram aquecidas lentamente desde 55 ° C a 95 ° C e a fluorescência foi medida continuamente para se obter uma curva de fusão. Os níveis de ARNm relativos foram calculados utilizando a fórmula 2

-ΔΔCq, onde ΔCq é a diferença entre o ciclo de limiar de um dado ADNc alvo e que de um ADNc de referência endógena. Derivação das fórmulas e os testes de validação foram descritas em Applied Biosystems Boletim No. 2. Utilizador

Medição da proliferação das células

As células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (5 x 10

3 células /poço) e incubou-se durante 24 h. A proliferação celular foi medida utilizando a contagem celular Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão): 10 uL de células de contagem Kit-8 solução foi adicionado ao meio e incubou-se durante 2 h numa incubadora com 5% de CO

2; a quantidade de corante de formazan laranja produzido foi calculada por medição da absorvância a 450 nm num leitor de microplacas (consciência Technology, Inc., Palm City, FL).

fosfodiesterase de nucleótido cíclico ensaio

A actividade de PDE3B recombinante marcado com GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) foi testada usando um kit de ensaio de PDE de nucleótidos cíclicos (Enzo Life Science, Farmindale, NY) em placas de 96 poços e medindo a absorvância a 620 nm com um espectrofotómetro ; Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

Efeito da CPA no nível de AMPc intracelular

As células foram cultivadas em meio livre de soro contendo CPA durante 60 min. os níveis de cAMP celular foram medidos através de ELISA (imunoensaio de cAMP Biotrak sistema enzimático, Amersham Biosciences) em placas de 96 poços e por determinação da absorvância a 450 nm com um espectrofotómetro, seguindo as instruções do fabricante.

interferência de ARN

suprimida PDE3B e expressão de Akt em células HT-29 através da transfecção das células com pequenos ARN interferentes (siRNAs) segmentação PDE3B e Akt (Santa Cruz Biotechnology); RNAiMAX Lipofectamina (Invitrogen) foi utilizado para transfecções. As células foram plaqueadas em placas de 6 cavidades (Iwaki) a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço em DMEM contendo FBS a 10% e, em seguida, transfectadas com 100 pmol /mL de ARNm específico siRNAs ou mexidos siRNAs (controlo) . Redução dos níveis de PDE3B e Akt foi confirmada por transferência Western.

t

-test foi usada

A análise estatística

Student para comparações estatísticas. As diferenças foram consideradas significativas para o

p Art 0,05.

Resultados

O PDE3 isoformas PDE3A e PDE3B são conhecidos por ser expressa em humanos [1]. Para avaliar a função de PDE3 em células de cancro do cólon humano, foi utilizado 4 linhas de células de cancro do cólon, HT-29, LOVO, DLD-1, e Caco-2 (Figura 1A), e examinaram a expressão da proteína PDE3B nestas linhas celulares . PDE3B foi expresso em níveis elevados em células LOVO HT-29 e.

Quatro linhas celulares de cancro do cólon humano (HT-29, LOVO, DLD-1, e células Caco-2) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 % de FBS; os níveis de proteína foram analisadas utilizando SDS-PAGE e Western blotting com um anticorpo anti-PDE3B, e as bandas de proteína foram visualizadas usando um reagente de quimioluminescência aumentada. Cada pista foi carregada com 20? G de lisado de células inteiras. β-actina foi corado como um controlo de carga. (B) em tempo real a medição de PCR da expressão de PDE3A e 3B mRNAs e 18S rRNA (controlo interno) em HT-29 e células DLD-1 (média ± SEM, n = 3, ** p 0,01, Student

t

teste). (C) em tempo real A análise de PCR (esquerda) e Western blot (direita) para a comparação de expressão PDE3B em células HT-29 após o tratamento com CPA (1, 3, e 10 uM) durante 60 minutos (média ± SEM, n = 3 , ** p 0,01,

t

teste de Student)

Para mais estudos, optamos por uma linha celular que expressa altos níveis de PDE3B, HT-29, e um celular. linha de expressar baixos níveis de PDE3B, DLD-1. Concordando com os resultados de expressão de proteínas, PDE3B mRNA também estava presente em níveis mais elevados em células HT-29 do que em DLD-1 células (Figura 1B). Em contraste, o ARNm PDE3A não foi detectado em linhas celulares de. Estes resultados sugerem que PDE3B é a principal isoforma da PDE em HT-29 e células DLD-1. Testou-se o efeito de CPA sobre a expressão de ARNm e proteína PDE3B em células HT-29 (Figura 1C), e verificou que CPA não influenciou a expressão do gene PDE3B, sugerindo que CPA não produz os seus efeitos através da diminuição expressão PDE3B em HT- 29 células. Em seguida, examinou-se o efeito de CPA sobre os níveis intracelulares de AMPc em HT-29 e células DLD-1. Embora AMPc podem promover ou suprimir a proliferação em vários tipos de células, na maioria dos casos parece ser cAMP anti-proliferativa. O tratamento com CPA aumentou substancialmente os níveis de cAMP em células de HT-29, mas não em células DLD-1 (figura 2A). Os resultados acima indicaram que o nível de expressão PDE3B foi correlacionada com o potencial de proliferação de células cancerígenas do cólon. Interessantemente, o tempo de curso experiências mostraram que o tratamento com CPA inibida por hidrólise de cAMP PDE (Figura 2B), o que sugere que o bloqueio da actividade de PDE3 com CPA aumenta a acumulação de AMPc intracelular. No entanto, o cAMP pode exercer o seu efeito anti-proliferativo através de mecanismos distintos em várias linhas celulares.

os níveis intracelulares de AMPc em lisados ​​de cultura foram medidos utilizando o sistema de imunoensaio de cAMP Biotrak enzima. O cilostazol (5 | iM; Cilo) foi usada como um controlo positivo. Os dados estão expressos como médias ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) curso Tempo de inibição da CPA-dependentes da hidrólise de cAMP por PDE3B. PDE3B foi incubada com cAMP e 5′-nucleotidase, com ou sem o CPA (10 uM) durante 10-50 min; o inibidor da PDE IBMX (50 uM) foi usada como um controlo positivo.

O efeito de CPA na proliferação de células foi determinada utilizando um ensaio colorimétrico. Descobrimos que CPA inibiu a proliferação de células LOVO HT-29 e mas não da DLD-1 e células Caco-2 (Figura 3A), que têm menores níveis endógenos de PDE3B que HT-29 e células LOVO [8]. Para testar se PDE3B afeta a proliferação de células HT-29, expressão PDE3B foi derrubado usando siRNAs. O siRNA alvejando-PDE3B derrubado PDE3B de forma eficaz, como se mostra por transferência de Western com um anticorpo anti-PDE3B (Figura 3B). Notavelmente, 24 h após a transfecção com o PDE3B siRNA, a proliferação de células HT-29 foi reduzida substancialmente. Estes resultados indicam que derrubar PDE3B inibe o crescimento de células HT-29.

As células (1 x 10

5 células /poço) foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h ou 48 h a 37 ° C com 5% de CO

2, depois do que 10 mL da solução kit-8 de contagem celular foi adicionado ao meio. Após incubação durante 2 h mais, a quantidade de corante de formazan laranja produzido foi determinada medindo a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Os dados estão expressos como médias ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) Derrubar expressão PDE3B em células HT-29. A proteína total foi extraído a partir de células não transfectadas e a partir de células transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi específicos de PDE3B e analisadas por western blotting com um anticorpo anti-PDE3B; β-actina foi corado como um controlo de proteína de carregamento. (C) Inibição do crescimento de células após knockdown PDE3B foi medida usando a contagem celular Kit-8. As células (1 x 10

5 células /poço) foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h a 37 ° C com 5% de CO

2, após o que 10 ul da contagem celular Kit-8 solução foi adicionado ao meio. Após incubação durante 2 h mais, a quantidade de corante de formazan laranja produzido foi determinada através da obtenção da absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Os dados estão expressos como médias ± SEM (n = 4), ** p 0,01.

Os nossos resultados sugerem que os níveis PDE3B correlaciona-se com a taxa de proliferação celular e que o efeito de PDE3B depende do tipo de célula. Em seguida, determinou-se CPA inibe a fosforilação de Akt em células HT-29, porque muitos dos efeitos da cAMP são mediados através da activação de Akt [20] [21]. Akt está associada com a sobrevivência das células do tumor, proliferação, capacidade de invasão e [22] [23]. Para verificar se CPA contribui para os efeitos de Akt em células HT-29, foram testados como CPA afecta a activação de Akt. A inibição da sinalização de Akt tem sido associada com as acções biológicas de compostos de quimio-preventiva, tais como galato de epigalocatequina, que suprime os níveis marcadamente pakt em tumores intestinais, sem alterar substancialmente [24] níveis Akt total. activação de Akt envolve a fosforilação de dois resíduos, Thr308 na ansa de activação e Ser473 no motivo hidrófobo C-terminal; fosforilação de Ser473 foi examinada amplamente em amostras tumorais como um indicador da actividade de Akt [25]. Em primeiro lugar, examinamos a fosforilação basal Akt Ser473 em células HT-29 e a este local em Akt ser constitutivamente fosforilado (Figura 4A). Além disso, verificou-se se CPA inibiu a fosforilação de Akt em células HT-29. Os nossos resultados indicam que o CPA bloqueou a fosforilação constitutiva da Akt de uma forma dependente da dose (Figura 4, A e B), e que esta inibição de CPA-mediada de fosforilação de Akt durou até 120 minutos (Figura 4C). Embora CPA é um lípido estável e 75% da molécula pode permanecer intacto no meio de cultura durante 24 h [19], CPA pode ser convertido para o LPA com a abertura da estrutura do anel de CPA. Isto levanta a possibilidade de que a clivagem hidrolítica do anel fosfato cíclico de CPA por fosfatases de fosfolípidos em células HT-29 conduz à formação de LPA, que pode activar Akt [26].

(A), a fosforilação de Akt em HT- 29 células tratadas com CPA (1, 3, e 10 uM), NGF (50 ng /ml, controlo positivo), ou dexametasona (inibidor da Akt, 25 uM). Akt fosforilada (P-Akt) e Akt total foram sujeitas detectada por imunotransferência. (B) As intensidades das bandas de Akt foram quantificadas, e o rácio de fosforilado para Akt total foi calculada. Os dados estão expressos como médias ± SEM (n = 3), ** p 0,01. (C) HT-29 células foram tratadas com CPA (10 uM) e os lisados ​​foram recolhidos aos 30, 60, 90, e 120 min. inibição de Akt foi medida como uma perda de Ser473 fosforilação. (D) Derrubar expressão Akt em células HT-29. A proteína total foi extraído a partir de células não transfectadas e a partir de células transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi e analisadas por western blotting com um anticorpo anti-Akt-Akt específica; β-actina foi corado como um controlo de proteína de carregamento. os níveis de (E) intracelular de cAMP em HT-29, tratada com 1, 3, ou 10 pM de CPA durante 60 min após Akt knockdown; os níveis de AMPc foram determinados em lisados ​​de células utilizando o sistema de imunoensaio de cAMP Biotrak enzima. Os dados estão expressos como médias ± SEM (n = 3), ** p . 0,01

Por fim, medimos os níveis de cAMP em células HT-29, na presença e ausência de CPA depois de derrubar Akt; Western blotting com um anticorpo anti-Akt confirmou que o siRNA alvejando-Akt derrubado expressão Akt eficazmente em células HT-29 (Figura 4D). Notavelmente, o tratamento com CPA das células HT-29 com níveis diminuídos de Akt não conseguiu aumentar significativamente os níveis de cAMP (Figura 4E).

Discussão

lisofosfolípido tem sido reconhecido como um metabolito fosfolipídios de membrana. Recentemente, no entanto, o lisofosfolípido emergiu como uma molécula candidata para fins de diagnóstico e farmacológicos, e LPA foi relatado para ser um indutor potente de progressão da doença em vários níveis. Embora CPA é quimicamente semelhante ao LPA, as funções de CPA são distintas entre si ou mesmo oposta às do LPA. Por exemplo, o LPA estimula CPA mas inibe a proliferação celular e a invasão de células do cancro [19] [27] [9]. Além disso, CPA podem suprimir a invasão do cancro e aumentar os níveis de AMPc intracelular [27]. enzimas PDE3 constituem uma das famílias mais estudados de PDEs cAMP-hidrolisar, porque as enzimas PDE3 desempenhar vários papéis em processos fisiológicos e fisiopatológicos no câncer [28]. No contexto do cancro do cólon, o cilostazol inibidor específico da PDE3, que tem sido utilizado anteriormente para o tratamento de pacientes com trombose, foi utilizado para avaliar os efeitos de inibição no crescimento celular PDE3B. A proliferação das células é inibida pelo AMPc através de diversos mecanismos que podem induzir a paragem do ciclo celular em G1 e apoptose [29]. No entanto, o mecanismo através do qual PDE3B está envolvido na produção de AMPc intracelular em resposta a CPA tem permanecido obscura. Realizou-se este estudo em células cancerígenas do cólon usando CPA, que tinha sido mostrado anteriormente para aumentar os níveis intracelulares de AMPc a [8], uma função de CPA que também é sugerida pelas propriedades anti-invasivos de CPA [9]. Descobrimos que CPA inibiu o crescimento de células LOVO HT-29, e, que expressam elevados níveis de PDE3B, mas não o crescimento de DLD-1 e células Caco-2, que expressam níveis baixos de PDE3B. Apoiando estes resultados, a actividade de CPA inibida PDE3B em células que expressam elevados níveis de PDE3B, e siRNA mediada por supressão da expressão PDE3B inibiu o crescimento celular. Estes resultados sugerem que regula os níveis de PDE3B intracelulares de AMPc em células de cancro do cólon e está envolvido no crescimento de células de cancro. Neste estudo, verificou-se que inibiu o CPA fosforilação de Akt em células HT-29 de forma dependente da dose. Akt regula várias funções celulares, incluindo a sobrevivência e proliferação de células e vários aspectos do metabolismo intermediário. No epitélio colónico neoplásica, Akt foi encontrado para ser não só expresso em níveis mais elevados, mas também hyperactivated [30], e estudos em modelos químicos confirmaram que a AKT é regulada positivamente nos estágios iniciais de tumorigénese intestinal. PDE3B expressão e os níveis de AMPc intracelular estão correlacionadas com o potencial de proliferação de células cancerígenas do cólon. Nós corroborada nossas descobertas por meio de análise siRNA e demonstrou uma diminuição na pSer473-Akt com boa correlação entre o grau de produção de cAMP e regulação negativa de Akt fosforilação. Estes resultados sugerem que a via de sinalização de Akt relacionado é rigidamente ligada à via CPA-PDE3B-AMPc e assim indicam pela primeira vez que CPA pode servir como uma molécula útil em terapia dirigida para o cancro do cólon.

Conclusões

Nossas descobertas indicam que cAMP desempenha um papel crítico na inibição do crescimento das células do cancro do cólon pela CPA. Com base em nossos resultados, sugerimos que elucidar os mecanismos moleculares pelos quais CPA induz a produção de AMPc pela inibição da PDE3B em células cancerígenas do cólon podem fornecer informações valiosas que ajudam a explicar como o crescimento de células cancerígenas é regulado. A compreensão de como o crescimento de células do cancro é regulada, por sua vez, ajudar a revelar os mecanismos moleculares da invasão de células do cancro e metástases e facilitar a análise das vias de transdução de sinal que conduzem à proliferação celular. Embora mais pesquisa é necessária para examinar a interação entre as moléculas de sinalização que descrevemos aqui, nossos resultados apoiar coletivamente o potencial uso de CPA como um composto terapêutico para o tratamento de câncer de cólon.