Abstract

tioredoxina redutase 1 (TR1) é um importante regulador de redox em células de mamíferos. Como um antioxidante importante selenoproteína, TR1 é pensado para participar na prevenção do cancro, mas também é conhecido por ser sobre-expresso em muitas células de cancro. Numerosos medicamentos contra o câncer inibir TR1, e esta proteína tem sido proposto como um alvo para terapia de cancro. Nós relatado anteriormente que a redução dos níveis de TR1 em células cancerosas inverteu muitas características malignas sugerindo que a deficiência na função TR1 é anti-tumorigénica. A base molecular para o papel da TR1 no desenvolvimento do cancro, no entanto, não está compreendido. Aqui, descobrimos que, entre selenoproteins, TR1 é sobre-expresso exclusivamente em células cancerosas e sua knockdown em uma linha de células de cancro do rato conduzido por oncogênicos

K-ras

resultou em alterações morfológicas características de células parentais (normal), sem efeito significativo sobre o crescimento das células sob condições de crescimento normais. Quando cultivadas em meio deficiente em soro, TR1 células cancerosas deficientes perder a auto-suficiência de crescimento, progressão manifestar um defeito na sua fase S e uma diminuição da expressão de α ADN polimerase, uma enzima importante na replicação de ADN. Estas observações fornecem evidências de que TR1 é fundamental para a auto-suficiência em sinais de crescimento de células malignas, que TR1 atua em grande parte como uma proteína pró-câncer e é de facto um alvo primário na terapia do cancro

Citation:. Yoo MH , Xu XM, Carlson BA, Patterson AD, Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Segmentação Tiorredoxina Redutase 1 Redução nas células cancerosas Inibe auto-suficiente o crescimento e replicação de DNA. PLoS ONE 2 (10): e1112. doi: 10.1371 /journal.pone.0001112

Editor do Academic: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Setembro, 2007; Aceito: 12 de outubro de 2007; Publicação: 31 de outubro de 2007

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de pesquisa do Câncer, e pelo NIH concede CA080946 e GM065204 para GNV. ADP foi patrocinado pelo PRAT Fellowship, NIGMS, NIH

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

selênio dietético tem prevenção do câncer potente actividade de [1] e ambas as proteínas contendo selénio (selenoproteínas) [2,3] e as referências aí e baixo peso compostos contendo selénio moleculares (selenocompounds) [2 e referências aí] têm sido implicados nesta actividade. O principal papel do selênio na prestação de benefícios para a saúde é provável através da ação de selenoproteins [1]. Tioredoxina reductase 1 (TR1) é um dos 24 selenioproteínas conhecidos em roedores [4], é um importante regulador antioxidante e de redox em células de mamíferos [5,6 e referências aí] e tem um papel essencial no desenvolvimento de [7] de mamíferos. No entanto, esta enzima parece ter efeitos opostos no desenvolvimento do cancro, uma vez que tem sido implicada tanto na prevenção do cancro [8] e promoção do cancro [9] – [12]. Por exemplo, TR1 suporta a função de p53 e tem outras atividades supressores de tumor, e sua segmentação por compostos cancerígenos, eletrofílicos defender o seu papel na prevenção do câncer [13]. Alternativamente, TR1 é sobre-expressa em muitas células cancerosas [9] – [12] e a sua inibição por uma variedade de medicamentos contra o cancro potentes propriedades relacionadas com o cancro alterados de vários tumores e células malignas que sugerem que esta enzima é um alvo para a terapia do cancro [9] -. [12], [14], [15]

não é claro se TR1 câncer prevenção ou propriedades promotoras de câncer de exercer uma maior influência sobre o câncer, se estes efeitos contrastantes operar simultaneamente ou são específicos para diferentes estágios de desenvolvimento do cancro, e como estas propriedades podem ser utilizadas na prevenção e /ou terapia do cancro. Para resolver estas questões, inicialmente examinado o papel de TR1 em uma linha de células de câncer de pulmão e do rato um rato modelo animais e observaram que a redução dos níveis de TR1 inverteu inúmeras propriedades malignas incluindo tumorigenecity [16]. Aqui, nós examinamos função TR1 e papéis no desenvolvimento de cancro numa linha celular de rato maligno para a qual a linha celular parental correspondente (normal) estava disponível, e ainda mais os resultados verificados em várias linhas celulares de cancro humano.

Resultados

Geração das linhas de células malignas e parentais e análise de seus níveis de TR1, juntamente com várias linhas de células humanas cancerosas

células DT, que codificam oncogênico

K-ras

[17] , [18], e as células de NIH3T3 parental (testemunha) foram marcadas com

75Se e os extractos de proteína resultante a electroforese a examinar os níveis de TR1 e outros selenioproteínas (Fig. 1A, painel superior esquerdo). A 55 kDa TR1 é um dos principais selenioproteínas, juntamente com outros selenioproteínas, marcados nesta figura. Claramente, as células DT tem maiores quantidades de TR1 do que as células de controlo. níveis TR1 também foram examinados em células DT controle e por western blot (Fig. 1A, painel inferior esquerdo) que confirmou o aumento dos níveis de TR1 em células DT. Curiosamente, a expressão elevada foi TR1 à custa de outros selenioproteínas, que foram em níveis reduzidos nas células DT em comparação com células de controlo.

linhas celulares indicadas foram metabolicamente marcadas com

75Se, os extractos de células de proteína resultante a electroforese e os géis exposto a um Phosphorlmager (ver Métodos). Selenoproteínas identificados anteriormente em extractos de células [25], [26] são indicadas por uma seta e o nome do lado direito de cada painel. TR1 também foi identificado por transferência de Western em extractos de proteína de cada linha celular, como mostrado nos painéis inferiores. (A, painel da esquerda) de controlo (parental; NIH3T3) e células DT. (A, painel da direita) NIH3T3 (o controlo, as células progenitoras utilizadas na geração de células dt), LLC1 (rato Lewis carcinoma do pulmão), ACHN (carcinoma de células renais de rim humano), A549 (carcinoma de células não-pequenas do pulmão humano), HCT116 ( adenocarcinoma de células do cólon humano) e SNB19 (glioblastoma célula humana). NIH3T3 foi usada como uma linha celular indicadora para comparação dos níveis de TR1 em uma linha de células normais para as linhas de células malignas. (B) DT /pU6-m3 e DT /siTR1. DT (obtido por sobre-expressão do mutante

K-ras em células NIH3T3

) as células foram transfectadas de forma estável com o vector pU6-M3 (controlo) ou siTR1 knockdown vector, respectivamente (ver Métodos).

Além disso, carcinoma do rato Lewis pulmão (LLC1) células [16], juntamente com quatro linhas de células humanas, juntamente com, foram marcadas com

75Se e selenoproteína expressão analisados ​​(Fig. 1A, o painel superior direito). Embora nenhuma célula de controle correspondentes estavam disponíveis para estas linhas de células malignas, comparamos os seus padrões de rotulagem Selenoproteína às de células NIH3T3 normais. A única selenoproteína marcada que parecia estar sobre-expressos em cada uma das linhas de células cancerosas foi TR1. análise de Western blot também mostraram altos níveis de TR1 nas linhas de células malignas humanas e de rato (Fig. 1A, painel inferior direito).

transfecção estável de células DT e de controlo com um vector knockdown siRNA-TR1 e sua caracterização células

DT foram estavelmente transfectadas com o knockdown de siRNA-TR1 (designado DT /siRNA) ou vector de controlo (designado DT /pU6-m3) (Fig. 1B, painel superior). TR1 estava virtualmente ausente em células transfectadas DT /siRNA como demonstrado por metabólica

rotulagem 75Se e Western blot (Fig. 1B, painel inferior).

Os fenótipos das duas linhas de células transfectadas DT foram examinados e comparados às de células de controlo não transfectadas e DT (Fig. 2). As células de controlo cresceram na monocamada e firmemente ligado à placa de cultura, que são características das células normais, enquanto que as células DT /pU6-M3 e DT cresceu em multicamadas e frouxamente ligado à placa de cultura, que são características de células malignas (Fig. 2a). No entanto, as células DT /siRNA tinha uma capacidade significativamente diminuída a crescer em multicamadas e foram mais firmemente ligado à placa de cultura de células quer DT /pU6-m3 ou DT.

(A) Controlo (células NIH3T3, parental) , células DT, DT /pU6-m3 e DT /siTR1. As células foram cultivadas em placas de cultura e fotografado durante o crescimento exponencial (ver Métodos). (B) o crescimento Anchorage-independente do controle, DT, células knockdown DT /pU6-M3 e DT /siTR1. Mil células foram suspensas em agar mole e crescidas durante duas semanas. As placas foram depois coradas com INT durante a noite e fotografado. Os pormenores são apresentados nos Métodos. (C) As taxas de crescimento de controle, as células DT /pU6-M3 e DT /siTR1 em condições normais e soro deficiente. Controle, as células DT /pU6-m3 e DT /siTR1 foram semeadas (2 × 10

5 células /60 milímetros prato) e cultivadas em condições normais de crescimento (painel esquerdo) e células DT /pU6-m3 e DT /siTR1 foram semeada (5 × 10

5 células /placa de 60 mm) e cultivados em meio (painel da direita) de soro deficiente. As taxas de crescimento em meio de soro deficiente foram comparados com os obtidos em condições normais de crescimento.

Uma vez que muitas células cancerosas podem crescer unanchored em agar macio, mas a maioria das células normais não podem, a capacidade de controle, DT, células DT /pU6-m3 e DT /siTR1 a crescer em ágar mole foi examinado (Fig. 2B). DT e células DT /pU6-M3 cresceram em agar mole, enquanto as células de controlo e a DT /siTR1 cresceu fracamente sob estas condições. As propriedades de crescimento em agar mole das duas linhas de células humanas A549, HCT116 e, após a transfecção com o vector de knockdown TR1 e controlo do vector humano correspondente falta siTR1 foram também examinados (ver a Fig. S1 e legenda da figura). Curiosamente, ambas as linhas celulares que codificam siTR1 perderam sua capacidade de crescer em agar mole.

Auto-suficiência em sinais de crescimento

Auto-suficiência em sinais de crescimento tem sido sugerida como uma das seis capacidades adquiridas de fenótipos do cancro e da cascata de sinalização de Ras-Raf-MAPK é conhecido por estar envolvido nesta capacidade adquirida por sinais de crescimento que simulam [19]. Foi examinado o efeito de redução TR1 sobre este fenótipo de controlo de crescimento, as células knockdown DT /pU6-M3 e TR1 em meio regular e soro deficiente (Fig. 2C). Sob condições normais de crescimento, as células tanto DT e DT /siTR1 cresceu mais do que duas vezes a taxa de células NIH3T3, enquanto que as células DT /siTR1 cresceu apenas cerca de 10% menos eficazmente do que as células /pU6-M3 DT (painel da esquerda, Fig. 2C). Assim, TR1 knockdown não diminuiu o crescimento das células DT, excluindo os efeitos associados com a essencialidade TR1 para o crescimento celular. Como muitas células malignas crescer de forma mais eficiente do que as células normais quando cultivadas em meio de soro deficiente, examinámos as capacidades das duas linhas de células transfectadas de crescer em condições de soro deficiente (painel direito). células DT /siTR1 cresceu a cerca de metade da velocidade que as células DT /pU6-M3, ainda sugerindo que as propriedades associados ao câncer de células foram especificamente afetado pelo knockdown TR1.

ciclo celular analsis

análise do ciclo celular de controlo, DT /siTR1 e células DT /pU6-m3, quando cultivadas em meio de soro deficiente, foi levada a cabo para elucidar a fase afectada pela redução na expressão TR1 resultando em atraso de crescimento (Fig. 3). As três linhas celulares foram crescidas durante a noite em meio completo e depois colocados em meio de soro deficiente para 0, 24 e 48 horas. As células foram incubadas com 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) e marcadas com anticorpos para BrdU para avaliar a replicação do ADN e foram incubadas com 7-amino-actinomicina (7- AAD) para avaliar o DNA genómico. Estas células foram então analisadas por FACS (Fig. 3A) e as áreas apropriadas quantificada (Fig. 3B). As três linhas de células tinha um grande número de células, tanto na G0-G1 e fases S quando analisada seguindo imediatamente crescimento activo em meio completo, embora DT /siTR1 tinha mais células na fase S, enquanto as outras duas linhas celulares tinham mais células na fase G0-G1 (ver Tempo 0 nas Figs. 3A e B). A linha celular de controlo tinha cerca de 90% das suas células retidas na fase G0-G1 todo o crescimento em meio de soro deficiente. Esta observação indica que certamente a maioria das células de controlo são mantidas no estado de repouso (G0), que é consistente com a sua incapacidade para crescer sob estas condições de crescimento. A principal diferença ocorreu nas quantidades de células em DT /pU6-m3 e DT /siTR1 linhas de células em 24 horas de crescimento no G0-G1 e fases S, em que as células DT /pU6-m3 tinha uma percentagem muito maior de suas células na fase S e menor percentagem na fase G0-G1 do que DT /siTR1. Na fase S, DT /pU6-m3 tinha cerca de 1,5 vezes mais células cedo do que tarde S, enquanto DT /siTR1 tinha cerca de 3 vezes mais células cedo do que tarde S. Embora as quantidades de células em ambas as linhas celulares transfectadas na G0-G1 e S fases mais estreitamente aproximadas entre si em 48 horas de crescimento, a grande divergência ainda estava presente entre as fases S precoce e tardio nestas duas linhas celulares. Estes achados sugerem que a replicação do DNA foi preso na fase S início células DT /siTR1. Deve também notar-se que as células DT /siTR1 têm valores mais elevados da sua população de células mantidas na fase G2-M do que quer as células DT /pU6-M3 durante a análise de crescimento, sugerindo que mais células dentro da população DT /siTR1 têm dificuldade em fazer a transição de controlo ou em mitose. O possível defeito causando maior retardo de células DTsiTR1 no G2-M fase garante uma investigação mais aprofundada, mas não foi perseguido neste estudo uma vez que não parece afetar a redução global na taxa de crescimento DT /siTR1 comparada com a de DT /pU6-m3 em meio de soro deficiente (ver Fig. 2C).

de controle, células DT /m3 e pU6-DT /siTR1 foram cultivadas em meio de soro deficiente para 0, 24 e 48 horas e incubadas com BrdU durante 6 horas. As células recolhidas foram coradas com anticorpo anti-BrdU para monitorar ADN genómico recém replicado e 7-AAD para acompanhar todo o ADN genómico. As células coradas (A) foram analisados ​​por citometria de fluxo e (B) quantificado em cada fase do ciclo de crescimento por FlowJo. Fases do ciclo de crescimento, G0-G1, a fase S (início S e S tardia) e G2-M foram mostrados e os valores apresentados representam a percentagem da população celular total. Os detalhes das experiências mostradas na figura são dadas em Métodos.

Análise dos factores de polimerases de ADN de

Para elucidar qual o componente (s) pode estar envolvido na replicação de ADN causando uma redução na taxa de crescimento global em meio de soro deficiente em células DT /siTR1 comparação com células /pU6-M3 DT, foram examinados os níveis de α ADN Pol, β, γ e ε, Cdc45 e PCNA, que desempenham um papel neste processo [20 ]. ocidentais análises destes componentes foram realizadas com as três linhas de células em cada ponto de tempo (Fig. 4). ADN pol e Cdc45 α foram altamente enriquecidas em ambas as linhas celulares transf ectadas em comparação com células de controlo em cada um dos pontos de tempo. Curiosamente, o DNA Pol α pareceu ser reduzida em células DT /siTR1 em comparação com células DT /pU6-m3 a 24 horas e, mais significativamente em 48 horas. Além disso, os níveis de ADN Pol ε pareceu ser reduzida em células DT /siTR1 comparação com DT células /pU6-m3 a 48 horas, de controlo e enquanto β ADN Pol pareceu ser reduzida em todos os três pontos de tempo em DT /siTR1 comparados a qualquer células /pU6-M3 DT controlo ou. Parece que o efeito mais pronunciado da redução TR1 em células DT /siTR1 está no DNA Pol α resultando em redução do crescimento destas células em meio de soro deficiente. No entanto, a redução TR1 também pode resultar na redução dos níveis de ADN Pol β, enquanto que os níveis reduzidos de ADN Pol ε às 48 horas em células DT /siTR1 controlo e podem resultar a partir do meio de crescimento de soro deficiente.

Os níveis de expressão de componentes de ADN-polimerase, ADN Pol α, β, δ e ε, Cdc45 e PCNA, no controlo, as células DT /pU6-M3 e DT /siTR1 foram analisadas por western blotting. As células foram cultivadas em meio deficiente em soro durante 0, 24 e 48 horas, colhidas, extractos celulares preparados proteína e sujeito a electroforese como descrito nos Métodos.

Discussão

TR1 tem muitas funções celulares e é amplamente envolvidas em processos celulares que são regulados por redox [9] – [12]. Por exemplo, TR1 tem papéis na proliferação celular, angiogênese, transcrição, o reparo do DNA e serve na defesa antioxidante e redox regulação da sinalização celular (ver comentários [9] – [12]). Sua principal função é pensado para manter a tioredoxina citosólica (Trx1) no estado reduzido utilizando NADPH como doador de elétrons [21]. Por sua vez, Trx1 doa equivalentes redutores de dissulfuretos nas proteínas nucleares e citosólicos mantendo reduzidos os resíduos de cisteína nestas proteínas. Aqui, nós elucidou o papel da TR1 em auto-suficiência de crescimento, demonstrando que a inibição da replicação do ADN em uma linha celular maligna knockdown TR1 está associado com uma redução na expressão α ADN Pol. Além disso, outros estudos sugerem que a replicação de ADN pode ser retardado através da limitação da síntese de ADN, uma vez tiorredoxina tem um papel na manutenção da piscina desoxinucleótido intracelular [11], [22], [23]. No entanto, nós descartou essa possibilidade examinando as piscinas desoxinucle�ido no controle, DT, células DT /pU6-M3 e DT /siTR1 e mostrando que eles não variou durante o crescimento em meio de soro deficiente (ver Fig. S2).

Várias funções e propriedades TR1 sugerem que este selenoproteína tem funções anti-câncer: 1) estresse oxidativo é uma das principais características das células cancerosas e TR1 é um jogador-chave na defesa antioxidante, reduzindo Trx1 e outros reguladores redox em células [ ,,,0],9] – [12]; 2) TR1 é essencial para a função apropriada do supressor do tumor p53 [13]; 3) inibição TR1 por compostos carcinogênicas, eletrofílicos implicado lo na prevenção do câncer [1]; e 4) o aminoácido contendo selénio, Sec, ocupa o local catalítico activo de TR1 [4] e o selénio é conhecido por ter propriedades de prevenção do cancro potentes [1]. No entanto, TR1 também tem sido implicado no desenvolvimento do tumor e de manutenção: 1) que é sobre-expressa em muitos tumores e linhas celulares [9] – [12]; 2) vários fármacos anti-tumorais são inibidores potentes de TR1, sugerindo que esta enzima é um alvo para a terapia do cancro [9] – [14]; 3) a remoção de alvo TR1 inverte morfologia e outras características do cancro de células malignas [16] (ver também Figuras 2 e 3 e Texto S1).; e 4) a deficiência de selênio foi relatado para diminuir a formação de tumor é alguns modelos de câncer em animais [24].

Como pode o papel de TR1 no desenvolvimento do câncer ser conciliado com o seu papel na supressão do tumor, bem como o conhecido Propriedades de selénio anti-cancro, que é um componente catalítico de TR1? Ele é tentador especular que a quantidade adequada de selénio na dieta, em geral, e um nível de expressão suficientes de TR1, em particular, manter a homeostase redox celular em células normais, protegendo-os contra o estresse oxidativo, mutações no DNA e danos a outros componentes celulares. Assim, TR1, juntamente com outros selenioproteínas, pode funcionar na prevenção do cancro pela inibição da transformação maligna. No entanto, em tumores emergentes, a demanda por TR1 aumentar muito como esta proteína parece ser necessário para sustentar o crescimento do tumor, provavelmente devido ao aumento da demanda por seus equivalentes redutores pela via Trx1 e, como mostrado neste trabalho, a replicação do DNA. Esta proposta explica tanto a atividade de prevenção de câncer potente de selênio na dieta e os papéis contrastantes de TR1, tanto na prevenção e promoção do câncer. Além disso, este estudo fornece a base para explicar os dados da literatura diferentes sobre o papel desta proteína enigmática no cancro e eleva TR1 ainda mais como um [8] – [12], [14] – [16], sem dúvida, tem um grande impacto sobre como nos visão a ingestão de selénio na dieta de seres humanos e outros mamíferos. Tem sido conhecido durante algum tempo que as dietas que contêm quantidades suficientes ou suplementares de selénio ter efeitos benéficos na prevenção de certas formas de cancro, possivelmente através da acção de enriquecer a população selenoproteína [1]. No entanto, o cuidado deve ser expresso em que uma vez que um tumor maligno é iniciada, em seguida, quantidades adequadas ou enriquecidos de selênio na dieta podem servir para conduzir tumorigênese. Nosso estudo adiciona uma camada importante para entender os papéis de processos redox na evolução do cancro e o uso da dieta na prevenção e tratamento do câncer.

Materiais e Métodos

Materiais

75Se (actividade específica 1000 Ci /mmol) foi obtida a partir da Research Facility Reactor, Universidade do Missouri, Columbia, MO. membrana de PVDF, NuPAGE 4-12% Bis-Tris géis, higromicina B, Lipofectamine 2000, meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD), solução de antibiótico-antimicótico e soro fetal de bovino eram de Invitrogen Life Technologies. siRNA vector pSilencer 2,1-U6 Hygro foi comprado de Ambion, Inc. e ρ-iodonitrotetrazólio violeta (INT) a partir de Sigma. Os anticorpos contra o ADN-polimerase α, β, δ ε e foram adquiridos a partir de Abcam, Inc. e os anticorpos contra PCNA e Cdc45 eram de Santa Cruz Biotechnology, Inc .. reagente de ensaio de proteína BCA, SuperSignal Oeste Dura prolongado Substrato Duração e anticorpo secundário conjugado com HRP eram de kit de fluxo Thermo Fisher Scientific Inc. FITC BrdU foi adquirido da BD Pharmingen ™. linha celular de cancro DT que codifica oncogénicos

K-ras e

originado em células NIH3T3 (parental), foi generosamente fornecido pelo Dr. Yoon Sang Cho-Chung e células NIH3T3 foram obtidas da American Type Culture Collection. células (murganho carcinoma do pulmão de Lewis) LLC1 foram obtidos como dado [16] e linhas de células de humano ACHN (carcinoma de rim humano de célula renal), A549 (carcinoma de células não-pequenas do pulmão humano), HCT116 (adenocarcinoma de células do cólon humano) e SNB19 (humano glioblastoma células) foram obtidos a partir da NCI, DTP, Tumor Repository DCTD no NIH, Bethesda, MD.

Cultura de células de mamíferos e ensaios de crescimento de células

células NIH3T3 e DT foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% e solução de antibiótico-antimicótico a 37 ° C, 5% de CO

2 numa incubadora humidificada. Estavelmente transfectadas (knockdown TR1) siTR1 células dt e células DT controlo pU6-m3 estavelmente transfectadas foram preparadas por transfecção com as construções correspondentes com Lipofectamine 2000 e, em seguida, seleccionando as células na presença de 500 ug /ml de higromicina B exactamente como descrito [16] .

Morfologia do NIH3T3, DT, as células DT /pU6-m3 e DT /siTR1 foram avaliados durante o crescimento exponencial por células em placas de cultura de 60 mm a semeadura, as células crescido exponencialmente e fotografado com um microscópio de contraste de fase invertida . As taxas de crescimento de células NIH3T3, as células DT /pU6-m3 e DT /siTR1 foram avaliadas por sementeira 2 × 10

5 células /60 cultura mm de prato e depois de 48 crescimento horas, as células foram colhidas com tripsina-EDTA, e as células contadas pelo método de extrusão com azul de tripano [16]. Para avaliar a taxa de crescimento de células em condições de soro deficiente, as células (5 × 10

5 células /60 mm de prato de cultura) foram semeadas e colhidas após 24 e 48 horas de incubação em meio contendo todos os componentes de meio completo, excepto 0,5% FBS em lugar do FBS a 10%, e as células contadas como acima.

análise de transferência de western e

75Se marcação das células

as técnicas para a análise de western blot e de marcação das células com

75Se foram detalhados em outros lugares [16]. Resumidamente, para a análise de Western Blot, as células foram lavadas com lisados ​​celulares de PBS frio e integrais preparadas utilizando tampão de lise (20 mM de Tris-Cl, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100,% de desoxicolato de sódio 0,5, NaF 10 mM, 5 mM EDTA, e cocktail de inibidores de proteinase). As quantidades de proteína em extractos de células foram medidos utilizando o reagente de ensaio de proteína BCA, 30 ^ g de amostras de proteína a electroforese sobre geles de NuPAGE 4-12% Bis-Tris, as proteínas separadas transferidos para uma membrana de PVDF, e em seguida incubou-se inicialmente com o anticorpo primário ( policlonal anti-TR1, anti-ADN Pol α, β, δ, ε, anti-PCNA e anti-Cdc45) e finalmente com anticorpo secundário conjugado com HRP. As membranas foram feitos reagir com SuperSignal Oeste Dura Duração estendido do substrato e exposta a filme de raios-X.

Para

75Se a rotulagem, as células foram semeadas sobre um 6 bem placa (3 × 10

5 células /bem), incubadas 24 horas, depois marcado com 40 uCi de

75Se durante 24 horas, colhidas e lisadas, como descrito acima. 40 ug de cada amostra foram aplicados em gel de NuPAGE Bis-Tris a 4-12%, a electroforese, as proteínas coradas com solução de coloração com azul de Coomassie, o gel seco e exposto a um Phosphorlmager (Molecular Dynamics). selenoproteins

75Se marcado em géis expostos foram identificados por auto-radiografia [16].

ensaio de agar macio

O crescimento de células em agar macio para avaliar a sua capacidade para sustentar o crescimento independente de ancoragem tem sido detalhado em outro lugar [16]. Em resumo, um total de 1000 de controlo, DT, células DT /pU6-m3 ou DT /siTR1 foram suspensos em 3 ml de 0,35% de agar nobre em meio de crescimento com 10% de FBS, e espalhar uniformemente sobre 60 placas mm cobertos com uma célula basal 4 ml camada de 0,7% de agar nobre em DMEM. As placas foram incubadas numa humidificada de CO

2 incubadora durante 14 dias, a 0,5 ml de meio de crescimento fresco adicionado sobre a placa de agar a cada 5 dias. As colónias que se desenvolveram foram visualizados por coloração com violeta ρ-iodonitrotetrazólio (INT) durante a noite e as placas fotografadas.

ciclo celular análise

As células foram semeadas em placa de cultura de células (5 × 10

5 células /placa de 60 mm) e incubadas durante a noite antes da transferência para meio de soro deficiente em (0,5% de FBS em DMEM). As células foram incubadas com 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) 6 horas antes da colheita, BrdU células marcadas colhidas em pontos de tempo determinados (0 horas, 24 horas e 48 horas) e coradas com anticorpos para monitorizar o ADN replicado. As células recolhidas foram fixadas e permeabilizadas com uma solução de BD Cytofix /CytopermTM Fixação /Permeabilização para coloração intracelular. Para a coloração de ADN replicado, de BrdU incorporada foi sondado com ADN genómico de anti-BrdU e anticorpo inteiro foi corada com 7-amino-actinomicina D (7-AAD) seguindo os procedimentos do fabricante. As células contendo os respectivos estados de ADN foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um FACS Calibur 2 Classificador (Beckton Dickinson) e o número de células em cada fase do ciclo celular foi quantificada por FlowJo (ár, Inc.).

Informações de Apoio

S1 texto.

doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s001

(0,03 MB DOC)

Figura S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s002

(3.54 MB TIF)

Figura S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s003

(0,82 MB TIF)