Abstract

Nossos estudos anteriores sugerem que as células Th17 acumulam nos tecidos tumorais e correlacionar com a recorrência dos doentes com cancro do colo do útero. No entanto, a fonte do aumento das células Th17-se infiltram no tumor permanece pouco compreendido. Nós investigamos a prevalência, fenótipo e tráfico de propriedade de células Th17 em pacientes com câncer cervical. Os nossos resultados mostraram que as células Th17 altamente agregadas dentro dos tecidos tumorais em um fenótipo activado com marcadamente aumentou a expressão de CCR6. Correspondentemente, o nível de CCL20 nos tecidos de tumor foi significativamente mais elevada do que em não-tumoral e tecidos de controlo normais, e fortemente positivamente associado com células Th17. Além disso, no ensaio in vitro de migração mostrou CCL20 tinha quimiotaxia eficaz de células circulantes Th17. Em conclusão, as células Th17 são recrutados em tecidos tumorais, preferencialmente, através de via CCR6-CCL20, que pode servir como um novo alvo terapêutico para o câncer cervical

Citation:. Yu Q, Lou Xm, Ele Y (2015) Recrutamento preferencial das células Th17 ao câncer cervical pela via CCR6-CCL20. PLoS ONE 10 (3): e0120855. doi: 10.1371 /journal.pone.0120855

Editor do Academic: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 15 de outubro de 2014; Aceito: 27 de janeiro de 2015; Publicação: 13 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o segundo câncer mais comum em mulheres em todo o mundo [1]. Há cada vez mais evidências de que as células CD4

+ T-helper (Th) desempenham um papel importante na manutenção da resposta imune contra o câncer [2, 3]. células Th17 são uma nova subconjunto de interleucina IL-17, a produção de células CD4

+ T células [4] que foram mostrados para desempenhar um papel crucial na inflamação e doença auto-imune [5-7], ao mesmo tempo, acumulando em tumores, tais como carcinoma hepatocelular [8], câncer gástrico [9], o cancro do pulmão [10], e carcinoma de esôfago [11]. Nosso estudo anterior também constatou aumento do número de células Th17 em tecidos tumorais de câncer do colo do útero e sua associação independente com recorrência após a operação [12]. Estes estudos sugerem que as células Th17 podem contribuir para a imunopatogénese de diversos tipos de cancros.

Antes de células T podem exercer os seus efeitos sobre células de cancro, eles têm de atingir sítio alvo. A migração de células T para o local de destino é um processo multi-passo, no qual os sinais de quimiocinas /receptores de quimiocinas desempenham um papel fundamental [13]. Diferente de CD4

+ populações de células T em humanos e ratinhos exibir diferentes padrões de expressão do receptor de quimiocina. Em microambiente do tumor, as células Th1 expressam CCR5 e CXCR1, as células Th2 expressam CCR4 e CCR8, enquanto que as células T reguladoras principalmente expressam CCR4 [14]. Estudos recentes sugerem que as células Th17 expressam CCR2, CCR4, CCR6 e no sangue periférico de adulto humano [15, 16]. No entanto, os determinantes migratórios para a migração de células Th17 em tecidos tumorais de pacientes com câncer cervical permanecem desconhecidos. Neste estudo, verificou-se que o eixo CCR6-CCL20 determina principalmente a migração de células circulantes Th17 em tecidos tumorais em doentes com cancro do colo do útero.

Pacientes e Métodos

Declaração de Ética

o protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Hangzhou Obstetrícia e Ginecologia do Hospital. consentimento informado por escrito foi obtido de pacientes de acordo com a Declaração de Helsinki.

Assuntos

Um total de 35 pacientes com câncer de colo do útero, que foram submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital das primeiras pessoas de Hangzhou entre 2012 e 2013, foram incluídos neste estudo. Combinado sangue periférico (PB), tumores, e os correspondentes tecidos não tumorais foram obtidos a partir desses doentes. Nenhum dos pacientes receberam terapia anticancro ou outras intervenções médicas. As características do paciente (como é observado na Tabela S1).

Isolamento de PBMC, Til, e

células mononucleares do sangue periférico NIL

(PBMC) foram isoladas por Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) separação por gradiente de densidade. os linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) e linfócitos infiltrantes não-tumorais (Nenhum tratamento) foram isolados como descrito por Pang e o seu colega [17]. Resumidamente, o tecido foi cortado em pequenos pedaços e incubados em uma mistura de enzima contendo 0,05% de colagenase IV (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 0,001% de DNase I (Sigma-Aldrich) durante 1 h. tecidos dissociadas foram então moído através de um filtro de 70 mícrons, e as células mononucleares foram obtidas por separação por gradiente de densidade usando Ficoll-Hypaque.

A citometria de fluxo

PBMC, TIL e NIL foram coradas com fluorochrome- anticorpos monoclonais conjugados com contra CD3 humano, CD4 CD45RO, o HLA-DR, CCR2, CCR4, CCR6, CD11a, CD49d, CD103, PD-1, granzima B, e IL-17 (BD PharMingen, San Diego, CA). As células foram estimuladas a secretar citocinas durante 4 horas com 100 ng /mL de miristato acetato de forbol (PMA), 1 ug /ml de ionomicina (Sigma-Aldrich) e 2 ^ M de monensina (Enzo, Plymouth, PA). Para a coloração intracelular, as células foram permeabilizadas e fixadas utilizando Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) de acordo com as instruções do fabricante. Após a coloração, de três ou quatro cores de citometria de fluxo foi realizada utilizando fluxo LSR II citómetro (Becton Dickinson, San José, CA), e os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo (ár, Inc., Ashland, OR).

imuno-histoquímica de coloração

parafina-embedded, tecido hepático fixado em formol foi cortado em secções de 4 mícrons. A recuperação de antígenos foi pré-formado através de cozedura sob pressão durante 10 minutos em tampão de citrato (pH 6,0). Anticorpos de rato FoxP3 anti-humano (diluição, 1: 200; Abcam, Cambridge, Reino Unido) e de coelho anti-IL-17 humana (diluição, 1: 150; P amp; D System, Minneapolis, MN) foram usadas para os anticorpos primários . Diaminobenzidina é utilizado para substrato seguinte contracoloração com hematoxilina para a coloração única.

-PCR em tempo real

O ARN foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e sintetizados por cDNA usando QuantiTech kit de transcrição reversa (Qiagen). Quantitative PCR em tempo real foi realizada em mistura SYBR Verde PCR Master (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando o ABI Prism 7500 em tempo real PCR System (Applied Biosystems). Foram utilizados os seguintes iniciadores: GAPDH: CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGA C (para a frente), TGA GCG ATG TGG CTC GGC T (reverso); CCL17: CCA GGG ATG CCA TCG TTT (para a frente), GGT GGA GGT CCC AGG TAG TC (reverso); CCL20: GAC ATA GCC CAA GAA CAG AAA (para a frente), GAC AAG TCC AGT GAG GCA CAA (reverso); e CCL22: GGA GGC AAA GAG TAG GGT GTA AT (para a frente), TCA GCC AGA AAG GCA TAG ATA GA (reverso). As amostras foram executadas em triplicado, e sua expressão relativa foi calculada pela seguinte fórmula utilizando GAPDH como controles endógenos:. 2

-ΔΔCt

Ensaio de Quimiotaxia

ensaios de migração foram realizados em PBMC usando o sistema Transwell, como previamente descrito [18]. As PBMC (1 x 10

6) num volume de 200 ul foram adicionados aos poços superiores (tamanho de poro de inserção, 5um; Millipore, Billerica, MA). quimiocinas humanas (CCL20, CCL21 e CCL22, 100 ng /ml de cada um; tudo a partir de R D sistema, Minneapolis, MN) ou sobrenadante de células HeLa, células SiHa ou células C-33A (Cell Research Institute da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China) foram adicionados à câmara inferior num volume de 900μl. As células HeLa (HPV-18 linhas de células cervicais infectados), células SiHa (infectadas linhas celulares cervical de HPV-16) e células C-33A (HPV células de cancro cervical negativos) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS numa humidificada de CO2 a 5% a 37 ° C. O sobrenadante das células cancerosas utilizadas para o ensaio de quimiotaxia foi recolhido após a cultura de 3 a 5 dias de idade. Os anticorpos para CCL20, CCL21 e CCL22 (R D System) foram adicionados imediatamente antes das experiências quimiotácticos, a uma concentração de 500 ng saturado /ml. Após 4 h de quimiotaxia a 37 ° C, as células nos poços inferiores foram recolhidas, e foram estimuladas com 100 ng /ml de PMA e 2 ^ M de monensina, durante 4 h. As células foram depois permeabilizadas e fixadas utilizando Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) e coradas com contra a IL-17 conjugado com fluorocromo. O número absoluto de células foi contado e calculado utilizando o Sistema de Contagem Perfect (Cytognos, Salamanca, Espanha). Para cálculo do índice de migração, o número de células que migraram para quimiocinas foi dividida pelo número de células que migraram para o meio de controlo [19].

A análise estatística

Todos os dados estatísticos foram analisados ​​usando SPSS , versão 16.0. As diferenças entre os grupos foram analisados ​​utilizando one-way ANOVA, Mann-Whitney U, ou o teste χ2 quando apropriado. coeficiente de Pearson foi calculado para avaliar a associação entre os níveis de quimiocinas e de células Th17 no ambiente do tumor. Os dados foram expressos em média ± S.E.M. A significância estatística foi fixado em

P Art 0,05.

Resultados

Distribuição de células Th17 em pacientes com câncer cervical

Para estudar a distribuição das células Th17 no local do tumor, NIL e TIL foram isoladas de não tumorais emparelhados e tecidos tumorais em 35 pacientes com câncer cervical e caracterizados através de citometria de fluxo (Fig. 1A). Como esperado, a frequência de células Th17 no tecido tumoral, o que representa 11,49 ± 1,19% de CD4

+ células T, foi significativamente maior do que aqueles em tecido não-tumoral (3,68 ± 0,48%,

P 0,001), e do sangue periférico de pacientes com câncer cervical (4,96 ± 0,72%,

P Art 0,01) e dadores saudáveis ​​(1,67 ± 0,19%,

P Art 0,001; Fig . 1B). Além disso, a proporção de células Th17 em circulação também foi maior em pacientes com câncer cervical em comparação com os doadores saudáveis ​​(

P Art 0,001). coloração imuno-histoquímica também observadas células Th17 substanciais no tecido tumoral de cancro cervical, ainda mais elevadas do que as células T reguladoras (Tregs) no mesmo ambiente (Fig. 1C). Estes resultados sugerem coletivamente que as células Th17 são altamente enriquecido em doentes com cancro do colo do útero, especialmente no tecido tumoral.

células Th17 foram fechado de CD3

células + T por citometria de fluxo. (A) Representante IL-17 perfis de expressão em CD4

+ células T dos quatro grupos estudados. As percentagens representam a frequência de células Th17 entre CD4

+ células T. (B) A análise estatística mostram que a frequência de células Th17 foi maior em pacientes com cancro do colo do útero, especialmente entre os linfócitos infiltrantes de tumor (n = 35). **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. (C) imagens representativas de células Th17 (IL-17

+) e Tregs (FoxP3

+) infiltração no tecido câncer cervical do mesmo paciente. células imunomarcadas (Brown, indicados pela seta preta) e células tumorais (azul). Ampliação, × 100.

Além disso, a prevalência de células Th17 foi maior em tumores avançados do que em tumores em estágio inicial (8,12 ± 1,31% em FIGO I vs. 14,18 ± 2,78% em FIGO II vs. 15,50 ± 1,73 no FIGO III; a Fig. 2). No entanto, não houve diferenças significativas na prevalência de células Th17 para a idade, o status do HPV, o tamanho do tumor, profundidade de infiltração, status do nó de linfa, linfo-vascular invasão do espaço e diferenciação do tumor (Fig. 2).

a comparação da frequência de células que se infiltram no tumor Th17 em pacientes com câncer cervical em diferentes idades, status do HPV, tamanho do tumor, estágio FIGO, profundidade de infiltração, de status do linfonodo, linfa-vascular invasão do espaço (Lvsi) e diferenciação do tumor. A análise estatística mostrou que a frequência de células Th17 em tecidos tumorais foi aumentada de FIGO I FIGO III, mas não associado com os outros parâmetros clínicos. *

P Art 0,05.

características fenotípicas de células infiltrantes tumorais Th17

Em seguida, analisamos a expressão de marcadores relacionados com a função de ativação /efetoras (CD45RO e HLA-DR) e imunossupressão (granzima B e PD -1). células Th17-se infiltram no tumor expressa alta CD45RO, HLA-DR, mas baixa granzima B e PD-1 (Fig. 3A). Granzima-B dependentes de citólise [20] e B7-H1 /DP-1 via [21] contribuir para a supressão imune no microambiente tumoral. Estes resultados indicaram que as células Th17-se infiltram no tumor exibiram um fenótipo de memória activado (CD45RO

+ HLA-DR

+), mas não pode mediar funções efectoras através da granzima B ou B7-H1 /DP-1 via (A granzima B

– /DP-1

-.)

(A), os perfis de expressão representativos de CD45RO, HLA-DR, A granzima B e DP-1 em células Th17-se infiltram no tumor. As percentagens representam as frequências de vários marcadores em células Th17. (B) perfis de expressão representativos de CCR4, CCR6 e CD49d sobre células Th17 do sangue periférico (longa linha pontilhada), não tumoral (linha pontilhada) e tecidos tumorais (linha sólida). As percentagens representam as frequências de vários marcadores de células Th17-se infiltram no tumor. (C) A análise estatística da expressão de superfície de CCR4, CCR6, CD49d em células Th17 de tecidos de sangue periférico, não-tumorais e de tumores (n = 25). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001.

migração de linfócitos ocorre através de um processo de múltiplos passos, em que a sinalização do receptor de quimioquina /quimiocina é um evento essencial, seguido pela adesão mediada por integrina a parede dos vasos [13]. Portanto, foram analisadas mais as expressões de superfície de receptores de quimiocinas (CCR2, CCR4 e CCR6) e integrinas (CD49d, CD11a e CD103) em células Th17. células Th17-se infiltram no tumor expressa altos níveis de CCR4 (cPBMC: 38,83 ± 3,90%, NIL: 42,76 ± 2,84%, TIL: 57,61 ± 2,99%;

P Art 0,001 e 0,01 para TIL vs. cPBMC e vs. NIL, respectivamente), CCR6 (cPBMC: 22,17 ± 2,04%, NIL: 42,89 ± 3,23%, TIL: 72,97 ± 2,45%;

P Art 0,001 para TIL vs. cPBMC e vs. NIL) e CD49d (cPBMC: 63,13 ± 3,74%, NIL: 56,59 ± 3,10%, TIL: 74,24 ± 2,69%;

P Art 0,05 e 0,001 para TIL vs. cPBMC e vs. NIL , respectivamente) (Fig. 3B e 3C), mas não CCR2, CD103, e CD11a (dados não mostrados). As moléculas teleguiados expressas pode ser associado com a migração de células Th17 e de retenção, dentro do tumor [22].

Associações de níveis de quimiocinas com células Th17 intratumorais

Como as células Th17 CCR6 altamente expresso e CCR4, nós a hipótese de que as células Th17 poderiam migrar em resposta a CCL20, CCL22 e CCL17. Nós determinamos a expressão de CCL20, CCL22 e CCL17 por PCR em tempo real. Encontrámos significativamente mais elevada expressão de mRNA de CCL20 nos tecidos tumorais em comparação com tecidos que não de tumor e tecidos de controlo normais (

P

. 0,01, figura 4A). Além disso, observou-se uma forte correlação positiva entre a prevalência de células Th17 e expressão intra-tumoral da CCL20 (R = 0,795,

P

0,001; Fig. 4C). Estes dados sugerem que CCL20 é um sinal importante para mediar o tráfico de células Th17 a tumores. Pelo contrário, não se encontrou um aumento da expressão de CCL17 e CCL20, os dois ligandos específicos de CCR4, no tecido do tumor (Fig. 4A). Além disso, a análise de regressão só encontrou fraca correlação das células Th17 com CCL22 (R = 0,385,

P Art 0,05; A Fig. 4D), mas não com CCL17 (

P Art 0,05, a Fig. 4B), no mesmo microambiente do tumor. Os resultados indicam coletivamente que CCR4-CCL17 /eixo CCL22 pode não ser o principal responsável para a migração de células Th17.

(A) PCR em tempo real de CCL17 quimiocinas, CCL20 e CCL22 no tumor (T) e não tumoral (nT) regiões de pacientes com câncer cervical e no controle normal (NC). O valor foi normalizado para GAPDH, multiplicado por 10

5, e se a transformação logarítmica. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. (B, C, D) Correlações de quimiocina CCL17 (B), CCL20 (C) e CCL22 (D) com a frequência de células Th17-se infiltram no tumor. A análise estatística mostrou uma forte correlação de CCL20 com células Th17 no tumor.

Foram observados efeitos de quimiocinas na Th17 recrutamento de células

respostas quimiotáticas significativas de circulando células Th17 a CCL20 humana recombinante em doses forma dependente (Fig. 5A). Além disso, um anticorpo monoclonal neutralizante para CCL20 foi marcadamente bloqueou a migração induzida por células CCL20 de Th17 (

P

. 0,001, Figura 5A). Embora CCL17 e CCL22 pode também induzir a migração de células Th17, o seu efeito foi significativamente mais fraco do que o fez CCL20 (índice de migração na concentração de 100 ng /ml: CCL20, 45,5 ± 10,6 vs CCL17, 19,1 ± 6,5 vs e CCL22, 26,1 ± 7,9, ambos

P Art 0,001; A Fig. 5A). Para determinar adicionalmente se quimiocinas segregada-tumorais teve um efeito sobre o recrutamento celular Th17, ensaio de quimiotaxia utilizando sobrenadantes de cultura de linhas celulares foi realizada cervicais. As células HeLa são células cervicais infectados pelo HPV-18, células SiHa são células cervicais infectados pelo HPV-16 e células C-33A são HPV negativo células cancerosas cervicais. Todas as três células cervicais poderia altamente secretam CCL20 com mais alto nível de CCL20 por células HeLa (Fig. 5B e 5C), e induziu a migração de células Th17 significativa (Fig. 5D). Isto pode ser eficientemente bloqueada pelo anticorpo contra sozinho ou em combinação com CCL17 e CCL22 CCL20 (

P

0,001), mas significativamente menos eficaz pelo anticorpo contra a CCL17 ou CCL22 (Figura 5B.). Estes resultados indicam colectivamente que CCL20 pode induzir a migração de células Th17 eficaz em tecidos de tumores.

Os ensaios de migração foram realizadas num sistema Transwell. (A) células Th17 migrar em resposta a CCL17 recombinante humana, CCL20 e CCL22 no modo dependente da dose (n = 5). anticorpos específicos para quimiocinas inibir significativamente a migração de células Th17 ***

P 0,001. (B e C) Expressão de CCL20 por HeLa, Siha, e células C-33A detectada usando RPC em tempo real (B) e ELISA (C). Todas as três células cervicais poderia altamente secretam CCL20 com mais alto nível de CCL20 por células HeLa. células (D) Th17 também migram para sobrenadantes de cultura de células HeLa, Siha, e células C-33a, que pode ser eficientemente bloqueados por anticorpos contra CCL20 sozinho ou em combinação com CCL17 e CCL22, mas significativamente menos eficaz pelo anticorpo contra a CCL17 ou CCL22 ( n = 3). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001.

Discussão

Como relatado em outros tumores sólidos [8, 10, 11, 19, 23-25], o presente estudo mostrou que as células Th17 substanciais, exibindo um activada fenótipo de memória, estão concentrados no tecido do cancro do colo do útero. No entanto, o papel das células na imunidade Th17 cancro continua a ser misturada. O acúmulo de evidências indica que, embora pacientes com câncer apresentam um status imunossupressora generalizada, a reação inflamatória no local do tumor pode promover o crescimento e progressão tumoral. A perpetuação da inflamação crónica é em grande parte conseguido através de loops de feedback positivo, que incluem células inflamatórias que produzem citocinas que induzem a síntese de quimiocina em células malignas do estroma e conduzindo ao recrutamento prolongada de células inflamatórias para o microambiente do tumor [26]. células Th17 são um dos subconjuntos de células imunitárias mais críticos a este respeito e, portanto, têm efeito indutor de tumores. Em pacientes com carcinoma hepatocelular, câncer colorretal ou câncer do esôfago, níveis elevados de células Th17 intratumorais foram encontrados para ser positivamente associado com mau prognóstico [8, 24, 27]. Por outro lado, as células Th17, por vezes, pode fornecer ajuda importante para aumentar a imunidade citotóxica e assim exercer efeitos supressores de tumor [28, 29]. Nosso estudo anterior mostraram que as células Th17 intratumorais elevadas prevêem diminuição da recorrência local em pacientes com câncer cervical [12], de acordo com relatórios anteriores em câncer de ovário [25] e melanoma [30].

As fontes de Th17 células em tecidos de cancro do colo do útero pode incluir o tráfico de células circulantes para tumores Th17 e Th17 células induzidas localmente. A migração de células T é rigorosamente regulada pela interacção do receptor de quimioquina /quimiocina [31]. Estudos anteriores mostraram que o recrutamento de células Th17 é regulada por vias múltiplas, incluindo CCR2-CCL2, CCR4-CCL17 /CCL22 e CCL20 CCR6-[15, 16, 19, 32]. Neste contexto, encontramos o tráfico de circulação de células Th17 no tecido tumoral do câncer cervical foi preferencialmente através pathway CCR6-CCL20. Esta conclusão é baseada em duas constatações. Em primeiro lugar, CCL20 tinha marcadamente elevados de expressão em tecido de tumor e fortemente associada com a prevalência de células Th17 no mesmo microambiente. Em segundo lugar, o Th17 circulante de doentes com cancro cervical altamente expresso CCR6, e migrar selectivamente em resposta a CCL20 in vitro. No passado, CCR6 foi implicado principalmente para ser responsável pelo recrutamento de células inflamatórias Th17. Fox exemplo, CCR6 é essencial para o recrutamento de células Th17 óptima para locais de inflamação mediada por Th17 em encefalomielite auto-imune experimental (EAE) [7]. No entanto, acumulando resultados recentes mostram que o CCR6 em células Th17 também desempenha um papel crítico no desenvolvimento do tumor [8, 24]. É bem aceite que o efeito de células imunitárias no desenvolvimento do tumor é determinada por não só a sua pro- ou anti-potencial, mas também de localização apropriado [33]. Todos estes resultados, juntamente com os nossos dados, mostram CCR6 expressa por células Th17 é funcional e desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro cervical. Além disso, embora o R4CC também pode estar relacionada com a migração de células-Th17, o efeito é muito mais fraco do que CCR6 de acordo com a menor expressão de CCR4, níveis mais baixos de intratumorais CCL17 e CCL22, e respostas mais fracas aos chemotacitc CCL17 e CCL22.

Em conclusão, mostramos aqui que via CCR6-CCL20 é quimioatrativo preferencial para o tráfico de circulação de células Th17 no tecido tumoral do câncer cervical. Os resultados alargar a nossa compreensão do mecanismo de carcinogênese cervical, e prever uma estratégia potencial para o tratamento de câncer cervical.

Informações de Apoio

Tabela S1. Pacientes Características

doi: 10.1371. /Journal.pone.0120855.s001

(DOC)