Abstract

PTEN é uma proteína de supressor de tumor potente. cancro da próstata metastático e agressivo (PC) está associada com a redução ou perda de expressão de PTEN. redução PTEN frequentemente ocorre sem mutações de genes, e a sua infra-regulação não é totalmente compreendido. Aqui, mostramos que PTEN é incorporado na carga de exossomas provenientes de células cancerosas. PTEN não é detectada em exossomas derivadas de células normais, não cancerosas. Descobrimos que PTEN pode ser transferido para outras células através de exossomas. Nas células que têm uma redução ou perda completa da expressão de PTEN, o PTEN transferido é competente para conferir actividade de supressão de tumores de células aceitador. Em pacientes de PC, que mostram que PTEN é incorporado na carga de exossomas que circulam no sangue. Curiosamente, os indivíduos normais não têm expressão de PTEN em suas exossomas sangue. Além disso, descobrimos que o antígeno específico da próstata (PSA) é incorporada em pacientes PC ‘e sujeitos normais “exosomes sangue. Estes dados sugerem que exosomal PTEN pode compensar a perda de PTEN em células deficientes PTEN, e pode ter valor de diagnóstico para câncer de próstata

Citation:. Gabriel K, Ingram A, Austin R, Kapoor A, Tang D, F Majeed , et ai. (2013) Regulamento do supressor de tumor PTEN através exossomas: Um Potencial de diagnóstico para câncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10.1371 /journal.pone.0070047

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de novembro de 2012; Aceito: 17 de junho de 2013; Publicação: 25 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gabriel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi premiado pela Prostate Cancer Canadá e é orgulhosamente financiado pela Fundação Movember, Grant # D2013-2 para K.Al. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é o cancro mais frequentemente diagnosticado e a segunda maior causa de mortes relacionadas ao câncer em homens [1], [2], [3]. A perda de uma cópia do gene de PTEN contribui para a iniciação do tumor da próstata, enquanto que uma maior redução na expressão de PTEN suporta o comportamento de invasão e metástase de PC [4]. PTEN uma fosfatase de proteína /lípido. O seu domínio de fosfatase de tirosina de proteína tem as características de uma fosfatase de dupla especificidade que é capaz de desfosforilar resíduos de tirosina e ambas serina /treonina. O principal substrato lípido de PTEN é fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato (PIP-3). O principal mecanismo de supressão tumoral por PTEN é a manutenção de PIP-3 celular em níveis baixos, inibindo, assim, a via PI3K-AKT e contribuindo para a apoptose ou paragem do ciclo celular celular [5]. A redução da expressão da proteína PTEN frequentemente ocorre na ausência de mutações no gene [6], [7], [8]. Ao todo, cerca de 70-80% de tumores PC primárias têm uma redução na expressão de PTEN [9]. Diferentes mecanismos que contribuem para a redução da expressão de PTEN em tumores têm sido identificadas, incluindo a metilação do promotor [10], [11], e proteínas reguladoras negativas [12]. Tem sido sugerido que outros mecanismos desconhecidos, podem ser actuando em muitos tumores [10], [11]. Nossos resultados apontam para um novo mecanismo pelo qual as células cancerosas regular a expressão de PTEN através de exossomos.

As células cancerosas liberam vesículas em seus arredores. Microvesículas são uma variedade de vesículas galpão, gerado através da brotação direta da membrana celular. Os exossomas são outra, relativamente menor tipo de vesícula que são armazenados nos corpos multivesiculares e libertada quando o corpo multi-vesicular funde com a membrana da célula [13], [14]. conteúdo exossomo reflete sua fonte celular [15], [16]. Curiosamente, estes conteúdos podem incluir proteínas oncogénicas, como já anteriormente relatada [17], [18], ou as proteínas supressoras de tumor, tal como é aqui relatado. Assim, pode-se prever que as moléculas transferidos por exossomas conferir um fenótipo de células Adquirida aceitador, que conduz a efeitos positivos ou negativos em relação à progressão do tumor dependente da natureza das moléculas transferidos. A carga de exossomos pode, assim, alterar o equilíbrio entre as características supressores oncogênicos e tumorais. A análise dessa carga pode indicar o status de proteínas supressoras de tumor em células malignas expressão sem ter que provar diretamente a malignidade. Exossomos estão emergindo como uma importante fonte de biomarcadores de câncer e são descritos como baús de tesouro biomarcador para o PC [19]. Tem sido sugerido que o estatuto de PTEN em pacientes PC poderia ser um indicador de pacientes em risco de metástase do cancro, ou de recorrência após a prostatectomia radical [20], [21], [22]. Há várias décadas, antigénio específico da próstata (PSA) foi usado como o padrão biomarcador para a detecção de PC [23]. No entanto, a utilização de PSA é limitada pela sua falta de especificidade e a incapacidade para diferenciar entre as formas indolentes e com risco de vida da doença no momento do diagnóstico [24]. teste de PSA pode reduzir a taxa de mortalidade de PC, mas também está associada a uma alta taxa de excesso de diagnósticos e tratamento excessivo [25], [26]. Em seu estudo, Harvey et al. concluíram que o teste de PSA tem uma elevada taxa de falsos positivos e falsos negativos significativos [27]. Esta falta de valor prognóstico leva a um enorme aumento em biópsias desnecessárias e no tratamento excessivo de baixo risco pacientes de PC [23], [25]. Tendo em conta estes resultados, existe uma grande necessidade de encontrar novos marcadores para PC ou para aumentar a especificidade do teste PSA.

Materiais e Métodos

Materiais

Os anticorpos monoclonais para PTEN, AKT, Flotilin-1, p27, e ciclina D1 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Todos os anticorpos secundários conjugados com HRP correspondentes foram adquiridos a partir de Cell Signaling. Alexa Fluor 488 anticorpos secundários foram adquiridos de Molecular Probes (Eugene, OR).

As linhas celulares.

DU145, (células cancerosas humanas da próstata), U87 (glioblastoma astrocitoma humano) PC-3 e as células humanas normais [células endoteliais de aorta humana (HAOEC), células humanas de aorta músculos lisos (HAOSMC) e células humanas da próstata epitelial (HPEC)] foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas, VA). células DU145 com PTEN knockdown (DU145Kd) e as células DU145 transfectadas com siRNA inespecíficos foram originalmente gerada em um dos nossos laboratórios (D. T.) no rim Hamilton Research Centre (HKRC), Universidade McMaster. DU145Kd células foram gerados utilizando PTEN siARN expresso por um promotor H1-driven shRNA vector retroviral à base, e as células DU145 de controlo foram infectados com um retrovírus que expressam ARNsi não específica, tal como previamente descrito [12]. CHO e células CHO-EGFR foram obtidos anteriormente como uma generosa oferta do laboratório do Dr. Guha no Hospital for Sick Children, Toronto. Todas as linhas celulares utilizadas neste estudo foram cultivadas em FBS a depleção de microvesículas (por centrifugação durante a noite a 100.000

g

). Para a cultura padrão, as células foram cultivadas em meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS).

o isolamento de exossomas a partir do meio condicionado e o plasma do sangue

exossomas foram coletados a partir da mídia de diferentes linhas celulares e de plasma humano, como descrito anteriormente [18], [28], [29]. Resumidamente, o meio condicionado foi colhido a partir de células a aproximadamente 80% de confluência, a menos que indicado de outra forma, e este material foi submetido a duas centrifugações consecutivas a 300

g

durante 5 minutos e depois a 12000

g

durante 20 minutos, para eliminar células e detritos. Finalmente, os exossomas foram obtidos após a centrifugação durante 2 horas a 100.000

g

e, em seguida, lavada duas vezes com um grande volume de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Este protocolo recolhe especificamente exossomas e exclui grandes vesículas. As proteínas exossomo recuperados foram medidos utilizando o ensaio de Bradford (Bio-Rad).

PTEN Expressão perfil

As células (DU145, DU145Kd e DU145 com controle siRNA) e as células primárias (HAOEC , HAOSMC e HPEC), juntamente com os seus exossomas correspondentes, foram lisadas durante 10 minutos em gelo em tampão de lise contendo: Tris 10 mM (pH 6,8), EDTA 5 mM, NaF 50 mM, pirofosfato de sódio 30 mM, 2% (em peso ./vol) de SDS, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), e Na 1 mM

3VO

4. Os lisados ​​foram separados por SDS-PAGE e submetida a imunotransf erência com anticorpos monoclonais de coelho para PTEN. A imunodetecção foi realizada utilizando o anticorpo apropriado conjugado com HRP secundário e quimioluminescência acrescida kit (kit ECL, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido), após o que os blots foram digitalizados e as bandas de proteína quantificadas utilizando o Quantity One Software (Bio-Rad, CA) .

o Detecção de Sinalização de eventos relacionados com a PTEN

para avaliar o impacto de exossomos que contêm PTEN em células DU145Kd, este último foram semeadas em placas de 100 mm a uma densidade de 2 × 10

5 células /ml, crescidas rapidamente, e após jejum de 24 horas (ou em DMEM suplementado com FBS a 0,5%, ou em meio DMEM isento de soro). As culturas foram então estimuladas durante a noite com diferentes concentrações de exossomas provenientes de células DU145. Após o tratamento exossomo, os lisados ​​celulares foram preparados e analisados ​​quanto ao seu teor de sinalização efectora utilizando anticorpos anti-fosfo-AKT (Cell Signaling), de acordo com as recomendações do fornecedor. A detecção da expressão da p27 e ciclina D1 foi realizada utilizando as mesmas configurações experimentais utilizadas para a detecção de pAKT.

Fluorescent Imagem de exossomo Captação

Para

in vitro

a análise de expressão de PTEN, as células foram cultivadas em lâminas de câmaras (Nalge Nunc, Nova Iorque). As culturas foram lavadas com PBS e fixadas em pré-aquecido (37 ° C) 4% (wt./vol) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato durante 5 minutos. Em seguida, elas foram lavadas três vezes em PBS, e antiquenching foi realizada em 50 mM NH

4Cl durante 10 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes em PBS e incubadas com BSA [1% (wt./vol) em PBS] durante 30 minutos. A incubação com o anticorpo primário foi realizada durante 1 h, seguido por lavagem em PBS, e depois incubação com um anticorpo secundário por 30 minutos. Após a coloração, as lâminas foram montadas com meio de montagem Dako fluorescente e visualizados sob um microscópio confocal para detectar a presença de conteúdo exosomal (PTEN) nas células receptoras.

PTEN Ensaio de Actividade

a partir de lisados DU145Kd células, que foram tratadas com os exossomas a partir de células DU145, foram sujeitos a imunoprecipitação utilizando anticorpos PTEN (Cell Signaling) e proteína G-Sepharose. actividade de PTEN foi avaliada utilizando os DiC8PtdIns substrato solúvel em água (3, 4, 5) P3 (triangular). Os fosfatos livres libertados foram medidos com o reagente BIOMOL Green and normalizado contra uma reacção contendo apenas substrato PIP3 [12].

A detecção de ARNm de PTEN

DU145Kd células foram tratadas com as preparações de exossoma a partir de derivados DU145, seguido de lavagem extensiva e a extracção de ARN usando reagente Trizol (Invitrogen, Nova Iorque). análise de RT-PCR foi realizada usando um método de um único passo (Qiagen, CA) onde PTEN foi detectada utilizando os conjuntos de iniciadores: sentido 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 e anti-sentido 50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. As reacções foram realizadas em 50 ul com a activação de Taq inicial a 95 ° C durante 30 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 segundos, iniciador de recozimento a 60 ° C durante 1 minuto e extensão a 72 ° C durante 30 segundos. Os produtos foram resolvidos em gel de agarose a 1% e fotografada. GAPDH foi utilizada como controlo interno utilizando os conjuntos de iniciadores: sentido 50-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 e anti-sentido 50-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30

Ensaio de Proliferação

O ensaio de proliferação foi realizada utilizando um kit de ensaio (CHEMICON. ) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 0,1 × 10

4 DU145Kd células foram plaqueadas numa placa de 96 poços; Após 24 horas, as células foram tratadas com diferentes concentrações de exossomas provenientes de células DU145. Outras células foram tratadas com DU145Kd exossomas DU145Kd-derivadas para mostrar o efeito de exossomas com PTEN regulados negativamente. células DU145 foram usadas como um controlo para demonstrar a capacidade de exossomas para compensar a regulação negativa de PTEN em DU145Kd. Este procedimento foi utilizado para as células U87 e PC-3.

próstata pacientes com câncer e os indivíduos normais

Este estudo é apoiado pela aprovação ética do conselho de ética da Universidade McMaster (REB # 02-2174) . Os participantes foram informados sobre o objetivo do estudo e consentimento escrito foi obtido de todos os indivíduos que participaram do estudo. As amostras de 30 pacientes de PC foram usadas neste estudo. Os pacientes tinham avançado (T3 /T4) estágio do tumor. Amostras de sangue foram coletadas antes da prostatectomia, e tecidos tumorais foram coletadas após a cirurgia e congelados em nitrogênio líquido. registros clínicos, tais como pontuação de Gleason, PSA, tamanho do tumor, tumor de grau histopatológico e metástases foram recolhidos. As amostras foram coletadas de acordo com os padrões éticos da Universidade McMaster, e consentimento do paciente foi obtido antes da amostragem. Oito homens voluntários saudáveis ​​com idades entre 50-65 (combinando as amostras PC paciente) foram utilizados neste estudo; todos eram sem histórico de câncer e com níveis normais de PSA.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram reproduzidas pelo menos três vezes com resultados semelhantes. Os dados quantitativos são apresentados como o valor médio dos replicados no interior da experiência representativa ± SEM. A significância estatística foi avaliada utilizando um teste t de Student informatizado de 2 caudas. As diferenças foram consideradas significativas quando P . 0,05

Resultados

PTEN é expressa em exossomas de células PC, mas não as células normais

Nós determinamos o estado da PTEN na seguindo células PC: DU145, DU145 transfectada de forma estável com PTEN siRNA (DU145Kd) para PTEN downregulation ou knockdown, e DU145 transfectada com controle siRNA [12]. Os exossomas foram recolhidos a partir do meio condicionado de cada tipo de célula, e as concentrações iguais de proteínas de células e os exossomas foram sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferência, então sondadas com anticorpos PTEN. Ambas as células DU145Kd (Figura 1A) e exossomas (Figura 1B) mostraram uma regulação negativa da expressão de PTEN em comparação com as células DU145 tipo selvagem e células DU145 transfectadas com ARNsi de controlo. Também avaliou o estado de fosforilação de PTEN nas exossomos derivados destas células. A fosforilação de PTEN mantém num estado fechado protegido da degradação; PTEN depois estará disponível para ser activado no citoplasma, se ligam à membrana celular após desfosforilação, e, em seguida, iniciar sinalização celular [30], [31]. Descobrimos que o PTEN incorporada em exossomos é fosforilada (Figura 1B, painel do meio). Flotilin-1 foi utilizado como um controlo de carga para exossomas [32]. As taxas de proliferação de células parentais DU145, DU145 com ARNsi de controlo e células DU145Kd (Figura 1C) mostram que as células PTEN knockdown exibiram uma taxa de proliferação significativamente maior do que os outros dois tipos de células. células primárias humanas (células normais, não-cancerosos), tais como as células humanas de aorta endoteliais (HAOEC), aórtica humana células musculares lisas (HAOSMC) e células humanas da próstata epiteliais (HPEC) expressam PTEN, mas descobrimos que PTEN não é incorporada nos exossomas destas células (Figura 1D). Isso pode significar que a incorporação de PTEN em exossomos é uma característica exclusiva de células cancerosas, porém este achado requer uma maior exploração. Figura 1E é uma micrografia eletrônica de varredura mostrando o derramamento de exossomos de células cancerosas.

A. células PC DU145 foram transfectadas com o ARNsi indicados. As células transfectadas com ARNsi específicos de PTEN mostrou uma clara knockdown de PTEN expressão, enquanto que as células transfectadas com ARNsi de controlo incompatibilidade, não mostraram diminuição na expressão de PTEN. B. Os exossomas derivado de DU145, DU145Kd, e DU145 com ARNsi de controlo mostram o mesmo padrão de expressão de PTEN como observado com a célula a partir do qual se originou. PTEN incorporados em exossomas é fosforilado; PTEN fosforilação protege da degradação, e pode ser activada por desfosforilação aquando da transferência a outras células. Exossomos são positivos para Flotilin-1. C. Diferenças na proliferação de DU145, DU145 com ARNsi de controlo e DU145Kd foram avaliadas, com significativamente mais elevada exibida pela proliferação DU145Kd. pilhas D. Humanos, HAEC, HASMC e HPEC, e seus exosomes foram perfiladas para a expressão de PTEN. Todos os três células têm PTEN expressão, mas não é expresso de PTEN em suas exossomas. A expressão de ambas as células e os exossomas foram normalizados com Flotilin-1. E. Uma micrografia eletrônica de varredura mostrando o derramamento de exossomos a partir de células DU145.

Transferência intercelular de PTEN por exossomas

Para investigar a troca intercelular de PTEN, exossomos derivados de PC DU145 nativa as células foram recolhidas utilizando o procedimento padrão de centrifugação. DU145Kd células foram incubadas com a preparação exossomo derivada a partir de células DU145 parentais. A aparente absorção de PTEN microvesicular por células DU145Kd foi observada usando imunocitoquímica (subtracção de fundo foi realizada utilizando as células não tratadas como controlo, e a fluorescência foi subtraída de ambas as células não tratadas e tratadas para mostrar a aquisição de PTEN em células de exossoma tratados), e imunotransferência (Figura 2 a e B).

DU145Kd células foram incubadas com diferentes concentrações de exossomas provenientes de células DU145 durante 24 horas. A. Células DU145Kd foram cultivadas em câmaras de deslizamento e tratou-se com derivados de exossomas DU145. As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e imunocitoquímica foi realizada com anticorpos primários e anticorpos secundários PTEN Alexa Fluor 488. As células foram visualizadas por microscopia confocal (IF imunofluorescência). células DU145Kd adquiriu PTEN (verde) após incubação com exosomes DU145 derivados. B. DU145Kd foram cultivadas em placas de 100 mm e tratadas da mesma maneira como em (A) com diferentes concentrações de derivado de exossomas DU145. As células foram lavadas com PBS, lisadas com tampão de lise RIPA, e analisadas quanto à expressão de PTEN utilizando Imunoblotting. células DU145Kd adquiriu expressão de PTEN. C. Os exossomas tem um efeito inibidor sobre a transcrição de PTEN. DU145Kd foram tratadas com diferentes concentrações de exossomas provenientes de células parentais DU145. O RNA total foi recolhido das células tratadas, células DU145 e DU145 com controle de siRNA. RT-PCR foi realizada usando iniciadores específicos para PTEN. GAPDH foi usada como um controlo. RT-PCR foi realizada usando um kit de um passo de RT-PCR. Os produtos foram resolvidos num gel de agarose a 1,1%. D. exossomas transferência PTEN para U87 PTEN

– /- células. As células U87 foram cultivadas em câmaras de deslizamento e tratou-se com derivados de exossomas DU145. As células foram coradas com anticorpos PTEN e anticorpos secundários Alexa Fluor 488, e, em seguida, foram visualizadas utilizando um microscópio confocal (SE-imunofluorescência). células U87, que não expressam PTEN como eles têm mutações em ambos os alelos PTEN, expressão de PTEN adquirida (verde).

Para garantir que o aumento da PTEN em células DU145Kd pós-incubação com DU145 derivado exossomas não resultar da estimulação da transcrição de PTEN por exossomas, foi realizada RT-PCR para PTEN em células DU145Kd tratados com diferentes concentrações de derivado de exossomas DU145. Observou-se um efeito inibidor sobre a transcrição de PTEN (Figura 2C). Para assegurar ainda mais que foram observando a transferência intercelular das proteínas PTEN, em oposição à estimulação da transcrição, foi utilizada a linha celular de glioblastoma U87, um genótipo nulo, que contém uma mutação em ambos os alelos PTEN [33]. Quando tratados com exossomas derivadas de células DU145, células U87 testado positivo para PTEN (Figura 2D). Estes dados confirmam que o PTEN adquirida em DU145Kd e U87 é apenas relacionado com a transferência intercelular de proteína PTEN, através do intercâmbio exosome. Além disso, foram tratados a linha de células de cancro da próstata PC-3, que é PTEN nulo, com exossomas derivadas de células DU145, que mostra a aquisição de PTEN (Figura S1). Determinou-se a expressão de PTEN em exossomas a partir de diferentes linhas celulares de cancro, ou seja, carcinoma do pulmão (A549), o cancro da mama (MDA-MB-231), carcinoma colorrectal (HCT116), e adenocarcinoma do pâncreas (BxPC-3) (Figura S2, A), a mostram que PTEN é derramado através de exossomos de outros tipos de células cancerígenas. Nós também trataram células PC-3 com exossomos derivados de células de carcinoma colorretal HCT116, e descobriu que a adquiriu expressão de PTEN células PC-3 (Figura S2, B).

exossomos Transferência PTEN activa entre células cancerosas

Para avaliar se a PTEN transferidos através de exossomos é ativo, trataram células DU145Kd com diferentes concentrações de exossomos derivados de células DU145. As células tratadas foram sujeitas a imunoprecipi tacão de PTEN. Os imunoprecipitados foram avaliados para a actividade de PTEN utilizando um ensaio de lípido-fosfatase. DU145Kd células mostraram um aumento substancial da actividade da fosfatase mediante tratamento com exossomas derivadas de células DU145 (Figura 3A).

. DU145Kd células foram tratadas com os exossomas derivadas de células DU145. PTEN foi imunoprecipitada com anticorpos PTEN, e a actividade fosfatase PTEN foi avaliada utilizando os DiC8PtdIns substrato solúvel em água (3, 4, 5) P3 (triangular). Os fosfatos livres libertados foram medidos com o reagente BIOMOL Green and normalizado contra uma reacção contendo apenas substrato PIP3. Os resultados representam a média de três experiências ± SEM, e eles são significativos a P 0,01. exossomas B. PTEN-positivos (a partir de DU145) causou uma diminuição na fosforilação de AKT em células aceitadores (DU145Kd); fosforilação AKT diminuiu para um nível comparável ao de células DU145 com controle de siRNA, e as células homólogo DU145 parentais (últimas duas pistas para a direita, respectivamente). células C. DU145Kd foram plaqueadas em placas de cultura de células de 100 mm e tratadas com diferentes concentrações de derivado de exossomas DU145. As células foram lisadas e analisadas por immunobloting com anticorpos D1 e p27 ciclina. PTEN induziu a expressão de p27 e reduziu a expressão de ciclina D1 (C). Os dois acontecimentos levaram às células que entram em paragem do ciclo celular. A expressão foi normalizada para p-actina.

Para investigar se a PTEN transferido é competente para alterar a sinalização celular em células aceitadores, as células foram tratadas com DU145Kd exossomas derivadas de células DU145 durante 24 horas. O estado de fosforilação de fosfatidilinositol-3′-quinase /serina-treonina quinase (AKT), o principal substrato para PTEN, foi avaliada. Em células DU145Kd, encontramos uma diminuição da fosforilação de AKT que atingiram níveis comparáveis ​​de células DU145 parentais (PTEN positiva) e as células DU145 transfectadas com ARNsi de controlo (Figura 3B).

Para determinar se a PTEN transferidos afecta vias de sinalização celular a jusante associados com AKT, avaliou-quinase (CDK) p27 inibidor (KIP1) expressão dependente de ciclina. p27 regula a proliferação celular, motilidade celular e a apoptose. Uma redução na expressão de p27 é observada em cancros epiteliais mais letais e está associada com os resultados dos pacientes pobre [34]. pAKT regula negativamente p27 para apoiar a actividade anti-apoptótica na progressão do cancro. Descobrimos que a expressão de p27 é aumentada em células DU145Kd quando tratados com derivados de exossomas DU145 (Figura 3C). Tem sido relatado que a paragem do ciclo celular G1 é coordenada pela actividade de fosfatase PTEN lípido através da regulação positiva de p27 e por actividade da proteína fosfatase PTEN através da regulação negativa da ciclina D1 [35]. Nós determinamos que a ciclina D1 é regulada negativamente em células DU145Kd tratados com exosomes DU145, como previsto (Figura 3C).

PTEN transferidos através exossomas afeta funções biológicas nas células Acceptor

Para avaliar se a bioquímica alterações observadas na Figura 3 estão associados com a modificação da função biológica, avaliou-se o efeito de exossomas PTEN-positivas (derivado a partir de células DU145) sobre a proliferação de linhas de células que não possuem três expressão de PTEN. DU145Kd, PC-3, e U87 células foram tratadas com diferentes concentrações de exossomas DU145, e as taxas de proliferação foram inibidas em todas as três linhas celulares de um modo dependente da dose (Figura 4 A, B e C). Os exossomas sem expressão de PTEN, derivado de DU145Kd, mostrou pouco efeito sobre as taxas de proliferação.

Três linhas de células sem expressão de PTEN, DU14Kd, PC-3, e U87 (A, B e C, respectivamente), foram tratados com diferentes concentrações de exossomas DU145. Um ensaio de proliferação foi realizada utilizando um kit de ensaio. Em todas as três linhas de células, as taxas de proliferação foram inibidas de um modo dependente da concentração. As taxas de proliferação de células DU145Kd atingiu um nível comparável ao de células DU145, que mostra que os exossomas completamente compensada a perda de PTEN (A). Os exossomas provenientes de DU145Kd, que carecem de PTEN, não mostrou qualquer efeito sobre a proliferação de células de todas as três linhas de células. Os resultados são apresentados como a média de três experiências ± SEM. As diferenças em relação ao controle (0 exossomos) são significativos * P 0,05, ** P . 0,01 e # as diferenças não são significativas

Incorporação de PTEN em exossomas é regulada por oncogenes

Para investigar o mecanismo da incorporação de PTEN em carga exosomal, testou-se o papel do receptor do factor de Crescimento epidérmico oncogénico do receptor (EGFR) neste processo. Utilizou-se a linha de Ovário de Hamster Chinês (CHO) células, que são espontaneamente imortalizada [36] e não têm expressão de EGFR. As células CHO transfectadas de forma estável para expressar EGFR tinham níveis semelhantes de PTEN expressa em exossomas como as células CHO parentais (Figura 5A). Após estimulação das células CHO-EGFR com diferentes concentrações de EGF (5, 10 e 20 ng /mL), houve um aumento na quantidade de PTEN em exossomas, de um modo dependente da concentração (Figura 5B). Além disso, testou-se o efeito de inibição do EGFR em células DU145 em PTEN incorporação nos exossomas. Nós tratado as células com o inibidor de EGFR CI-1033 (5, 10 uM). Inibidores do EGFR diminuiu a incorporação de PTEN em exossomas de uma forma dependente da concentração (Figura 5C).

. Introduzindo o EGFR em células CHO não mostrou qualquer efeito na expressão de PTEN em células e exossomas. B. Estimulação de células CHO-EGFR com as concentrações indicadas de EGF (5, 10 e 20 ng /mL) conduziu a um aumento na incorporação de PTEN em exossomas. C. células DU145 foram tratados com duas concentrações (5 uM, 10 uM) de CI-1033, um inibidor irreversível de EGFR. incorporação de PTEN em exossomas foi inibida de um modo dependente da concentração; Flotilin-1 foi usado como um controle de carga para a concentração exosome.

Status PTEN em pacientes de PC pode ser avaliada através de Sangue exossomas

Para estudar o papel da exossomos na avaliação da PTEN estatuto em pacientes PC, coletamos sangue de 30 pacientes PC antes de prostatectomia, e 8 indivíduos normais correspondentes a idade dos pacientes (50-65 anos). Os voluntários normais não tinham histórico de câncer ou documentado PSA elevado soro. O sangue foi fraccionado, e o plasma foi utilizado como uma fonte para os exossomas. PTEN-exossomas foram imunoprecipitados utilizando anticorpos PTEN e Sepharose de proteína-G. A incorporação de PTEN em exossomas a partir do sangue dos pacientes PC foi determinada através de imunotransf erência, e diferentes níveis de expressão foram detectados entre os pacientes. Curiosamente, verificou-se expressão de PTEN em exossomas a partir de todos os pacientes de PC, e nenhuma expressão de PTEN nos exossomas a partir do sangue dos indivíduos normais (Figura 6 A, B); A análise do teste t mostrou os resultados foram altamente significativas a P 0,001. Além disso, pode-se avaliar a concentração de PTEN em exossomas de pacientes PC por imunotransferência com concentrações padrão de PTEN recombinante, e a concentração de PTEN foi determinada como (ng de PTEN /mg de proteína exossomo) (Figura 6C).

A. Exossomos foram coletadas a partir do plasma de 30 pacientes de PC pré-prostatectomia e 8 indivíduos normais. Exossomos foram submetidos à análise immunoblotting padrão para o status de PTEN. A figura mostra a capacidade dos exossomas para avaliar o estado de PTEN. Como mostrado na figura, os indivíduos saudáveis ​​não tinham expressão de PTEN em suas exossomas no plasma. B. As densidades ópticas para as bandas de PTEN (A) foram avaliados utilizando software Quantidade-1. expressão Exosomal-PTEN em pacientes de PC e indivíduos normais foi calculado como a média ± SEM e as diferenças entre os dois grupos foram altamente significativas (P 0,001). C. concentração PTEN nos exossomas provenientes do sangue do paciente PC foi avaliada por imunotransf erência concentrações padrão de PTEN recombinante em conjunto com as amostras dos pacientes. Os resultados são a média de expressão de PTEN ± SEM e são estatisticamente significativos P . 0,01

Sangue exosomal-PTEN fornece uma ferramenta simples para avaliar o estado PTEN

tumores PC são heterogéneas no expressão de PTEN como pode ser visto na (Figura 7 a, B, C). estado de PTEN em tumores de quatro pacientes de PC foi determinada por imuno-histoquímica. A figura demonstra a dificuldade de formar uma conclusão sobre a expressão de PTEN usando esta técnica. PTEN expressão nos exossomas do sangue do mesmo paciente é avaliado na Figura 7D, demonstrando uma forma simples e directa para avaliar a concentração de PTEN em pacientes PC. Figura 7E é uma micrografia eletrônica de varredura mostrando a população homogênea de exossomos sangue.

Esta figura fornece um estudo comparativo de avaliação PTEN usando exosomal PTEN e tumores imunohistoquímica do PC do paciente. A imuno-histoquímica de tecidos de tumores de quatro pacientes PC demonstra a heterogeneidade de expressão de PTEN em tumores da próstata. A. Eosina coloração com hematoxilina. B. Coloração com anticorpos secundários. C. A coloração com anticorpos específicos PTEN, setas indicam células positivas PTEN. D. Avaliação da expressão de PTEN utilizando exossomas no plasma dos mesmos pacientes. E) Uma micrografia microscópio eletrônico de varredura mostrando a população homogênea de exossomos coletadas do sangue do paciente. Exossomos foram anexadas a uma lamela utilizando polilisina, e processados ​​para microscopia eletrônica de varredura.

A expressão de PSA no Preparações exossomo de pacientes de PC e os indivíduos normais

Usando 30 pacientes de PC e 8 indivíduos normais, detectamos PSA em exossomos de ambos os pacientes de PC e indivíduos normais (Figura 8A): densidades ópticas das bandas de PSA (da Figura 8A) foram utilizados para análise estatística. As diferenças de PSA exosomal entre os pacientes de PC e indivíduos normais não foram significativas (Figura 8B).