Abstract

O ácido ascórbico (AA) apresenta actividade anticancerígena significativa em doses farmacológicas alcançáveis ​​pela administração parenteral que têm efeitos mínimos sobre as células normais. Assim, AA tem potenciais utilizações como um agente quimioterapêutico por si só ou em combinação com outros agentes terapêuticos que têm como alvo especificamente o metabolismo de células do cancro. Foram comparados os efeitos de AA e combinações de AA com o inibidor da glicólise 3- (3-piridinil) -1- (4-piridinil) -2-propen-1-ona (3-PO) sobre a viabilidade dos três não-pequenas linhas celulares de cancro do pulmão (NSCLC) para os efeitos sobre uma linha de células epiteliais de pulmão imortalizada. AA concentrações de 0,5 a 5 mM provocou uma perda completa da viabilidade, em todas as linhas de NSCLC em comparação com uma 10% de perda de viabilidade na linha celular epitelial pulmonar. As combinações de AA e 3-PO morte celular sinergicamente aumentada em todas as linhas celulares de NSCLC, em concentrações bastante abaixo do CI

50 concentrações para cada composto sozinho. A interacção sinérgica não foi observada em tratamentos de combinação de células epiteliais pulmonares e tratamentos de combinação que causou uma perda completa da viabilidade em células NSCLC tiveram efeitos modestos sobre a viabilidade celular de pulmão normal e espécies reactivas de oxigénio (ROS) níveis. tratamentos de associação induziu níveis dramaticamente mais elevados em comparação com ROS tratamento com AA e 3-PO sozinho em células NSCLC e morte celular induzida por combinação foi inibida através da adição de catalase ao meio. As análises de fragmentação de ADN, poli (ADP-ribose) polimerase de clivagem, anexina-V de ligação, e a actividade da caspase mostraram que a morte celular induzida por AA é causada através da activação da apoptose e que os tratamentos de combinação provocou uma indução sinérgica da apoptose. Estes resultados demonstram a eficácia de AA contra células NSCLC e que as combinações de AA com 3-PO sinergicamente induzir apoptose através de um mecanismo de ROS-dependente. Estes resultados suportam uma avaliação mais aprofundada das concentrações farmacológicas de AA como adjuvante no tratamento de NSCLC e que combinação de AA com inibidores da glicólise pode ser uma terapia promissora para o tratamento do NSCLC

Citation:. Vuyyuri SB, Rinkinen J, Worden e, Shim H, Lee S, Davis KR (2013) ácido ascórbico e um citostático inibidor da glicólise sinergicamente induzir a apoptose em células não pequenas do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 8 (6): e67081. doi: 10.1371 /journal.pone.0067081

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de novembro de 2012; Aceito: 15 de maio de 2013; Publicação: 11 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Vuyyuri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Porções de este projecto foram possíveis graças a um contrato que foi concedido e administrado pelo Medical Research Comando de Material (USAMRMC) e a Telemedicina Avançada Tecnologia Research Center (TATRC), sob o número de contrato: W81XWH-09-2-0022. Os pontos de vista, opiniões e /ou conclusões contidas neste trabalho são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do Departamento de Defesa e não deve ser interpretado como uma posição oficial, a política ou a decisão DoD /Exército, a menos que assim designada por outra documentação. Nenhum endosso oficial deve ser feita. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma característica única de muitas células tumorais é aumento da absorção de glucose e a glicólise aeróbica elevada com uma redução concomitante na fosforilação oxidativa através do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA). Esta reprogramação metabólica notável, conhecido como o efeito de Warburg [1], representa um alvo potencial para a inibição da proliferação celular descontrolada que é uma característica do cancro. explicações inicial para a dependência de células cancerosas na glicólise aeróbica sugeriu que as células cancerosas continham mitocôndrias defeituosas e, assim, a glicólise aumentada foi necessária para gerar ATP para conduzir a proliferação celular. No entanto, sabe-se agora que a maioria das células cancerosas têm mitocôndrias funcionais, e que as alterações metabólicas associadas com o efeito Warburg está voltada para fornecer precursores biossintéticos de aminoácidos, nucleótidos e lípidos [1], [2]. Além de dirigir o aumento da glicólise, a absorção aumentada de glucose característica de muitas células cancerosas suporta fluxo aumentado através do shunt das pentoses fosfato e a produção de ribose-5-fosfato para a biossíntese de nucleótidos. Talvez mais importante, o aumento do fluxo através do shunt fosfato de pentose pode aumentar a quantidade de NADPH disponível para suportar a actividade metabólica e proporcionar protecção contra o stress oxidativo. NADPH adicionais e precursores biossintéticos são produzidas pelo catabolismo de glutamina [3]. Assim, o efeito Warburg requer o controle altamente coordenada de glicólise, o shunt das pentoses fosfato, glutaminolysis eo ciclo TCA mitocondrial.

A dependência exclusiva das células cancerosas da glicólise torna vulneráveis ​​a intervenção terapêutica com inibidores da glicólise específicos. Várias enzimas glicolíticas, incluindo hexoquinase II, lactato desidrogenase A, e isomerase de glucose-6-fosfato, são sobre-expresso em células tumorais e servem tanto como facilitadores e reguladores da progressão do cancro [4], [5]. Vários componentes da via glicolítica têm sido alvo para o desenvolvimento de terapia, embora muito poucas foram avaliadas em ensaios clínicos. 2-desoxi-D-glucose (2-DG), 3-bromopiruvato e lonidamina foram referidos como sendo inibidores úteis de segmentação glicolíticas hexoquinase, a enzima de ponto de entrada para a glicólise [5], [6]. 3-bromopiruvato também inibe a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) [6] e um estudo recente indicou que o éster de propilo 3-bromopiruvato era um inibidor mais eficiente de GAPDH em comparação com hexoquinase em células de carcinoma colorectal [7]. Outra enzima glicolítico chave altamente expresso em células tumorais é 6-phosphofructo-2-quinase /frutose-2,6-bisfosfatase isozima 3 (PFKFB3), que gera frutose-2,6-bifosfato (Fru-2,6-BP). Fru-2,6-BP alivia a repressão da taxa de enzima limitante da chave 6-phosphofructo-1-cinase por ATP, permitindo, assim, altas taxas de glicólise, na presença de níveis elevados de ATP [8]. inibidores de moléculas pequenas de PFKFB3 foram identificados e mostrado para inibir o crescimento de células de tumor [9], [10]. Estes novos inibidores representam uma nova classe de inibidores de glicólise e validar adicionalmente inibidores de glicólise como potenciais terapêuticos para o cancro, [4], [11].

Apesar da dependência de células cancerosas da glicólise para produção de ATP, a inibição da glicólise usando glicolítica inibidores muitas vezes não provar ser eficaz para matar células tumorais, tal como exemplificado em vários

in vivo

experimentos [4], [5], [12] – [18]. Isto sugere que as estratégias destinadas a inibir a glicólise pode exigir vários agentes que empobrecem a ATP com diferentes mecanismos de acção [16] ou de que os inibidores de glicólise deve ser emparelhado com outros inibidores do metabolismo específicos de tumores. Esta abordagem tem sido bem sucedida em um número de casos [12] -. [15], [17], [18], sugerindo que os tratamentos combinados utilizando inibidores glicolíticas emparelhados com outros agentes anticancerígenos poderia ser muito poderosa na clínica

O ácido ascórbico (AA) tem sido demonstrado que têm potencial terapêutico do cancro; no entanto, até à data, o seu valor terapêutico permanece controverso [19] – [23]. A concentrações mais baixas, as funções de AA principalmente como um anti-oxidante e pode proteger as células do stress oxidativo enquanto que em elevadas concentrações atos AA como um pro-oxidante que impõe o stress oxidativo e induz a morte das células [20], [23] – [27]. É provável que esta dupla natureza dependente da concentração de AA é a base para a eficácia inconsistente de AA na terapia do cancro, uma vez que só as concentrações farmacológicas de AA mais elevado do que aqueles que podem ser obtidos pela libertação oral provavelmente exercer efeitos anticancerosos [28]. AA tem sido mostrado para ser selectivamente mais tóxico para as células cancerosas em comparação com células normais correspondentes [29] – [32]. Um componente importante deste citotoxicidade selectiva é a capacidade de concentrações farmacológicas de AA para impor o stress oxidativo em células cancerosas através da geração de ROS e peróxido de hidrogénio [33] – [35]. Uma vez que as células cancerosas têm, geralmente, níveis mais elevados de espécies reactivas de oxigénio, verifica-se que o stress oxidativo adicional imposto pela AA não pode ser melhorada pelo respostas antioxidantes celulares e morte celular é desencadeada [36]. Vários estudos têm demonstrado que as combinações de AA com outros agentes anti-cancro muitas vezes apresentam citotoxicidade aumentada [34], [37] – [40]

Neste estudo, determinou-se que o AA é selectivamente tóxico para os vários não-pequenas. cancro do pulmão (NSCLC) e linhas de células que combinação de AA e 3- (3-piridinil) -1- (4-piridinil) -2-propen-1-ona (3-OP), um novo inibidor de PFKFB3 com significativa atividade anticancerígena [9], em sinergia induz a apoptose em células NSCLC.

resultados

AA e 3-PO sinergicamente Crescimento Inibição de linhas celulares de NSCLC, mas não as células epiteliais brônquicas

Anterior estudos demonstraram que o AA diminui selectivamente a proliferação celular em algumas linhas celulares de cancro, sem afectar as células normais [29] – [32]. Nós iniciamos estudos para determinar se este é realmente o caso para as células NSCLC e para determinar se as combinações de AA com a glycolytic inibidor 3-PO foram mais eficazes do que sozinho AA. Os estudos iniciais foram completados para determinar o IC

50 para AA e 3-PO em três linhas celulares de NSCLC (H1299, H661 e A549) e uma linha imortalizada de células epiteliais de pulmão (BEAS-2B) utilizando uma viabilidade celular de exclusão de azul de tripano ensaio. A 24 h IC

50 concentrações para AA nos três linhas de NSCLC variou de 0,57 to1.71 mM, com H1299 sendo as mais sensíveis (Fig. 1A). As células de BEAS-2B foram muito mais tolerantes ao tratamento de AA, com uma IC

50 concentração (Fig. 1C) 20 mM. Estes resultados demonstraram que as células NSCLC são consideravelmente mais sensível à AA em comparação com células BEAS-2B epiteliais pulmonares. O IC 24 h

50 concentrações de 3-PO nas três linhas de NSCLC variou 25-67 uM, com H1299 novamente sendo as mais sensíveis (Fig. 1B). O

50 concentração de IC para as células BEAS-2B foi de 105 uM, demonstrando que as células epiteliais do pulmão imortalizadas foram de 1,5 a 4,2 vezes mais resistente à 3-PO em comparação com as células NSCLC.

(A) a viabilidade das células do NSCLC H1299, H661 e células A549 como uma função da concentração de AA. (B) A viabilidade das células do NSCLC H1299, H661 e células A549 como uma função de concentração de 3-PO. (C) A viabilidade celular das células NSCLC H1299 e células epiteliais BEAS-2B pulmonares após o tratamento com AA sozinha e combinações de AA com 10 ^ M-PO 3. As células foram tratadas durante 24 h e, em seguida, foram avaliadas utilizando o ensaio de viabilidade de exclusão de azul de tripano e normalizada para o controlo tratado com o veículo apropriado. Os dados representam médias ± SEM determinados a partir de três experiências individuais. IC

50 valores indicados foram calculados utilizando o software GraphPad Prism.

próxima investigados os efeitos de combinações de AA e 3-PO sobre a viabilidade da linha de células H1299 mais sensível em relação a BEAS- 2B. Para estas experiências, as células foram tratadas com 10? M-PO 3, e as concentrações de AA variando de 0,1 a 20 mM. Os tratamentos combinados com AA e 3-PO não têm um efeito significativo sobre a viabilidade das células BEAS-2B para a gama de concentração testada com a diminuição máxima da viabilidade de 18% ± 1,3 observada no AA a 20 mM /10 uM 3- PO tratamento (Fig. 1C). Os valores de índice Drewinko (di) para todas as combinações de AA e 3-PO testados em BEAS-2B variou de 1,0 a 1.1, o que indica que as alterações de viabilidade modestas observadas foram devidas aos efeitos aditivos de 3-PO e AA. Em contraste, os tratamentos de combinação foram significativamente mais eficazes em matar células H1299 em comparação com AA sozinho (Fig. 1C). O tratamento com 300 uM ou 500 uM AA sozinho reduziu a viabilidade celular de 15,3% e 26,3%, respectivamente, ao passo que na presença de 10 uM de 3-PO, 300 uM e 500 uM AA reduziu a viabilidade em 84% e 96%, respectivamente. O tratamento de combinação de IC

50 era 3 vezes menos do que a IC

50 de AA sozinho em H1299. O DI valores para os tratamentos de combinação contendo 300 uM e 500 uM de AA eram de 4,9 e 18,7, respectivamente, e demonstram uma forte interacção sinérgica entre AA e 3-PO.

Para determinar se uma interacção sinérgica entre AA e semelhante 3-PO ocorreu em outras linhas de NSCLC, a viabilidade celular foi comparada em BEAS-2B, H1299, H661 e as células A549 tratadas com 300 uM de AA, 10 uM (BEAS-2B, H1299) ou 30 ^ M 3-PO (H661, A549) , ou uma combinação de AA com 3-PO ao longo de um período de 72 h após o tratamento. Tal como observado anteriormente, estes tratamentos não tiveram efeitos modestos sobre a viabilidade das células BEAS-2B (Fig. 2A). A máxima perda de viabilidade em BEAS-2B ocorreu às 72 horas e foi de 30% com o tratamento combinado. Os valores de ID para o tratamento de combinação durante o período de tratamento variou de 1,0 a 1.1, confirmando que não há uma interacção sinérgica entre AA e 3-PO em células BEAS-2B. Em contraste, as combinações de AA e 3-PO sinergicamente matou todas as três linhas de NSCLC, com significativa (

P

0,05) sinérgico (DI 1) Os efeitos claramente evidentes durante o período de 72 h de tratamento (Fig. 2B-D). Os efeitos do tratamento de combinação de H1299 e H661 foram semelhantes, com uma perda quase completa da viabilidade a 72 h. As células A549 foram mais sensíveis ao tratamento de combinação, com uma perda quase completa da viabilidade em 48 h. Os valores de ID para o tratamento de combinação às 72 h variando 22,2-62,6 para as três linhas de NSCLC, que indica uma forte interacção sinérgica. Estes resultados demonstram que uma combinação de AA e 3-PO sinergicamente induz a morte celular em várias linhas de NSCLC e confirma que uma interacção semelhante não ocorre na linha de células epiteliais de pulmão BEAS-2B. Células epiteliais

Lung BEAS- 2B (A) e NSCLC células H1299 (B), H661 (C), e A549 (D) foram tratadas com 300 uM AA sozinho, 10 uM (BEAS-2B, H1299) ou 30 uM (H661, A549) 3-PO sozinho, ou uma combinação de AA e 3-PO. As células de controlo foram tratados apenas com veículo. Aos 24, 48 e 72 h pós-tratamento, a viabilidade celular foi determinada usando o ensaio de exclusão de azul de tripano. Os dados representam médias ± SEM determinados a partir de três experiências individuais. uma; diferença estatisticamente significativa (

P Art 0,05) do controle do veículo tratado. b; diferença estatisticamente significativa (

P Art 0,05) do controle e AA individual e tratamentos 3-PO. Drewinko Índice de valores (di) foram calculadas usando a fórmula x SF1 SF2 /SF1 SF1 + 2, onde, e SF2 SF1 + 2 representam a fracção sobrevivente de células tratadas com AA sozinho, 3-PO sozinho, e a combinação de AA e 3- PO, respectivamente. DI valores 1 indica um efeito sinérgico, DI = 1 indica um efeito aditivo; e valores 1 indica um efeito antagonista

Tendo estabelecido que o AA e 3-PO causar uma indução sinérgica de morte celular em linhas celulares de NSCLC, investigou ainda mais as interacções de uma gama de AA. e concentrações de 3-PO nas células H1299 (Fig. 3A). As concentrações de 1-10 uM 3-PO não tem um efeito significativo na viabilidade das células H1299, ao passo que 30 uM 3-PO causou uma perda de 60% na viabilidade. As concentrações de AA 50-500 pM mostrou uma diminuição dependente da dose na viabilidade, com 500 uM causando uma perda de 40% na viabilidade. Uma resposta sinérgica significativa foi observada em células H1299 ao longo de uma ampla gama de combinações de AA e 3-PO (Fig. 3B, a Tabela 1). Combinações de 100, 300 e 500 uM AA com concentrações de 3-PO ≥ 3 uM causou a indução sinérgica de morte celular [Índice de combinação (Cl) 1]. O tratamento de combinação que contém 50