Abstract

Fundo

anfitriãs estão associados com favorável os desfechos no câncer de ovário (EOC), mas ainda não se sabe a melhor forma de promover essas respostas em pacientes. Para este objetivo, avaliou um painel de citocinas clinicamente relevantes para a capacidade de melhorar várias funções efetoras de células T (polifuncionalidade) no ambiente tumoral nativa.

Metodologia /principais conclusões

Experimentos foram realizada com células residentes CD8 + e T CD4 + em preparações de células de ascites de pacientes em massa EOC serosas de alto grau. As células T foram estimuladas com α-CD3 na presença de 100% de fluido de ascites autólogo, com ou sem IL-2 exógena, IL-12, IL-18 ou IL-21, sozinho ou em combinação. proliferação de células T (Ki-67) e função (IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCL4, e CD107a expressão) foi avaliada por múltiplos parâmetros de citometria de fluxo. Em paralelo, 27 citocinas foram medidos em sobrenadantes de cultura. Enquanto o fluido de ascites teve efeitos variáveis ​​sobre CD8 + e proliferação de células T CD4 +, é inibida a função das células T na maioria das amostras de pacientes, com CD107a, IFN-γ, e CCL4 mostrando maior inibição. Isto foi acompanhado pela redução dos níveis de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, bFGF e em sobrenadantes de cultura. proliferação de células T foi aumentado por IL-2 exógena, mas outras funções das células T eram em grande parte inalteradas por citocinas individuais. A combinação de IL-2 com citocinas exercem vias de sinalização complementares, em especial a IL-12 e IL-18, a expressão aumentada de IFN-γ, TNF-α, e CCL4 em todas as amostras dos pacientes por promoção de respostas de células T polifuncionais. Apesar disso, outros parâmetros funcionais em geral permaneceu inibido.

Conclusões /Significado

O ambiente de ascite EOC perturba múltiplas funções das células T e citocinas exógenas que exercem diversas vias de sinalização apenas parcialmente reverter esses efeitos. Nossos resultados podem explicar a limitada eficácia das terapias de citocinas para EOC à data. restauração completa da função das células T requer a activação de vias de sinalização, além daqueles envolvidos por IL-2, IL-12, IL-18 e IL-21

Citation:. Tran E, Nielsen JS, Wick DA , Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et al. (2010) Respostas polifuncionais T-Cell são interrompidos pelo Câncer ascite Ambiente ovário e apenas parcialmente restaurada por citocinas clinicamente relevantes. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10.1371 /journal.pone.0015625

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2010; Aceito: 19 de novembro de 2010; Publicação: 22 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Tran et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação British Columbia Cancer, Departamento de Defesa dos Estados Unidos, e as ciências naturais e do Conselho de Investigação do Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Numerosos estudos na década passada mostraram que o sistema imunológico influencia os resultados clínicos em pacientes com câncer de alto grau serosa epitelial de ovário (doravante referida como EOC). Especificamente, a presença de células T CD8 + se infiltram no tumor está associada com a doença prolongada-livre e a sobrevivência geral [1], [2]. Além disso, os números elevados de células T CD56 + no compartimento de ascite estão correlacionadas com o aumento da sensibilidade de platina [3]. Níveis mais recentemente, fluido de ascites contendo elevadas de IL-17 (uma citocina produzida predominantemente por Th17 e outras células T efectoras [4]) foi correlacionada com o aumento da sobrevivência geral [5]. Em conjunto, estes estudos sugerem que o aumento da resposta de células T endógeno para EOC pode ser de benefício clínico para pacientes. No entanto, o ambiente do tumor do ovário contém muitos tipos de células imunossupressoras e factores que podem se opõem respostas de células T anti-tumorais. Por conseguinte, os números elevados de células associados a tumores T reguladoras (Tregs) e macrófagos estão associados com a sobrevivência pobre em EOC [1], [2]. Muitos factores imunossupressores solúveis também são encontrados em ascites, incluindo IL-10, TGF-β, VEGF, B7-H1 /PD-L1, B7-H4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, ligando Fas, e do receptor solúvel de IL-2 [1], [2].

a heterogeneidade dos mecanismos imunossupressores no EOC apresenta um desafio formidável para a imunoterapia, uma vez que sugere que vários mecanismos imunossupressores podem precisar ser revertida para restaurar a função das células T. Por exemplo, o esgotamento Treg está sendo avaliada como um meio para melhorar a imunidade contra vários cancros humanos [6], incluindo EOC [7], mas na melhor das hipóteses só iria reverter um mecanismo de imunossupressão, deixando outras barreiras imunológicas intacta. Em vez de tentar anular estas barreiras, um por um, uma abordagem clínica mais pragmática seria a de fornecer factores que em geral, podem substituir barreiras imunossupressores no ambiente tumoral. Assim, a identificação dos sinais ou condições que promovem respostas de células T no ambiente EOC pode levar a estratégias imunoterapêuticas mais eficazes.

Para este fim, anteriormente desenvolvido um modelo de ratinho de EOC que permite a avaliação funcional dos linfócitos T CD8 + respostas celulares no ambiente do tumor do ovário [8]. Especificamente, que desenvolveu uma linha tumoral de murino EOC para expressar um epitopo de célula T CD8 + a partir do antigénio de ovalbumina modelo. Os ratinhos portadores de tumores avançados, amplamente disseminadas com ascite extensos foram tratados por transferência adoptiva de células T CD8 + específicas para o epítopo de ovalbumina. Notavelmente, células T CD8 + adoptivamente transferidos foram submetidos a proliferação vigorosa não só nos gânglios linfáticos e no sangue periférico, mas também nas ascites e compartimentos tumorais. Com efeito, no pico da resposta, as células T transferidas constituído até 40% de células T CD8 + no sangue periférico, e até 96% das células T CD8 + em ascite. Esta resposta proliferativa foi profunda seguido por regressão tumoral rápida e quase completa na maioria dos animais, o que demonstra que as células T eram funcionalmente activos. Importante, a actividade de proliferação e anti-tumorais das células T CD8 + transferidos era totalmente dependente da IL-2 /IL-15 de sinalização, tal como demonstrado pela ruptura genética do receptor alfa de IL-2 (CD25) ou beta subunidades (CD122) [ ,,,0],8]. Assim, mesmo na configuração de tumores do ovário avançado, as células T CD8 + montado respostas anti-tumorais potentes, desde que IL-2 /IL-15 eram vias de sinalização intacta.

Os resultados anteriores levantou a questão de saber se citoquinas tais como IL-2 podem sobrepor-se de forma semelhante os efeitos imunossupressores de ascite em EOC humano. Anterior

in vitro

estudos com amostras EOC humanos têm demonstrado que a IL-2 pode restaurar parcialmente (LAK) citotoxicidade de células activadas por linfocina assassino na presença de fluido de ascites de 50%, enquanto que a combinação de IL-2 com TCR estimulação [9] ou de IL-12 [10], [11] completamente restaurado citotoxicidade LAK. No entanto, o uso de fluido de ascites de 50% por si só não recapitular totalmente o meio ambiente do tumor do ovário, que também contém tipos de células imunossupressoras, como Tregs e MDSCs [1], [2]. Além disso, Laks são predominantemente constituída por células NK, as quais podem ser afectados de modo diferente por ascite em comparação com as células T. Além disso, estes estudos anteriores citotoxicidade medida por preparações de células LAK grandes quantidades e, consequentemente, não elucidar os efeitos de citocinas em diferentes subpopulações de células T. Finalmente,

in vitro

citotoxicidade é apenas um aspecto da função das células T e nem sempre se correlacionam com as respostas de células T eficaz

in vivo

[12].

Há está crescendo apreciação da importância das células T polifuncionais (ou seja, as células T que podem ser realizadas simultaneamente múltiplas funções) em respostas imunes eficazes [13]. Especificamente, as respostas de células T polifuncionais estão associadas com imunidade protectora após a vacinação contra a varíola (vírus vaccinia) [14], febre amarela [15], a tuberculose [16], [17], e leishmaniose [18]. números elevados de células T polifuncionais são também correlacionados com os resultados favoráveis ​​numa variedade de configurações de doença, incluindo o VIH /SIDA [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], da hepatite C [30], e da coriomeningite linfocítica [31]. Na configuração do cancro, vários estudos têm encontrado melhoradas números de células T polifuncionais específicos de tumores em doentes que responderam favoravelmente a várias formas de imunoterapia, incluindo terapia adoptiva de células T, a terapia de anticorpo α-CTLA-4 e vacinas contra tumores [32] [33], [34], [35], [36].

no presente estudo, avaliou-se, pela primeira vez os efeitos do ambiente ascite EOC humana sobre polifuncionalidade de células T. Também foi avaliada a capacidade da IL-2 e outras citocinas três clinicamente relevantes (IL-12, IL-18 e IL-21) para restaurar uma ampla gama de funções de células T. Descobrimos que ascite inibiu respostas polifuncionais por células T CD4 + e CD8 + T, com algumas funções mostrando maior inibição do que outros. Além disso, apenas um subconjunto das funções das células T foi restaurada por citocinas exógenas entregues por si só ou em combinação. Assim, a restauração completa da função das células T em EOC irá requerer a activação de vias de sinalização, além daqueles envolvidos por IL-2, IL-12, IL-18 e IL-21.

Resultados

EOC ascite perturba múltiplas funções de células T

espécimes ascite primários foram coletadas de pacientes com alto grau de EOC serosa (Tabela 1). Para modelar o ambiente do tumor ascite nativa tão perto quanto possível

In vitro

, analisou-se os sedimentos celulares de ascites em massa, que, além de CD8 + e células T CD4 +, continham células tumorais residentes, Tregs, células B, células NK, e células CD14 + (Tabela 2). Além disso, as células foram cultivadas em fluido de ascites autólogo 100% para incluir quaisquer factores solúveis, tais como TGF-β, IL-10, e o VEGF (Tabela 2), que podem ter impacto na função das células T. Por causa da escassez de antigénios das células T bem definidas no cancro do ovário, que culturas estimuladas com anticorpo α-CD3, que deve estimular tanto subconjuntos reguladores e efectora. Assim, as células T de cada paciente foram analisadas na presença do complemento completo de células tumorais que ocorrem naturalmente, as células imunossupressoras, e factores solúveis.

recentemente demonstrada num modelo murino de EOC que o ambiente de ascites pode ser altamente permissivo para a proliferação de células T [8]. Para verificar se este foi também verdadeiro em amostras EOC humanas, testou-se o efeito do fluido de ascites sobre a proliferação de células T. Como pode ser visto na Fig. 1A, fluido de ascites teve efeitos altamente variáveis ​​sobre a proliferação de células T CD8 + (como medido por Ki-67), variando de inibição forte (1/5 pacientes), a valorização de proliferação (2/5 pacientes). Em geral, uma tendência similar foi observado para as células T CD4 + (dados não mostrados). Assim, tal como sugerido pelos nossos estudos murinos [8], o ambiente de ascite EOC humano não é universalmente supressiva e em alguns casos pode aumentar a proliferação de células T.

células de ascites em massa foram estimuladas com ligado placa α-CD3 em meios de comunicação ou 100% ascite autólogas de fluido durante 48 h. (A) A proliferação e função de células T CD8 + na presença de meio ou fluido de ascites autólogo (painel superior) foi avaliada por medição da expressão de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, e IL-2 pelos citometria de fluxo. (B) Efeito de IL-2 (segundo painel), IL-12 (terceiro painel), e IL-21 (quarto painel) sobre a proliferação de células T CD8 + e várias funções na presença de fluido de ascites autólogo. Dados foram normalizados para a-CD3 células estimuladas nos meios de comunicação (isto é, valores de mídia foram subtraídos cada condição de estimulação). * Não havia um efeito significativo da citoquina para aumentar a função indicada em comparação com células estimuladas em meios (Wilcoxon emparelhadas teste t, p 0,05).

próxima determinar se outras funções de células T foram igualmente afectados por ascite ovarianos. A análise de citometria de fluxo foi usada para avaliar cinco marcadores vulgarmente utilizados de função de células T: IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCL4, e CD107a [13], [14], [19], [20], [ ,,,0],21]. Os primeiros quatro marcadores são citocinas envolvidas na proliferação de células T ou uma função efectora, enquanto CD107a é expressa na superfície de células T submetidas a desgranulação celular e assim serve como um marcador de citotoxicidade [13]. Em 4/5 pacientes amostras, fluido de ascites causou uma inibição dramática da expressão CD107a por células T CD8 + (Fig. 1a), a qual foi acompanhada por níveis reduzidos de granzima B em sobrenadantes de cultura (Supl. A Fig. S1A), indicando o ambiente ascite geralmente inibe a desgranulação de células-T. CCL4 e a expressão de IFN-γ foram também inibidas por ascite na maioria das amostras de pacientes (Fig. 1a). As células T que expressam a IL-2 e TNF-α eram relativamente raros, e foram minimamente afectada por fluido de ascites, na maioria dos casos (Fig. 1a). Foram observados resultados semelhantes com células T CD4 + (dados não mostrados). Curiosamente, os efeitos da ascite sobre a proliferação de células T e outras funções de células T foram amplamente desacoplados. Por exemplo, com amostras de pacientes e IROC008 IROC036, fluido de ascites reforçada, tanto de CD8 + e da proliferação de células T CD4 +, mas inibiu a expressão de CD107a, CCL4, e IFN-γ (Fig. 1A, e dados não mostrados). Assim, o fluido de ascites tem efeitos amplamente variáveis ​​sobre as funções de células T entre as amostras dos pacientes, de acordo com a natureza heterogénea de EOC.

Para caracterizar ainda mais os efeitos do fluido de ascites sobre a função imunológica, os sobrenadantes da cultura a partir das experiências acima foram avaliados por ensaios de grânulo multiplex para a expressão de um largo painel de citocinas associadas com processos inflamatórios e imunológicos. De 27 citocinas testadas, nove (IL-1, IL-1Ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, e bFGF) foram inibidas por fluido de ascites em comparação com meios 5 em todas as amostras de pacientes (Supl. a Fig. S1B). fluido de ascites teve efeitos variáveis ​​sobre as citocinas restantes (dados não mostrados). Embora ensaios talão multiplex não fornecem informações sobre a fonte celular (s) de citocinas, os resultados, no entanto, sublinhar as grandes efeitos de fluido ascite no meio de citocinas no EOC.

Apesar de uma avaliação sistemática dos fatores imunossupressores miríade em EOC [1], [2] foi além do escopo deste estudo, nós fizemos investigar a possível influência de Tregs, TGF-β, IL-10, e VEGF. A percentagem de Tregs variou de 2,5% a 6,8% do total de células, mas não houve nenhuma correlação significativa com o grau de inibição da proliferação de células T, ou CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, e expressão de IL-2; Do mesmo modo, os níveis de TGF-β, IL-10, e VEGF em fluido de ascites não se correlacionaram significativamente com o grau de inibição de células T (Tabela 2; correlação de Pearson p 0,05 para todas as comparações). Estes dados reforçam o complexo de Imunobiológicos do ambiente tumor de ovário em que o grau de imunossupressão não se correlacionou com esses fatores imunossupressores comuns.

citocinas exógenas restaurar apenas parcialmente a função das células T no ambiente ascite EOC

no nosso modelo de ratinho de EOC, IL-2 /IL-15 foi de sinalização crítica para a proliferação de células T CD8 + e em função ascite [8]. No entanto, os ensaios anteriores revelaram que a grande maioria das células T em ascites EOC não expressaram níveis detectáveis ​​de IL-2. Isto levou-nos a especular que a adição de IL-2 às culturas pode restaurar a proliferação e função de células-T. Para testar isto, células de ascites a granel foram estimuladas com α-CD3 na presença de fluido de ascites de 100%, com ou sem IL-2 exógena, e a proliferação e função de células T foram medidas 48 horas mais tarde. Em 4/5 amostras dos pacientes, a IL-2 reverteu totalmente os efeitos da ascite sobre a proliferação de células T e de facto induziu respostas superiores às observadas em meio completo (Fig. 1B). Em contraste, a IL-2 teve pouco efeito sobre a expressão do CD107a, CCL4, IFN-γ, ou IL-2 para a maioria das amostras dos pacientes, apesar de ter causado um aumento fraco, mas estatisticamente significativo da expressão de TNF-α (Fig. 1B). Assim, a IL-2 sozinho promoveu a proliferação de células T, mas, em geral, tiveram efeitos insignificantes sobre outras funções.

próxima perguntado se o acoplamento de outras vias de sinalização pode melhorar uma melhor função de células-T. Considerando que a IL-2 activa principalmente a via STAT5, a citoquina relacionada com a IL-12 activa a via STAT4, o que foi mostrado para melhorar a função de células T em diferentes configurações fisiológicos [37]. Quando adicionado a culturas EOC, IL-12 sozinha teve apenas efeitos menores na proliferação ou função de células T CD8 + na maioria das amostras de pacientes (Fig. 1B). Nós próxima avaliada IL-21, que predominantemente ativa as vias de STAT1 e STAT3 [38]. Semelhante a IL-12, IL-21 teve apenas efeitos modestos sobre a proliferação de células T ou a função (Fig. 1B). . Em geral, as tendências semelhantes foram observadas com células T CD4 + (dados não mostrados)

raciocínio de que um grau mais amplo de melhoramento funcional pode ser conseguida por activação simultânea de múltiplos caminhos STAT, avaliou-se duas combinações de citocinas: a) IL-2 + IL-12, e b) IL-2 + IL-12 + IL-21. Importante, a última combinação seria teoricamente activar todas as vias de STAT relevantes para respostas de células T CD8 + (i.e., STAT1, STAT3, STAT4, e STAT5). Em geral, ambas as combinações de citoquinas induzida por proliferação de células T similar à observada com a IL-2 (comparar Fig. 2 com a Fig. 1B). Nomeadamente no entanto, as células T CD8 + a partir de IROC028, que não conseguiram proliferar em resposta a uma única citoquina (Fig. 1B), proliferaram em resposta a ambas as combinações de citoquinas (Fig. 2). Além disso, ambas as combinações de citoquinas foram modestamente mais eficaz do que as citocinas individuais no reforço de IFN-γ e TNF-α de produção (Fig. 2). Apesar disso, nem a combinação citocina expressão do CD107a ou IL-2 (Fig. 2) reforçada. Foram observados resultados semelhantes com células T CD4 +, embora os efeitos de citocinas foram geralmente mais fraca (dados não apresentados). Em resumo, a adição de combinações de citoquinas envolver uma ampla variedade de vias de sinalização STAT não conseguiu restaurar completamente a função de células T no ambiente ascite EOC.

células de ascites em massa foram estimuladas com ligado placa α-CD3 ou em meios 100% fluido ascite autólogo durante 48 h. A proliferação e a função das células T CD8 + na presença de meios de comunicação, fluido de ascites autólogo (painel superior), ou fluido de ascites, na presença de IL-2 + IL-12 (painel do meio), ou IL-2 + IL-12 + IL -21 (painel inferior) foi avaliada por medição da expressão de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, e IL-2 por citometria de fluxo. Dados foram normalizados para a-CD3 células estimuladas nos meios de comunicação (isto é, valores de mídia foram subtraídos cada condição de estimulação). * Houve um efeito significativo da combinação de citocinas para melhorar a função indicada em comparação com células estimuladas nos meios de comunicação (Wilcoxon pares combinados de teste t, p 0,05).

Finalmente, avaliou-se a ativação de não vias de sinalização -stat poderia aumentar ainda mais a função das células T. Para este fim, foi avaliada a citocina IL-18, que pertence à família de citoquinas IL-1, activa a via MyD88 /NFkB, e pode aumentar directamente respostas de células T CD8 + em uma variedade de configurações de [39], [40] , [41]. IL-18 sozinha teve efeitos fracos sobre a proliferação e função (Fig. 3A) de células T. No entanto, quando combinado com IL-2 + IL-12, IL-18 significativamente aumentado de expressão de IFN-γ e, em menor grau, o TNF-α (Fig. 3A). Além disso, a combinação de IL-2 + IL-12 + IL-18 aumentam significativamente a quantidade de IFN-γ produzido numa base por célula, como evidenciado por um aumento da intensidade de fluorescência média (IFM) (Fig. 3B e C). No entanto, a combinação de IL-2 + IL-12 + IL-18 não foi capaz de aumentar significativamente a expressão do CD107a ou IL-2 (Fig. 3A) e libertação apenas modestamente aumentada granzima B (Supl. A Fig. S2A). Do mesmo modo, esta combinação não conseguiu restaurar a expressão de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, ou bFGF em sobrenadantes de cultura (Supl A Fig. . S2B). Esta combinação, no entanto, fracamente aumentar os níveis de IL-5 e IL-10 em sobrenadantes de cultura (Supl. Fig. S2C). Assim, a combinação de IL-2 + IL-12 + IL-18 restaura parcialmente a funcionalidade de células T no ambiente EOC.

células de ascites em massa foram estimuladas com ligado placa α-CD3 ou em meios 100% fluido ascite autólogo durante 48 h. A proliferação e a função das células T CD8 + na presença de meio ou fluido de ascites autólogo (painel superior) foi avaliada por medição da expressão de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, e IL-2 por citometria de fluxo. (A) Efeito de IL-18 (painel do meio) e IL-2 + IL-12 + IL-18 (painel de baixo) sobre a proliferação de células T CD8 + e várias funções na presença de fluido de ascites. Dados foram normalizados para a-CD3 células estimuladas nos meios de comunicação (isto é, valores de mídia foram subtraídos cada condição de estimulação). * Não havia um efeito significativo da IL-2 + IL-12 + IL-18 para melhorar a função indicada em comparação com células estimuladas em meios (Wilcoxon emparelhadas teste t, p 0,05). (B): intensidade de fluorescência (IMF) das células T CD8 + positivas de IFN-y foi determinada por coloração de IFN-γ intracelular. * O efeito de IL-2 + IL-12 + IL-18 foi significativamente maior do que as outras duas combinações de citoquinas (Wilcoxon emparelhadas teste t, p 0,05). (C) de fluxo representativas citometria parcelas que demonstram o efeito de combinações de citoquinas sobre a produção de IFN-γ numa base por célula. Mostram-se a fluorescência média de intensidade (eixo Y) da produção de IFN-γ e a percentagem de células CD8 + que expressa IFN-γ (números). Todos os dados são delimitação de linfócitos CD8 +.

citocinas exógenas induzir novos perfis de células T polifuncional

Em teoria, o aumento da atividade de combinações de citoquinas em comparação com citocinas individuais podem reflectir quer (a ) diferentes citocinas que estimulam as subpopulações distintas de células T, ou (b) citocinas actuam sinergicamente para induzir as células T individuais para executar várias funções (isto é, a indução de células T polifuncionais). Para investigar esta questão, foi utilizada a análise portão booleana para estudar as diferentes variantes funcionais apresentados por células T CD8 + e CD4 + T, sob diferentes condições de estimulação. Como pode ser visto no painel de topo da Fig. 4, quando as células de ascites a granel foram estimuladas em meio completo, apenas cinco permutações funcionais predominantes foram observadas entre as células CD8 + T: (a) não funcional (isto é, função zero) células T (dados não apresentados); (B) células T mono-funcional que expressa CCL4 ou CD107a (permutações 2 e 5), (c) células T bi-funcionais que expressam ambas as células (d), tri-funcional T que expressam CD107a CD107a e CCL4 (permutação 13), e, CCL4 , e IFN-γ (permutação 24). Na presença de fluido de ascites de 100%, o número de células T funcionais não aumentou, ao passo que as outras permutações funcionais foram reduzidas com a excepção de as células T que expressam mono-funcional CCL4 (Fig. 4, um segundo painel). Em geral, a adição de citoquinas individuais não conseguiu alterar significativamente as permutações funcionais observados com ascite por si só, embora IL-2 teve efeitos fracos sobre várias permutações (Supl. Fig. S3). Em contraste, a adição de combinações de citoquinas (quer de IL-2 + IL-12 + IL-21, ou IL-2 + IL-12 + IL-18) diminuiu marcadamente o número de células T-zero e monofuncionais e gerou três novos permutações polifuncionais: a) CCL4 e IFN-γ (permutação 10); b) CCL4, IFN-γ, e TNF-α (permutação 17); e c) CCL4, IFN-γ, TNF-α, e CD107a (permutação 28) (Fig. 4, terceiro e quarto painéis). tendências semelhantes foram observados para células T CD4 +, embora os efeitos foram geralmente mais fraca (dados não apresentados). Assim, estas combinações de citoquinas parecem actuar sinergicamente para induzir respostas de células T por polifuncionais individuais em oposição a estimular múltiplas subpopulações de células T mono-funcional.

células de ascites em massa foram estimuladas com ligado placa α-CD3 em meios ou 100% de fluido de ascites autólogo durante 48 h na presença ou ausência da combinação citoquina indicada. análise portão booleana foi realizada para quantificar o número de células T que expressam cada um dos 31 permutações possíveis funcionais. Mostram-se os resultados para as células T CD8 + estimuladas em Media, fluido de ascites, fluido de ascites ou suplementados com as citocinas diferentes da IL-2 + IL-12 + IL-21 ou IL-2 + IL-12 + IL-18. A frequência das células T que expressam um dado permutação é expresso como uma percentagem do total de células T CD8 +. * Para a permutação indicada, o efeito da combinação de citocinas foi significativamente maior do que a observada com a mídia (Wilcoxon pares combinados de teste t, p 0,05).

Discussão

Mostramos aqui que o ambiente de ascite em EOC humano tem efeitos variáveis ​​na CD8 + e proliferação de células T CD4 + e de facto pode até aumentar a proliferação em alguns casos. Em contraste, ascite geralmente inibe a expressão de IFN-γ, TNF-α, CCL4, e CD107a por células T, resultando em uma preponderância de nulas ou monofuncionais células T. Além disso, o ambiente de expressão ascite geralmente inibida de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, bFGF e em sobrenadantes de cultura. Embora a IL-2 pode restaurar a proliferação de células T, foi largamente ineficaz a melhorar outras funções das células T, assim como outras citoquinas único agente (IL-12, IL-18 e IL-21). As combinações de citocinas que activam as vias de sinalização complementares (em particular IL-2 + IL-12 + IL-18) foram capazes de aumentar a expressão de IFN-γ, TNF-α, e CCL4 mas teve efeitos desprezáveis ​​sobre outras funções das células T. Assim, citocinas exógenas podem restaurar parcialmente a função das células T no ambiente EOC humano; no entanto, estratégias alternativas serão necessários para restaurar completamente a função das células T.

Uma limitação deste estudo é o tamanho da amostra relativamente pequena, o que era necessário, dado o número de citocinas e ler-outs funcionais envolvidos. Apesar do pequeno tamanho da amostra, havia um notável grau de semelhança entre os perfis funcionais globais de todas as cinco amostras de pacientes, tanto no início do estudo e após a estimulação de citocinas. Isto sugere que os diversos mecanismos imunossupressores presentes no câncer de ovário pode em última análise, convergem para um estado funcional das células T comum regido por um conjunto conservado de sinais de regulação.

A libertação de grânulos citotóxicos é um importante mecanismo pelo qual as células T células matar vírus-infectadas e transformadas [42]. Descobrimos que ascite fluido inibiu fortemente a desgranulação de células T, e este foi apenas parcialmente restaurada por citocinas exógenas (como evidenciado pela melhoria modesta da liberação de granzima B). Estudos anteriores demonstraram que a combinação de IL-2 com a estimulação de TCR [9] ou de IL-12 [10], [11] pode restaurar completamente a citotoxicidade LAK na presença de fluido de ascites de 50%. Esta discrepância com os nossos resultados podem reflectir as condições de cultura mais exigentes que empregues, em que as células T foram ensaiadas na presença de 100% de fluido de ascites e um conjunto completo de outros tipos de células associados ao tumor.

A falta de IL-2 produção de ambas as células T CD8 + e T CD4 + nestas experiências é também consistente com uma resposta anti-tumoral diminuída. No nosso modelo de ratinho de cancro do ovário [8], regressão do tumor estava totalmente dependente da IL-2 /IL-15 sinalização. Da mesma forma, Gattinoni e colegas demonstraram que a actividade anti-tumor de células T CD8 + efectoras capazes de potente

In vitro anti-tumoral

citotoxicidade e a produção de IFN-γ, mas não de IL-2 produção, tinha limitado

In vivo

, enquanto as células T que tinham baixo

in vitro

citotoxicidade, mas de alta produção de IL-2, mediadas superiores respostas anti-tumorais [12]. Como as células T CD8 + geralmente perdem a capacidade de produzir IL-2 na diferenciação, a falta de citocinas para aumentar a produção de IL-2 sugere que a maioria das células T associados a tumor podem ser efectores terminalmente diferenciados [13]. Se assim for, os esforços futuros devem ser dirigidos para o isolamento e a expansão subconjuntos menos diferenciadas de células T com maior pluripotência.

Além falharam a produção de IL-2, verificou-se que inibiu o fluido de ascites expressão de numerosas outras citocinas ( IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, bFGF e) nos sobrenadantes da cultura. Embora o ensaio de citocina multiplex que empregue não pode discriminar que tipo (s) celular é inibida de produzir estas citocinas, muitas destas citocinas têm documentado papéis nas respostas de células T e, portanto, espera-se que os seus níveis reduzidos para impactar a função das células T. Em particular, a IL-17 é produzido por o subconjunto Th17 de células T CD4 + em condições de inflamação e tem sido correlacionada com a sobrevivência global melhorada no EOC [5]. Dado que a combinação de IL-2 + IL-12 + IL-18 não conseguiu aumentar a produção de IL-17, as estratégias alternativas serão necessários para promover este via efectora dentro do ambiente tumoral. Por exemplo, IL-1β, IL-6, TGF-β, IL-23, e ICOS têm sido mostrados para influenciar a diferenciação, a expansão ou a função de células Th17 [4], [43], e, assim, poderia potencialmente ser manipulada para promover a produção de IL-17

In vivo

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em contraste com estes defeitos de citoquinas, a combinação de IL-2 + IL-12 + a produção de IFN-γ potentemente aumentada de IL-18 pelos As células T CD8 + (Fig. 3B, C). IFN-γ desempenha um papel central na imunidade anti-tumor por inibição da proliferação tumoral e angiogénese, e a apresentação de antigénios de tumor de regulação alta. Endógena de IFN-γ protege contra o desenvolvimento do tumor e, num certo número de modelos de tumores, é fundamental para a imunidade anti-tumoral [44]. Além disso, o IFN-γ e expressão do receptor de IFN-γ, bem como vários genes a jusante de IFN-γ, estão associados com o aumento da sobrevivência em EOC humana [1]. Como pode IL-2, IL-12 e IL-18 cooperativamente aumentar a produção de IFN-γ? Em primeiro lugar, estas citocinas mutuamente regular a expressão dos respectivos receptores, resultando num aumento da sensibilidade de células T para todas as três citoquinas [45], [46], [47], [48]. Em segundo lugar, estas citoquinas podem mediar eventos de sinalização complementares sinérgicos e [37], [49], [50]. Por exemplo, IL-2 e IL-12 em sinergia activar a via da MAPK p38 para aumentar a expressão de IFN-γ [51]. Do mesmo modo, IL-12 e IL-18 de activar os factores de transcrição STAT4 e AP-1, respectivamente, o que pode aumentar sinergisticamente a actividade do promotor de IFN-γ [52]. Assim, a activação coordenada de ambos os STAT e de sinalização não-STAT vias parece importante para a expressão máxima de IFN-γ. É digno de nota, no entanto, que estes sinais não foram suficientes para restaurar a expressão de muitas outras citoquinas. Isto sugere que, no futuro, outros do que IFN-γ citocinas deve ser usado como leituras de se se pretende optimizar a gama de funções de células T para a imunoterapia do cancro.

A combinação de IL-2 + IL -12+ IL-18 também induziu alterações significativas nos permutações de células T polifuncionais.