Abstract

modelos ortotópico de vários tipos de tumores são amplamente utilizados em anti-tumorais experimentos terapêuticos em estudos pré-clínicos. No entanto, existem algumas formas de monitorizar adequadamente efeito terapêutico em modelos ortotópicos tumorais, especialmente para tumores invisíveis do exterior. Neste estudo teve como objetivo estabelecer um método de imagem de bioluminescência não-invasivo semi-quantitativa de monitoramento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de esôfago. Nós confirmamos que a linha de células de câncer de esôfago TE8 implantado ortotopicamente para o esôfago abdominal de

nu /nu

ratos (n = 5) desenvolveu não só um tumor principal no local implantado, mas também de metástases linfáticas, locais e peritoneal disseminações dentro de 6 semanas após a inoculação. Nós estabelecemos uma linha celular TE8 que expressa estavelmente o gene luciferase de pirilampo (TE8-Luc). Demonstramos que as células TE8-Luc implantadas subcutaneamente em

nu /nu

ratinhos (n = 5) ao longo do tempo cresceu até 5 semanas após a inoculação. O volume do tumor foi fortemente correlacionado com a intensidade luminescente emitida a partir do tumor, a qual foi quantificada utilizando o sistema de imagiologia IVIS. Em seguida, mostraram que as células TE8-Luc implantados ortotopicamente para o esófago abdominal do rato (n = 8) também formado um tumor e que a intensidade luminescente de um tal tumor, tal como detectado por IVIS, aumentou ao longo do tempo até 7 semanas após a inoculação e, portanto, susceptível de reflectir a progressão do tumor. Propomos, portanto, que este modelo ortotópico de câncer de esôfago, monitorado usando o sistema de imagem não-invasiva semi-quantitativa IVIS, será útil para experimentos in vivo terapêuticas contra o câncer de esôfago. está prevista para este cenário experimental para contribuir para o desenvolvimento de novas tecnologias terapêuticas para o câncer de esôfago em estudos pré-clínicos

Citation:. Kuroda S, Kubota T, Aoyama K, Kikuchi S, Tazawa H, Nishizaki M, et al. (2014) Estabelecimento de um método não-invasivo Semi-Quantitativo Bioluminescent Imaging para Monitoramento de um cancro do Modelo rato ortotópico de esôfago. PLoS ONE 9 (12): e114562. doi: 10.1371 /journal.pone.0114562

editor: Sunil Singhal, University of Pennsylvania, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2014; Aceito: 11 de novembro de 2014; Publicação: 10 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kuroda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Grant-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Esportes e Tecnologia, Japão (TF) e subvenções o Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão (TF). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago é um dos tipos mais comuns de câncer em todo o mundo. Histologicamente, O carcinoma de células escamosas para mais de 90% dos cancros no Japão, enquanto as contas de adenocarcinoma por mais da metade dos casos de câncer em os EUA O prognóstico de câncer de esôfago é bastante pobre entre os cancros do tracto gastrointestinal, tais como câncer de estômago e câncer de cólon como cânceres de esôfago são propensas a metástases linfáticas e invasão direta para os órgãos circundantes. Apesar do progresso no diagnóstico precoce e na evolução das técnicas cirúrgicas e dispositivos, assim como na quimioterapia, a radioterapia e a sua combinação, cancro do esófago não foi ainda satisfatoriamente ultrapassadas e este é um campo em que se espera que novos agentes terapêuticos eficazes para ser desenvolvido no futuro próximo [1] – [3].

no campo da descoberta de medicamentos, modelos de tumores ortotópicos são, sem dúvida melhores modelos do que os modelos subcutâneos para avaliação da eficácia terapêutica de novos medicamentos, porque eles melhor refletir a progressão da doença de os tumores originais [4], [5]. Uma variedade de modelos de tumores ortotópicos têm sido utilizados em estudos com animais, incluindo modelos de cólon, do pâncreas, do fígado, do pulmão, da próstata, de célula renal, da bexiga, da mama, melanoma e tumores cerebrais [6]. No entanto, existem poucos relatos de modelos de câncer de esôfago ortotópicos apesar da necessidade urgente de tal modelo. A falta de um modelo ortotópico de cancro do esófago parece ser devido aos problemas de localização e tamanho do esófago para além da dificuldade técnica de estabelecer um modelo ortotópico anatómica.

A disponibilidade de um método para avaliar a eficácia terapêutica é outra questão quando se utiliza um modelo ortotópico. Embora a taxa de sobrevivência ou o peso corporal foi utilizada para avaliação, estes parâmetros não reflectem directamente a eficácia terapêutica, devido à influência de uma série de outros factores de tal eficácia. Algumas modalidades de diagnóstico têm sido usados ​​como métodos não-invasivos para a monitorização de um modelo ortotópico, como a ressonância magnética (MRI) [7], [8] e tomografia por emissão de positrões (PET) /tomografia computadorizada (CT) [9 ], [10]. Além disso, a utilização de proteína fluorescente verde (GFP) – [4], [11] e luciferase- [12], [13] que expressam as linhas celulares apresentaram uma abordagem interessante para o desenvolvimento de uma técnica de imagem não invasiva

Aqui nós relatamos o estabelecimento de um modelo original ortotópico de esôfago câncer em ratos, que desenvolveram metástases nos nódulos linfáticos locais e disseminações peritoneal, além do tumor principal. Usando este modelo, confirmou que o sistema de imagem IVIS (Xenogen, Alameda, CA) foi apropriada e útil como um método de monitoramento não-invasivo para a progressão do tumor neste modelo.

Materiais e Métodos

o protocolo experimental animal foi aprovado pelo Comitê de revisão Ética em Experimentação animal da Universidade de Okayama, e todos os ratos utilizados neste estudo foram anestesiados com cetamina /xilazina ou isoflurano /oxigênio para experimentos e sacrificados com deslocamento cervical sob anestesia.

As linhas celulares e culturas de células

O esofágica escamosa linha de carcinoma humano, TE8 (RIKEN BRC Cell Bank, Japão) foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS), 100 unidades /ml penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. TE8 transfectadas com o vector plasmídeo de luciferase de pirilampo (PGL-controlo-RSVneo) (gentilmente fornecida pelo Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University, Osaka, Japão) e clonadas por diluição limitante (TE8-Luc) foi cultivada como descrito para o anterior mas com TE8 a adição de 0,2 mg /mL de Geneticina (G418) (Life Technologies, 10131-027) para o meio. O nível médio de atividade luciferase por 5,0 × 10

4 células TE8-Luc foi 1462 unidades relativas de luz (RLU).

modelo de tumor subcutâneo

células TE8-Luc (2 × 10

6 células /ratinho) foram injectados subcutaneamente no flanco de cinco 5-6 semanas de idade do sexo feminino BALB /c

nu /nu

ratos. O diâmetro perpendiculares de cada tumor foi medido uma vez por semana até 5 semanas após a inoculação do tumor. O volume do tumor foi calculado pela seguinte fórmula: volume do tumor (mm

3) =

a

×

b

2 × 0,5, onde

a

é o diâmetro mais longo,

b

é o diâmetro mais curto, e 0,5 é uma constante para calcular o volume de um elipsóide.

ortotópico modelo de cancro esofágico

fêmea BALB /c

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ratinhos (5-6 semanas de idade) foram fixados em uma posição supina. Uma incisão na pele de 7 a 10 mm de comprimento foi feita no meio da parte superior do abdómen do processo xifóide. O fígado foi levantado eo estômago foi puxado para baixo com uma pinça para que o esôfago abdominal podia ser visto. Uma seringa de 1 mL com uma agulha de 31 gauge, na qual as células TE8 ou TE8-Luc foram suspensas em Matrigel a uma concentração de 2 x 10

6 células /20 ul, foi inserido na parede anterior do estômago e em seguida subserosally movido para o esófago abdominal através da junção esophagastric. As células foram, em seguida, lentamente injectada. Finalmente, o abdómen foi fechado com suturas (Filme S1).

Usando este método, as células foram TE8 ortotopicamente implantado em cinco BALB /c

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ratos. Aos 4 semanas após a inoculação do tumor, todos os cinco ratos foram operados novamente para verificar o desenvolvimento do tumor e, em seguida, um dos cinco ratos foi sacrificado e seu principal do tumor e um gânglio linfático local foram colhidas para exame histológico. Em 6 semanas após a inoculação, os outros quatro ratos foram todos sacrificados após re-laparotomia e observação.

células TE8-Luc foram implantados para o esôfago abdominal de oito BALB /c

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ratinhos utilizando o mesmo método. Às 3 semanas após a inoculação tumoral, todos os ratinhos foram operados para verificar o desenvolvimento do tumor e, em seguida, cinco dos oito ratinhos, nos quais foi observada a formação de tumor no esófago, foram monitorizados uma vez por semana utilizando o sistema de imagiologia IVIS descrito abaixo, até 7 semanas após a inoculação do tumor.

imagiologia IVIS

luciferina, o substrato da luciferase, foi injectada intraperitonealmente em ratinhos a uma dose de 150 mg /kg de peso corporal. Os ratos foram em seguida anestesiados e colocados na fase de imagiologia IVIS do aparelho na parede abdominal (modelo subcutânea) ou a posição supina (modelo ortotópico). As imagens foram coletadas a cada poucos minutos de 10 a 30 minutos após a injeção de luciferina usando o Imaging System IVIS (Xenogen, Alameda, CA), e fótons emitidos a partir do tumor e seus arredores foram quantificados utilizando Viver Imagem Software (Xenogen).

análise estatística

análise de regressão linear simples foi realizada utilizando o Microsoft Excel para examinar a correlação entre o volume do tumor e a intensidade luminescente, e o coeficiente de determinação, R

2, foi calculada para avaliar a força da associação.

resultados

células TE8 injectado no espaço subseroso do esôfago abdominal de ratinhos Balb /c

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ratinhos formado um tumor (Fig. 1A) em quatro dos cinco ratinhos e desenvolveram metástases nos nódulos linfáticos locais (Fig. 1c) em dois dos cinco ratinhos 4 semanas após a inoculação do tumor. Em 6 semanas após a inoculação, outro rato teve resultados de disseminações peritoneal (Fig. 1e). A formação de um tumor principal (Fig. 1B) e metástases para os nódulos linfáticos locais (Fig. 1D) também foram confirmadas por avaliação histológica. O tumor cresceu principal no espaço submucosa apesar de ter sido injectado no espaço subseroso, ao passo que não invada a camada mucosa

.

células A) TE8 implantado no esôfago abdominal formado um tumor no local implantado (seta branca ) a 4 semanas após a inoculação do tumor. B) H.E. a coloração do tecido embebido em parafina do tumor principal (A) mostrou que o tumor tinha espalhado para dentro do espaço da submucosa do esófago abdominal. (T: tumor, G: Lumen, E: camada epitelial, H: camada muscular) C) TE8 células implantadas para o esófago abdominal desenvolvidos linfáticos locais nó metástases (seta branca) às 4 semanas após a inoculação do tumor. D) H.E. coloração do tecido embebido em parafina do linfonodo local (C) indicou histologicamente linfonodo metástases. células TE8 E) implantado disseminações peritoneal ortotopicamente também desenvolvidos (setas pretas) em 6 semanas após a inoculação do tumor. Barras de escala; 2 mm (A, C, E), 500 um (B, D)

próxima gerado células TE8-Luc, que expressam de forma estável o gene da luciferase de pirilampo, e implantadas subcutaneamente estas células em ratinhos BALB /c

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ratos. A luminescência destas células foi monitorizada com o sistema de imagiologia IVIS para determinar se o volume do tumor correlacionada com a intensidade luminescente. células TE8-Luc formado um tumor em todos os cinco ratinhos. À medida que os tumores cresceram, intensidade luminescente aumentou ao longo do tempo, avaliada tanto visualmente (Fig. 2A) e quantitativamente (Fig. 2B) (Fig. 2C). O volume do tumor e a intensidade luminescente foi fortemente correlacionado com a outra (

2 = 0,9199 R) (Fig. 2D), indicando que a medição da intensidade luminescente é apropriado para a avaliação de progressão tumoral.

a) as imagens IVIS obtiveram-se uma vez por semana até 5 semanas após a inoculação subcutânea de células TE8-Luc. B) A intensidade luminescente de fotões emitidos a partir de cada tumor nas imagens em (A) foi quantificado. Rato numeração corresponde à numeração em (A). O volume do tumor C) também foi calculada uma vez por semana. D) A correlação entre a intensidade luminescente emitido por cada volume do tumor e tumor foi avaliada estatisticamente usando os dados de (B) e (C).

Por fim, determinou-se as células TE8-Luc poderia formar uma ortotópico tumor que cresceu ao longo do tempo. Cinco de oito ratinhos BALB /c

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ratinhos em que as células TE8-Luc foram implantados ortotopicamente para o esófago abdominal desenvolveu um tumor no local implantado em 3 semanas após a inoculação do tumor, o que foi confirmado por re-laparotomia . Estes cinco ratinhos foram monitorizados por IVIS uma vez por semana, e fotões emitidos a partir do tumor e os seus arredores aumentou ao longo do tempo tal como avaliado tanto visualmente (Fig. 3A) e quantitativamente (Fig. 3B).

a) as imagens IVIS obtiveram-se uma vez por semana a partir de 3 a 7 semanas após TE8-Luc a inoculação do tumor ortotópico no esófago abdominal. B) A intensidade luminescente de fótons emitidos a partir de cada tumor e seus arredores nas imagens em (A) foi quantificada. Rato numeração corresponde à numeração em (A).

Discussão

Furihata et al. [14] foram os primeiros a relatar estabelecimento de um modelo de inoculação esofágica ortotópico em murganhos, em 2001, em que se abriu a parede anterior do estômago e injectadas células tumorais para o espaço da submucosa do esófago abdominal directamente após laparotomia. Em contraste, as células injectadas para dentro do espaço subseroso do esôfago abdominal sem abrir o estômago. Embora seu método é teoricamente um método mais ideal do que a nossa, nosso método é mais simples e ainda é um método aceitável porque os tumores formados usando o nosso método cresceu e se espalhou no espaço submucosa apesar de ser injetado no espaço subseroso como os achados histológicos em Fig. 1C show. Dois dos cinco de nossos ratos modelo desenvolvido metástases nos nódulos linfáticos locais e um rato exibiu disseminações peritoneal. metástases óbvio para fígado, pulmão ou linfonodos do mediastino não foram encontrados. A fim de gerar um modelo ortotópico de cancro do esófago mais invasiva, pode ser necessário utilizar mais células invasoras [15] ou a utilização de amostras de tumor clínicos que têm alto potencial invasivo [4].

Ohara et al. [16] estabeleceu um modelo de camundongo ortotópico interessante de câncer de esôfago cervical e torácica através da injeção de células tumorais para o lúmen do esôfago através da boca. Enquanto este método parece simples em que não é necessária qualquer técnica cirúrgica, pode ser difícil julgar se as células de tumor são injectadas com precisão para o esófago, porque o processo é realizado inevitavelmente às cegas. No entanto, este método pode ter uma vantagem sobre o método em que se faz com que a ingestão oral pobre, o qual reflecte melhor a progressão do tumor original. Em nosso estudo, o peso corporal não diminuiu em tudo até pouco antes da morte, apesar do crescimento tumoral extensa e spread (dados não mostrados).

Quatromoni et al. [17] relataram recentemente imunoterapia adenoviral baseado em eficaz contra o cancro do esófago, no qual um modelo de ratinho do cancro esofágico ortotópico estabelecida na junção gastroesofágico utilizando a mesma técnica como mostramos nos foi usada no filme. Neste modelo, os tumores cresceram ao longo do tempo confinados ao local do tumor por injecção sem invasão directa da mucosa esofágica. No entanto, os tumores não causar obstrução da luz esofágica e nenhuma ratos tinham evidência de disfagia e perda de peso significativa. Estas características são todos semelhantes com aqueles que mostrou em nosso estudo.

Em contraste, Gros et al. [18], [19] estabeleceram um modelo ortotópico rato cancro do esófago usando uma linha celular de cancro esofágico altamente agressivo, da mesma forma como o nosso, em que se detectou a disseminação metastática para o fígado e os pulmões, bem como para os nódulos linfáticos usando alta resolução imagem com GFP e por ressonância magnética enquanto não foram capazes de detectar metástases para o fígado ou outros órgãos por imagem luciferase em nosso estudo. Estes relatórios de Quatromoni et al. e Gros et al., incluindo o nosso estudo, sugerem que o modelo de câncer de esôfago ortotópico estabelecida na junção gastroesofágico e seu método de criação é universal e reprodutiva, e que este modelo pode causar a progressão do tumor, que está perto de prática clínica real, tais como metástases para os nódulos linfáticos, o peritoneu e o fígado ou outros órgãos em adição ao crescimento local do tumor.

ao contrário dos modelos subcutâneos, que é difícil de analisar com precisão a progressão do tumor em modelos de tumor ortotópicos. Embora a taxa de sobrevivência e peso corporal são comumente usados ​​como métodos de avaliação em estudos ortotópicos, esses parâmetros não refletem diretamente a eficácia terapêutica, porque muitos outros fatores também influenciam os resultados. A utilização de células de tumor marcadas com o gene repórter de luciferase e imagiologia bioluminescente, que constitui actualmente um método bem utilizado no campo da pesquisa, nos permite monitorar o crescimento de tumores de forma não invasiva, in vivo, especialmente em tecidos profundos [13]. Portanto, originalmente criado células TE8-Luc, que foram estavelmente transfectadas com o gene luciferase de pirilampo e usados ​​para o monitoramento não-invasivo.

Em nosso estudo, usando o sistema de imagem IVIS, a intensidade luminescente de fótons emitidos a partir tumores subcutâneos TE8-Luc fortemente correlacionados com o crescimento do tumor. Com base neste facto, é provável que, por conseguinte, um aumento na intensidade luminescente num modelo ortotópico com precisão ao longo do tempo reflecte a progressão do tumor. De facto, num estudo anterior em que monitorizada quantitativamente eficácia terapêutica neste modelo ortotópico utilizando o sistema de imagiologia IVIS, a mudança na intensidade luminescente que parecem reflectir com precisão a eficácia terapêutica [20]. Portanto, o método que descrevemos no presente estudo para o estabelecimento de um modelo de cancro esofágico ortotópico em murganhos e para monitorização não invasiva com o sistema de imagiologia IVIS é um método muito útil e possível, e espera-se que contribuem para o desenvolvimento de novos tecnologias terapêuticas para o câncer de esôfago.

Informações de Apoio

filme S1. .

Como fazer um modelo de camundongo ortotópico de câncer de esôfago

doi: 10.1371 /journal.pone.0114562.s001

(MPG)

Agradecimentos

Os autores agradecem Tomoko Sueishi e Tae Yamanishi por sua excelente suporte técnico.