Abstract

CABOZANTINIB é um inibidor de múltiplos receptores tirosina-quinase, incluindo MET e VEGFR2. Em um ensaio clínico de fase II em câncer de próstata avançado (APC), CABOZANTINIB tratamento melhorou cintilografia óssea em 68% dos pacientes avaliáveis. Nossos estudos teve como objetivo determinar a expressão de alvos CABOZANTINIB durante a progressão da APC e para avaliar a sua eficácia em hormono-sensível e resistente à castração CaP em modelos pré-clínicos, enquanto delineando seus efeitos sobre o tumor e osso. Usando imunohistoquímica e microarrays de tecido contendo próstata normal, CaP primário e as metástases de tecidos e ossos moles, nossos dados mostram que os níveis de MET, P-MET, e VEGFR2 estão a aumentar durante a progressão CaP. Os nossos dados também mostram que a expressão de alvos CABOZANTINIB são particularmente pronunciadas em metástases ósseas. Para avaliar a eficácia CABOZANTINIB no crescimento CaP no ambiente de ossos e nos tecidos moles que usamos LuCaP 23,1 e tumores C4-2B CaP resistente à castração sensível ao andrógeno.

In vivo

, CABOZANTINIB inibiu o crescimento de CaP no osso, bem como o crescimento de tumores subcutâneos. Além disso, o tratamento CABOZANTINIB atenuou a resposta do osso para o tumor e resultou no aumento do volume de osso normal. Em resumo, o padrão de expressão de alvos CABOZANTINIB em CaP metastática primária e resistente à castração, e a sua eficácia em dois modelos diferentes de CaP sugerem que este agente tem um forte potencial para o tratamento eficaz de CaP em diferentes estágios da doença.

Citation: Nguyen HM, Ruppender N, Zhang X, Brown LG, TS Gross, Morrissey C, et al. (2013) CABOZANTINIB inibe o crescimento de andrógeno-sensível e resistente à castração do cancro da próstata e afeta Remodelação Óssea. PLoS ONE 8 (10): e78881. doi: 10.1371 /journal.pone.0078881

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2013; Aceito: 16 de setembro de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nguyen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os estudos neste manuscrito foram em parte financiado pela Exelixis Inc. dois dos co-autores (DTA e FS) são funcionários da Exelixis. Eles estavam envolvidos no desenho do estudo, análises de dados e na preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este estudo foi parcialmente financiado pela Exelixis Inc., o empregador de Frauke Schimmoller e Dana T. Aftab. Eva Corey recebeu financiamento para pesquisa da Exelixis, Inc., através do Contrato de pesquisa patrocinado com a Universidade de Washington. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

As metástases permanecem a principal causa de morbidade e a mortalidade em homens que sofrem de câncer de próstata avançado (APC). Apesar de os agentes existentes que são eficazes contra CaP avançado, a sobrevivência após o desenvolvimento de resistência a castração continua a ser muito curto. Assim sendo, novos, são urgentemente necessários tratamentos eficazes contra a doença metastática e resistente à castração.

CABOZANTINIB é um potente inibidor de tirosina-quinases receptoras, incluindo MET e VEGF receptor 2 (VEGFR2). Outros alvos inibidas por CABOZANTINIB incluem AXL, FLT-3, KIT, e ret [1,2]. Os efeitos de CABOZANTINIB foram avaliadas na configuração pré-clínico em vários cancros, incluindo glioma, mama, pulmão, e pâncreas. Nestes estudos, CABOZANTINIB reduzida capacidade de invasão do tumor, proliferação e da angiogénese, enquanto aumenta a apoptose [1,2]. Estudos pré-clínicos em um modelo de câncer neuroendócrino do pâncreas têm fornecido alguns insights sobre os mecanismos de ação CABOZANTINIB, sugerindo um equilíbrio funcional entre MET e VEGFR2 através do envolvimento de HIF1A [2-5]. No entanto, os mecanismos que envolvem outros alvos de CABOZANTINIB, como RET, um alvo importante no carcinoma medular da tiróide [6,7], e Axl ou KIT, não foram extensivamente examinada ou relatados. Dadas as funções destas cinases na biologia do tumor, inibição CABOZANTINIB de qualquer ou de todos estes objectivos podem ser benéficos para o tratamento de CaP, atacando as células tumorais em várias frentes. Este tipo de ataque pode potencialmente atingir populações de células heterogéneas eficazmente, tais como os de CaP.

CABOZANTINIB foi recentemente aprovado pela FDA para o tratamento clínico de, metastático cancro medular da tiróide progressivo. Esta aprovação, seguida observações iniciais de actividade CABOZANTINIB contra esta doença na fase inicial I estudo clínico [5]. CABOZANTINIB também demonstrou resultados encorajadores em pacientes com metástases, resistente à castração CaP (CRPC) em uma suspensão II de ensaios randomizado de fase adaptativo. melhorias substanciais nos exames ósseos foram observados em 68% dos pacientes avaliáveis. Além disso, 72% apresentaram regressão em lesões de tecidos moles, e 67% experimentaram uma melhoria na dor óssea [3]. No entanto, é importante notar que, às 12 semanas a taxa de resposta objectiva foi de 5%, e 75% dos pacientes apresentaram doença estável [3]. No entanto, nenhum outro agente tem mostrado que este conjunto de efeitos em homens com CRPC, indicando um mecanismo único de acção potencialmente para CABOZANTINIB nesta configuração doença.

MET e o seu ligando, o factor de crescimento de hepatócitos (HGF), têm sido implicados na progressão de muitos cancros. sinalização TEM promove a sobrevivência celular, proliferação, invasão, metástase e angiogênese

in vivo

e

in vitro

[8]. Na APC, MET é expressa em CaP primário, e maiores níveis de expressão são detectados em metástases APC no osso [9-11]. Além disso, a expressão TEM foi associada com PCA grau, pontuação de Gleason, e mau prognóstico [9], e os níveis plasmáticos elevados de HGF foram encontrados para ser um indicador de mau prognóstico em pacientes CaP [12]. Além disso, resultados pré-clínicos demonstraram diafonia entre o receptor de androgénio (AR) e sinalização de TEM, com sinalização AR resultando em inibição directa da expressão MET [13,14]. Portanto, a regulação positiva de sinalização MET pode estar associada com a progressão da APC a resistência castração. Assim, vários novos TEM inibidores estão sendo desenvolvidas contra vários tipos de câncer, incluindo CaP [15]. No entanto, uma revisão da literatura atual mostrou resultados mistos de inibição MET em CaP. The Met inibidores PHA-665752 e PF2341066 inibiu o crescimento de células CaP [16], e knockdown de expressão MET por um adenovírus inibiu o crescimento do APC e das metástases em linfonodos (LN) [17]. Em contraste BMS-777607, um outro inibidor de MET, não afectou de forma significativa a proliferação de células de CaP, mas inibiu a sua capacidade de invasão e migração [18]. Na clínica, um número de agentes que têm como alvo seletivamente MET não conseguiram demonstrar um benefício clínico substancial em pacientes com CRPC [19,20].

VEGFR2 também desempenha papéis importantes em vários cancros, incluindo CaP. sinalização VEGFR é central na regulação da angiogênese e é aumentada em lesões CRPC metastático [21]. Além disso, elevados níveis plasmáticos e urinários de VEGF está associado a um mau prognóstico em CaP [22,23]. Portanto, VEGF de sinalização /VEGFR2 tem sido um alvo para novas terapias contra o câncer. A inibição da via VEGF reduziu o crescimento do tumor e vasculatura num modelo de cancro do ilhéu pancreático, embora este efeito não foi sustentada e tumores, eventualmente retornou [24]. Um ensaio clínico de bevacizumab, um anticorpo monoclonal anti-VEGF recombinante, combinada com quimioterapia mostraram aumento da sobrevivência livre de progressão em comparação com placebo mais quimioterapia. No entanto, esta combinação de tratamento não melhorou significativamente a sobrevida global em comparação com o braço de controle [25]. As respostas limitados e resistência adquirida para a terapia anti-VEGF sugerem que, embora a angiogénese através de VEGF é um importante alvo para terapias do cancro, o desenvolvimento de novos medicamentos bem sucedida requer uma compreensão mais profunda dos factores que facilitam a fuga da terapia anti-angiogénica e permitir a manutenção a sobrevivência do tumor e vascularização. Com isto em mente, aumentos na actividade de MET foram detectados em resposta à terapia anti-angiogénica e hipoxia [26,27]. A administração continuada de sunitinib o inibidor de VEGF aumento da expressão de HGF em um modelo de tumor de murino, e sunitinib foi ineficaz quando o HGF foi co-administrado [28,29]. Além disso, o VEGF tem sido mostrado para activar directamente a sinalização através de TEM neuropilina-1 em CaP independente de HGF [11]. Estes resultados demonstram uma ação sinérgica entre as vias de sinalização de VEGF e MET e sugerem que uma terapia alvo ambas as vias, tais como CABOZANTINIB, pode ser altamente relevante em CaP avançado.

Nosso objetivo foi determinar os níveis de alvos primários do CABOZANTINIB expressão em CaP avançado e avaliar seus efeitos sobre tumores CaP subcutâneos e aqueles que crescem no osso, especificamente no que diz respeito à carga tumoral e remodelação óssea. Os nossos resultados mostram que os alvos de CABOZANTINIB são expressos em metástases APC e que CABOZANTINIB inibe o crescimento tumoral no osso e tecidos moles e exibe efeitos benéficos sobre o osso em ambos os ratinhos machos intactos e castrados.

Materiais e Métodos

Todos os tecidos humanos foram obtidos de pacientes que assinaram consentimento informado por escrito e mediante Universidade de aprovação Washington IRB. Todos os estudos com animais descritos neste manuscrito foram aprovados pelo e realizado de acordo com a Universidade de Washington Animal Care Institucional e as diretrizes de uso das Comissões e do NIH.

imuno-histoquímica (IHQ)

Tissue microarrays (TMA) foram utilizados para determinar o TEM, P-MET, e VEGFR2 imunorreatividade na próstata normal (NP) e PCA: 1) UWTMA48: NP e hiperplasia benigna da próstata (60 tecidos, dois núcleos por tecido) e PCA primário (61 tecidos, dois núcleos por tecido); 2) UWTMA52: correspondido NP e PCA de pacientes recorrentes e não-recorrentes (63 recorrente e 64 pacientes não-recorrentes, dois núcleos para cada NP e PCA); 3) UWTMA21: CaP metástases de 44 pacientes (metástases ósseas 40; metástases hepáticas 19; 27 metástases LN; e 7 outras metástases de tecidos moles, dois núcleos por tecido); e 4) UWTMA48: 24 LuCaP CaP modelos de xenoenxerto de animais tratados com docetaxel, intactos e castrados (três núcleos por tecido). O IHC foi realizada utilizando procedimentos padrão com recuperação de antigénios [30]. Um rato monoclonal anti-MET anticorpo (oferta do Dr. Knudsen [31]), um (Cell Signaling, Boston, MA), anticorpo anti-P-MET monoclonal de coelho e um anticorpo policlonal de coelho anti-VEGFR2 anticorpo (Cell Signaling, 55B11, Boston, MA) foram usadas. imunomarcação específica foi avaliada por um patologista (XZ), utilizando uma escala de três pontos: 2 = intensa, 1 = fraco, e 0 = ausente, e a percentagem de células em cada intensidade foi estimada.

A análise estatística dos IHC

Para cada núcleo em cada TMA, um índice de coloração foi construído como uma combinação ponderada das intensidades de coloração de 3 pontos, com pesos dados pela percentagem de coloração de tecidos a cada intensidade; consulte Métodos de S1. O índice de coloração é calculado um valor no intervalo [0, 1], em que 1 significa 100% de células coradas intensamente. modelos lineares estavam aptos para o índice de coloração condicional sobre a localização de metástases com efeitos aleatórios para cada paciente ou animal. Após a avaliação de hipóteses de modelagem e transformação de dados, conforme necessário, os modelos ajustados foram usadas para quantificar as diferenças na imunorreatividade entre os locais metastáticos e testar a significância estatística. perfis gráfica que ilustra as distribuições de intensidade de coloração foram construídos por meio do cálculo médias simples em todas as secções não ausentes em cada uma das categorias de coloração. As associações entre a expressão de proteínas e parâmetros clínicos foram avaliados utilizando modelos de regressão linear, e associações com tempo de recorrência PSA foram avaliados utilizando modelos de fragilidade (efeitos aleatórios Cox riscos proporcionais).

As linhas celulares

células C4-2B (Urocor, Inc., Oklahoma City, OK) e células MC3T3 (ATCC, Manassas, VA) foram mantidas em condições de cultura de tecidos convencionais. C4-2B células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e soro fetal de bovino 10% (FBS), e as células MC3T3 foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS. O LuCaP 23,1 CaP xenoenxerto foi mantido e passados ​​em série em ratinhos SCID CB17 [32]

Os estudos em animais

Estudo 1:.. Intratibial LuCaP 23,1, 60 mg /kg CABOZANTINIB

ratinhos intactos de seis semanas de idade do sexo masculino bege SCID (Charles River, Wilmington, MA) foram injectados com uma suspensão de célula única LuCaP 23.1 na tíbia proximal direito, tal como publicado anteriormente [33]. 200.000 células LuCaP 23.1 foram injectadas em 20 ul de meio RPMI 1640 na região proximal da tíbia direita. Os animais foram distribuídos aleatoriamente por um grupo de controlo (n = 5) ou CABOZANTINIB grupo (n = 5) quando os níveis de PSA no soro atingiram níveis detectáveis ​​(0,6 ng /mL, o ensaio de PSA total AxSYM, Abbott Laboratories, Abbot Park, IL). CABOZANTINIB foi dissolvido em H

2O e administrados por sonda oral a 60 mg /kg, cinco vezes por semana durante seis semanas. Os animais de controlo receberam gavage com H

única 2O. PSA níveis séricos e peso corporal foram medidos semanalmente. Após o sacrifício, as tíbias tumored e tíbias contralateral normal foram coletadas e processadas para análises

Estudo 2:.. Intratibial C4-2B, 60 mg /kg CABOZANTINIB

O desenho do estudo foi o mesmo que para estudo 1, excepto que os animais foram castrados e C4-2B células foram injectadas em tíbias duas semanas pós-castração [34]. C4-2B células foram colhidas quando ~ 50% confluentes, e 200.000 células foram injectadas em cada tíbia. Os animais foram distribuídos aleatoriamente por um grupo de controlo (n = 11) ou um grupo CABOZANTINIB (n = 10).

Estudo 3: C4-2B Subcutânea, 60 mg /kg CABOZANTINIB

C4-2B. (2×10

6, 1: 1 com Matrigel), as células foram injetadas por via subcutânea em ratos macho castrado . Os animais foram distribuídos aleatoriamente por um grupo de controlo (n = 8) ou um grupo CABOZANTINIB (n = 12), quando o volume do tumor atingiu 100 mm

3. 60 mg /kg CABOZANTINIB foi administrado por sonda oral cinco vezes por semana durante até nove semanas. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram 1,000 milímetros

3 ou quando os animais foram comprometidos.

Estudo 4:. Intratibial LuCaP 23,1, 30 mg /kg CABOZANTINIB

O desenho do estudo foi a mesma que no estudo 1, excepto que uma dose mais baixa de CABOZANTINIB (30 mg /kg) foi utilizado e do tratamento durou até 15 semanas. Os animais foram distribuídos aleatoriamente por um grupo de controlo (n = 10) ou um grupo CABOZANTINIB (n = 10).

Micro-CT

A 40 μCT digitalizador de alta resolução Scanco vivaCT foi utilizado para analisar uma secção de 0,85 milímetros que mede a metáfise da tíbia proximal da tíbia contralateral tumored e não-tumored (LuCaP 23.1: n = 3-5; C4-2B: n = 5-10 por grupo). volume ósseo (BV), volume de tecido (TV), a separação trabecular (Tb.Sp), espessura trabecular (Tb.Th), e número trabecular (Tb.N) foram determinados eo BV /TV foi calculado. analisa

Estatístico de estudos com animais

medições do tumor longitudinais e os níveis séricos de PSA foram log-transformados e modelado por meio de modelos lineares mistos condicional no grupo de tratamento com efeitos aleatórios para cada animal; consulte Métodos de S1. Após uma avaliação de diagnóstico padrão de ajuste do modelo, simulamos 1000 conjuntos de dados de cada modelo enquadrados fi, calculada a média empírica e limites de confiança de 95% em cada ponto de tempo, e re fi t modelos para esses conjuntos de dados. Os resultados finais representam médias e 95% de limites cia con fi de 1000 réplicas de bootstrap. Seguindo verificações padrão de suposições do modelo, duas faces t-testes foram aplicados para testar as diferenças de PSA no soro, o volume do tumor, peso corporal e níveis de índices de coloração IHC. A significância estatística das diferenças nos parâmetros ósseos foi determinada utilizando um teste t de duas faces.

análise de RT-PCR

extracção de ARN, síntese de ADNc, e qPCR foram realizadas como descrito anteriormente [ ,,,0],35]. Os iniciadores e as condições de recozimento estão listados na Tabela S1. O ARN foi extraído a partir de tumores subcutâneos. A expressão relativa das mensagens alvo foi determinada com base na diluição de quatro vezes dos cDNAs de calibrador. Usamos cDNA LNCaP para RET; PC-3 cDNA para MET, AXL e KIT, e LuCaP 23,1 cDNA para VEGFR2 murino (VEGFR2m). sinais específicos foram normalizados para níveis RPL13a.

In vitro experimentos

Foram avaliados os efeitos da CABOZANTINIB sobre a proliferação, a mineralização, atividade de fosfatase alcalina (ALP), e AR atividade transcricional

in vitro

como descrito anteriormente [36]; consulte Métodos de S1.

Resultados

Os níveis de MET, P-MET e VEGFR2 durante CaP progressão

Para resolver se as metas CABOZANTINIB são expressos em APC, foram avaliados os níveis de MET, P-MET, e VEGFR2 em tecidos que representam próstata normal e diferentes fases de progressão CaP.

NP vs CaP primária

MET e P-MET:. Nossos resultados mostraram que o TEM está presente em níveis elevados no NP e as células CaP primárias, mas só havia evidência marginal de diferenças entre estes tecidos (média índice de coloração NP: 0,96, 95% CI 0,93-0,98; PCA: 0,92, 95% CI 0,88-0,96, P = 0,06); veja a Figura S1. Apesar dos altos níveis de MET em NP e PCA, imuno mínima de P-MET foi detectada nestes tecidos, e não havia nenhuma evidência de diferenças entre estes tecidos (média coloração índice NP: CI 0,16, 95% ,00-,32; PCA: IC de 95% 0,00-0,27;; 0,11 P = 0,49); veja a Figura S1. Não havia nenhuma evidência de que o TEM ou P-MET imunorreatividade foi associado com risco de recorrência bioquímica após o controle para idade, soma Gleason, e volume do tumor

VEGFR2:. Normal células epiteliais da próstata e células CaP ambos exibindo baixa imuno VEGFR2 , e não havia evidência marginal de maior VEGFR2 em CaP vs NP (média índice de coloração NP: 0,03, 95% CI 0,00-0,05; PCA: 0,07, 95% CI 0,03-0,11, P = 0,02); veja a Figura S1. forte coloração estava presente no estroma e a vasculatura de ambas as NP e PCA. Semelhante ao MET, não havia nenhuma evidência de que a expressão VEGFR2 foi associado com risco de recorrência PSA após o controle para idade, soma Gleason, e volume do tumor.

CaP primária vs metástases.

Por causa dos aumentos relatados de MET em metástases CaP [12], nos propusemos a avaliar se este aumento pode ser detectada em tecidos do nosso grupo de pacientes. Para esta comparação, foram utilizados os resultados de metástases no TMA 21 e os resultados combinados dos tecidos CaP de UWTMA48 e UWTMA52 (127 pacientes). MET foi detectado em metástases APC com uma evidência muito forte de maior coloração imuno em metástases ósseas (BM) em comparação com CaP primária (média coloração índice primário PCA: 0,83, 95% CI 0,82-0,87; BM: 0,94, 95% CI 0,89-0,98 ; P = 0,0002); veja a Figura 1. Em contraste, os níveis de MET foram significativamente menores em todas as metástases dos tecidos moles em comparação com CaP primária (média coloração índice de fígado: 0,70, 95% CI 0,62-0,77, P 0,0001; LN: 0,78, 95% CI 0,71-0,83 , P 0,0001; outro macia:. 0,79, IC de 95% 0,67-0,93, P = 0,01)

IHC e as análises foram realizadas tal como descrito na secção de Métodos. perfis gráficos que ilustram as distribuições de intensidade de coloração foram construídos por meio do cálculo médias simples em todas as seções não ausentes em cada categoria coloração. Em cada local, o índice de coloração média é marcada por um círculo laranja preenchido e barras de laranja representam 95% CIs. Exemplos representativos de coloração são mostrados para cada proteína. A. MET é fortemente expresso tanto em CaP primário e metastático, embora seja aumentada de forma significativa na BM e diminuiu em metástases de tecidos moles comparada CaP primária. níveis B. P-MET são mais elevados em BM, LN e outras metástases de tecidos moles, enquanto nenhuma alteração foi detectada em metástases hepáticas quando comparado com CaP primário. expressão C. VEGFR2 é aumentado significativamente entre lesões metastáticas CaP em comparação com CaP primário. As imagens foram tiradas em 400 x ampliação

P-MET foi detectado em CaP metástases com forte evidência de maior imunorreatividade na BM comparação com CaP primária (média coloração índice primário PCA:. 0,22, 95% CI 0,17 -0.26; BM: CI 0,37, 95% 0,30-0,45; P = 0,003); Veja a figura 1. níveis P-Met também foram maiores em todas as metástases dos tecidos moles em comparação com CaP primários, apesar de nem todas as diferenças foram significativas (média coloração do fígado índice: 0,28, 95% CI 0,13-0,38, P = 0,35; LN: 0,46, 95% CI 0,35-0,56, P = 0,0001; outra macia:. 0,51, 95% CI ,27-0,70, P = 0,006)

VEGFR2 foi detectado em CaP metástases com uma evidência muito forte de maior imunorreatividade na BM comparação para CaP primária (média coloração índice primário PCA: 0,10, 95% CI 0,07-0,14; BM: 0,25, 95% CI 0,19-0,31, P = 0,0001); veja a Figura 1. Os níveis de VEGFR2 também foram maiores em todas as metástases dos tecidos moles em comparação com CaP primários, apesar de nem todas as diferenças foram significativas (média coloração do fígado índice: 0,29, 95% CI 0,17-0,38, P = 0,0005; LN: 0,40, 95% CI 0,29-0,46, P 0,0001; outra suave: CI 0,19, 95% 0,04-0,38, P = 0,28)

metástases CaP

Uma vez que o microambiente influencia a expressão do gene.. perfis de células tumorais, também analisaram os níveis de expressão de MET por local metastático. Os níveis de MET foram significativamente maiores no BM, em comparação com o fígado, LN e outras metástases tecidos moles (média coloração índice BM: 0,94, 95% CI 0,91-0,98; significa coloração do fígado índice: 0,59, 95% CI ,52-,66, P 0,0001; LN: 0,67, 95% CI 0,61-0,73, P 0,0001; outra macia:. 0,68, 95% CI 0,57-0,83, P 0,0001)

Os níveis de P-MET eram fracamente ou não significativamente diferente no BE em comparação com o fígado, LN e outras metástases tecidos moles (média coloração índice BM: 0,37, 95% CI 0,32-0,44; hepática: 0,28, 95% CI 0,13-0,36, P = 0,10; LN : 0,46, 95% CI 0,34-0,53, P = 0,05; suave outro: 51%, 95% CI 0,27-0,69); ver a Figura 1. No entanto, devido ao diferente processamento do BM e metástases de tecidos moles (BM requer processamento descalcificação) e baixa estabilidade de fosforilação sob condições ácidas, os níveis reais de P-MET pode, na verdade, ser maior do que na BM nossos dados indicam.

Os níveis de VEGFR2 foram significativamente diferentes nos BM em comparação com metástases LN (média coloração índice BM: CI 0,25, 95% 0,21-0,31; LN: 0,40, 95% CI 0,30-0,45, P 0,0001), mas não o fígado ou outros tecidos moles metástases.

As associações entre o MET, P-MET, e índice de coloração VEGFR2 e AR, PSA e PSMA.

Crosstalk entre AR, MET e sinalização VEGFR2 foi relatada em CRPC (13,14 ). Portanto, avaliamos a associação entre MET, P-MET e coloração VEGFR2 (determinado neste estudo) e AR, PSA, e coloração PSMA (a partir de dados históricos) em metástases. A nossa análise, que foi baseado em um modelo misto linear (ver Métodos S1), não detectou quaisquer associações significativas entre qualquer um dos pares das proteínas seleccionadas em BM ou metástases de tecidos moles (dados não mostrados).

alvos CABOZANTINIB em xenoenxertos CaP

qPCR.

Para determinar a expressão de alvos CABOZANTINIB selecionados no APC, que avaliaram os níveis de MET, VEGFR2 murino, AXL, KIT, e mRNA RET em 24 diferentes xenotransplantes LuCaP CaP que modelar de perto a heterogeneidade dos APC nos seres humanos [37]. Nossos resultados qPCR mostram que todos os alvos CABOZANTINIB são expressos nestes modelos em diferentes níveis; veja a Figura S2A. Estratificar os modelos para neuroendócrinos tumores (NE) e adenocarcinoma (AD) revelou alta evidência de níveis mais elevados de todos os alvos em modelos NE LuCaP a moderada (n = 4), em comparação com modelos AD (n = 20) Ver Figura S2B. Desde crosstalk entre AR, MET, e sinalização VEGFR2 foi relatado, nós também examinou se a expressão de alvos CABOZANTINIB se correlaciona com a expressão AR ou respostas a castração. Para este fim, foram classificados como xenoenxertos “altamente sensível à castração” se castração resultou em um benefício de sobrevivência mais de 3 vezes. Nossas análises não revelaram associações significativas entre os níveis de AR e as metas CABOZANTINIB. Além disso, enquanto os níveis médios de mRNA de alvos CABOZANTINIB foram maiores nos modelos que não respondem bem à castração, essas diferenças não atingiram significância.

IHC.

Para obter uma melhor compreensão da CABOZANTINIB de efeitos potenciais em pacientes com CRPC avançada que estão em TDA e /ou tratadas com docetaxel, foram examinados os níveis de Met, P-MET, e em tumores de VEGFR2 LuCaP de animais intactos, castrados, e tratados com docetaxel. Nossas análises mostram evidência moderada de que os níveis de expressão de MET e P-MET são negativamente correlacionados em todos os tipos de tumor (R = 0,29; P = 0,02), e as provas marginal que a média MET e P-Met índices de coloração são de 5-6% maior em tumores após tratamento com docetaxel do que nos tumores de animais intactos (p = 0,08 e p = 0,05, respectivamente). Nossas análises não revelaram qualquer evidência de que os níveis de expressão de qualquer outro par de proteínas são correlacionados em ou dentro de tipos de tumor (todos P 0,14), que significa índices de coloração conheceu e P-MET são diferentes entre os tumores colhidos de intacta e castrar animais, ou que significa índices de coloração conheceu e P-Met diferiu significativamente entre os xenotransplantes LuCaP que exibem uma resposta de alta e baixa à castração; veja a Figura S2C. VEGFR2 não apresentaram qualquer imunorreactividade significativa nas células tumorais em nossos modelos.

pré-clínica Eficácia Estudos

Para aumentar a nossa compreensão dos efeitos do CABOZANTINIB em metástases ósseas APC, examinamos os seus efeitos sobre PSA, peso corporal e remodelação óssea em modelos de crescimento CaP no osso. Do mesmo modo, avaliou-se alterações no PSA do soro, o volume do tumor e peso corporal em resposta ao tratamento em animais portadores de tumores subcutâneos.

CABOZANTINIB inibe o crescimento tumoral no osso.

Para avaliar a eficácia da CABOZANTINIB no crescimento dos APC nos ossos, nós tratados intacto ou castrar animais tendo intratibial LuCaP 23.1 ou tumores C4-2B, respectivamente. Nós selecionamos esses dois modelos, porque LuCaP 23,1 provoca uma reacção osteoblástica pronunciado e C4-2B provoca uma resposta osteoblástica /osteolítico mista. Além disso, LuCaP 23,1 representa CaP sensível ao andrógeno enquanto C4-2B representa doença resistente à castração. Nossos resultados mostram que qPCR MET, VEGFR2m, KIT, RET e AXL são expressos em LuCaP 23.1. Em tumores C4-2B detectamos VEGFR2m, Axl e RET, níveis muito baixos de Met e nenhum sinal para Kit (os resultados são mostrados na Figura 2A). A expressão destes receptores em LuCaP 23,1 e C4-2B tumores suportam a hipótese de que CABOZANTINIB irá alterar a biologia destes tumores. CABOZANTINIB (60 mg /kg) inibiu o crescimento de ambos os tumores nos ossos tal como demonstrado pela diminuição nos níveis de PSA no soro; veja a Figura 2B. mudanças semanais no PSA sérico foram significativamente diferentes entre os grupos controle e CABOZANTINIB no modelo LuCaP 23,1 (P 0,0001), onde PSA aumentou 76% por semana no grupo controle, mas por 0,2% por semana no grupo CABOZANTINIB. mudanças de PSA também foram significativamente diferentes entre os grupos controle e CABOZANTINIB no modelo C4-2B (P = 0,0066), onde PSA aumentou em 35% por semana no grupo de controlo, mas diminuíram 2,9% por semana no grupo CABOZANTINIB. CABOZANTINIB também inibiu a proliferação das restantes células viáveis ​​em tumores com base na coloração BrdU; veja a Figura 2C. A inibição da progressão do tumor também foi perceptível quando avaliamos AR e PSA imunorreatividade; LuCaP 23,1 e C4-2B tumores de animais tratados com CABOZANTINIB mostrou menos intensa coloração AR e PSA nas células de tumor remanescentes, bem como grandes áreas necróticas; veja a Figura 2D células de E. C4-2B expressam níveis baixos de PSA, como visto na Figura 2B, e que também se reflecte em muito menor imunorreactividade PSA nestas células de tumor.

A. Os níveis de receptores CABOZANTINIB em LuCaP 23,1 e tumores subcutâneos C4-2B. qPCR foi usado em ARN isolado a partir de tumores subcutâneos para determinar os níveis de Met, VEGFR2m, AXL, RET e kit de expressão. Para calibrar o sinal que usamos diluição quádrupla de LNCaP cDNA (RET), PC-3 cDNA (MET, AXL, KIT) e LuCaP 23,1 (VEGFR2m). A selecção do calibrador de ADNc baseou-se no sinal de cada mensagem específica. Sinal foi normalizado para RPL13a gene housekeeping. Nossos resultados indicam que LuCaP 23,1 tumores expressam todas as metas CABOZANTINIB e tumores C4-2B expressar VEGFR2m, AXL e RET, baixos níveis de MET, e nenhum KIT. Nestas experiências qPCR, medimos níveis relativos dos transcritos alvo e não os seus números reais, por conseguinte, que não pode comparar os níveis dos diferentes alvos de expressão para o outro, e comentar se RET, o que deu o sinal mais elevado, pode ser expressa em maior cópia número vs MET, e, portanto, é mais importante nesses modelos.

B. modelos lineares de show de crescimento PSA que CABOZANTINIB diminui os níveis de PSA em ambos os LuCaP 23.1 e resistente à castração modelos C4-2B sensível ao andrógeno. C. BrdU coloração das tíbias CABOZANTINIB mostra que diminui a proliferação das células tumorais sensíveis-androgénio e resistente à castração no osso, duas faces t-teste foi utilizado para determinar a significância das diferenças. D E. AR e PSA imunorreactividade está presente em tumores de controlo. CABOZANTINIB tratamento resultou em diminuições na imunorreactividade AR e PSA em ambos os modelos (LuCaP 23,1 (D) e C4-2B (E)). C4-2B células expressam níveis baixos de PSA em comparação com LuCaP 23,1, e a coloração é mais fraca nestes tumores. Além disso, grandes áreas de necrose de tumor estão presentes em tíbia tratada (marcado por asterics vermelhas). F. 60 mg /kg é bem tolerada CABOZANTINIB até 4 semanas de andrógeno-sensíveis LuCaP 23.1 animais. Após este período significativo BW diminui vs. controlo foram detectados (até 17%), mas devido a variação e o número de animais, estas reduções não atingiram significância. 60 mg /kg é bem tolerada CABOZANTINIB até 5 semanas no modelo C4-2B resistente à castração, com um decréscimo significativo de 12% na semana 6. A significância foi determinada por comparação de inscrição para BW BW em cada semana, utilizando 2-t- lados teste. A média ± SEM dos grupos é traçado.

CABOZANTINIB altera a remodelação óssea no osso tumored.

Foi realizada uma análise detalhada dos efeitos do CABOZANTINIB sobre o microambiente ósseo /tumor por μCT. Temos escolhido este tipo de análise, em vez de análise de histomorfometria porque μCT avalia toda a tíbia em 3D enquanto histomorfometria análises são feitas geralmente em uma única seção distância longitudinal 2D da tíbia. A análise de osso trabecular mostrou que LuCaP 23.1 crescimento resulta em aumentos significativos no volume ósseo (tíbias tumored: 0,42 ± 0,06 (média ± SEM); tíbias normais: 0,09 ± 0,01; aumento de 5 vezes na BV /TV, P = 0,02) . Estes aumentos foram atenuadas por CABOZANTINIB, resultando numa diminuição de 52% no BV /TV, em comparação com o controlo LuCaP 23,1 tíbias. Esta redução foi refletida no número trabecular alterada (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), e separação trabecular (Tb.Sp); ver Tabela 1. Crescimento C4-2B no osso também resultou em evidência moderada de BV /TV aumenta (aumento de 40%, P = 0,06).

Informações de Apoio

Figura S1.