Abstract
Soricidin é um peptídeo ácido 54-amino encontrada no veneno paralisante do musaranho de cauda curta norte (
Blarina brevicauda
) e foi encontrado para inibir o potencial receptor transiente do tipo Vallinoid 6 (TRPV6) canais de cálcio. Relatamos que dois péptidos mais curtos, SOR-C13 e C27-SOR, derivadas a partir da extremidade C-terminal de soricidin, são antagonistas de alta afinidade de canais TRPV6 humanos que são regulados positivamente em um certo número de cancros. Relata-se métodos de imagem molecular que demonstram a
in vivo
potencial diagnóstico da SOR-C13 e SOR-C27 para atingir locais de tumor em ratinhos portadores de tumores do ovário ou próstata. Os nossos resultados sugerem que estes novos péptidos podem proporcionar uma via para fornecer reagentes de diagnóstico e terapêuticos directamente para tumores ricos em TRPV6 e, como tal, tem aplicações potenciais para uma série de carcinomas, incluindo os do ovário, da mama, da tiróide, da próstata e do cólon, bem como certa de leucemia e linfomas
Citation:. Bowen CV, Debay D, Ewart HS, Gallant P, Gormley S, Ilenchuk TT, et al. (2013)
In Vivo
Detecção de TRPV6-ricos tumores humanos com Anti-Cancer peptídeos derivados de Soricidin. PLoS ONE 8 (3): e58866. doi: 10.1371 /journal.pone.0058866
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 02 de novembro de 2012; Aceito: 07 de fevereiro de 2013; Publicação: 15 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Bowen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa de Assistência industrial Research Conselho Nacional de Pesquisa de programa (IRAP) (https://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/irap/index.html) e Atlantic Canada Agência de Oportunidades (ACOA) (http: //www.acoa-apeca.gc.ca/eng/Pages/Home.aspx) do Governo do Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. SG, TTI, TL, CR e JMS são funcionários da Soricimed Biopharma Inc. No o tempo de realizar e interpretar os resultados, HSE era funcionário da NRC. Novaceutics Consulting tem nenhuma afiliação com Soricimed. JMS tem as seguintes patentes de declarar: US 7119168 para os péptidos e métodos de tratamento de cancro, concedida em 10 de outubro de 2006; US 7273850 para métodos de inibição da absorção de cálcio por uma célula de cancro para reduzir a proliferação celular através da administração de todo ou parte do péptido e os métodos de tratamento de cancro em que as células cancerosas apresentam aumento da expressão de TRPV6, concedida em 25 de setembro de 2007; e US 8.211.857 para os créditos dirigidos a um péptido consistindo SOR-C13 ou SOR-C27, para tratamento de câncer emitiu 03 de julho de 2012. JMS também declara patentes pendentes emitidas em: US 13 /526.045 para uma continuação da US 12 /866.397 (US emitido patente 8.211.857) para métodos de inibição da absorção de cálcio pelas células cancerosas para reduzir a proliferação e métodos de tratamento de câncer de células; Canadá (CA 2.718.949), Europa (UE 09.721.272,4), Japão (JP 2011-500019) e Hong Kong (11.106.921,8) para aplicação PCT a fase nacional voltada para péptido consistindo SOR-C13 e SOR-C27; Canadá 2544467 para as composições farmacêuticas de péptidos e dirigido tratamentos médicos; US 12 /824.935 para os péptidos de ligação a TRPV6 compreendendo a totalidade ou parte de SOR-C27 conjugado com uma biomolécula. JMS declara pedidos PCT em fase de nação no Canadá (CA 2.766.272), Europa (UE 10.791.109,1), Hong Kong (número de série 12.110.289,5), Japão (JP 2012-516450), México (MX /a /2012/000086) e Brasil (PI1012676 -9). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
América do Norte, 1 em cada 70 mulheres irá desenvolver câncer de ovário dentro de sua vida. Apesar dos avanços recentes com identificação, cancro do ovário ainda permanece difícil de detectar e é tipicamente identificada apenas depois de ter metastizado para outras partes do corpo [1]. O prognóstico para a detecção fase inicial está entre 70% e as taxas de sobrevivência de 100%; No entanto, 70% dos casos são diagnosticados em estágios avançados, onde a taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas entre 15% e 25% [2]. Atualmente, não existe teste de detecção não invasiva confiável para o câncer de ovário.
As concentrações de cálcio são cuidadosamente reguladas dentro de compartimentos celulares através da ação integrada de vários canais de membrana e bombas. Ao longo dos últimos anos alguns membros de uma família de canais de influxo de iões de cálcio, canais denominados TRPV, surgiram como biomarcadores de cancro potenciais que podem revelar-se útil para o desenvolvimento de uma melhor detecção de tumores e /ou terapia de drogas específicas. Em 1999, foram notificados novos canais de cálcio nos túbulos renais de coelho [3] e rato aparelho digestivo [4] denominado ECaC1 e cat1, respectivamente, que se assemelhava ao receptor capsaicina (receptor vanilóide, VR1) [5]. ECaC1, cat1, e VR1 acabou por estar relacionado com o canal de cálcio potencial de receptor transiente (TRP) em
Drosophila
que medeia fotorrecepção [6] – [8]. Até à data, pelo menos, 30 homólogos de canal TRP foram identificados em mamíferos, que são divididos em seis subfamílias principais: TRPA (anquirina), TRPC (canónica), TRPM (melastatin), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) e TRPV (vanilóide ) [9] – [11]. O TRPV sub-família é composta por seis membros nomeados TRPV1 para TRPV6. Os quatro primeiros canais estão intimamente relacionados e têm papéis em sensoriamento várias entradas incluindo estiramento, calor, acidez, estímulos nocivos (nocicepção) e dor [9], [11]. Estes canais de exposição relativamente baixos selectividades em ião de cálcio (P
Ca /P
Na ~ 1 a -15). Em contraste, TRPV5 e TRPV6 são altamente selectivo de iões cálcio (P
Ca /P
Na~100). Ambos estes canais estão expressos nas membranas apicais de vários tecidos, incluindo o rim, intestino, pâncreas e próstata [12] – [14]. Por exemplo, TRPV5 é expressa nos túbulos distais do rim onde funciona na reabsorção de ião de cálcio a partir da urina pré-[12]; TRPV6 é predominante no tracto gastrointestinal onde está envolvida na entrada apical de cálcio [14]
TRPV6 está implicada no desenvolvimento e progressão do tumor [15] -. [18]. A proteína TRPV6 é sobre-expressa em carcinomas de cancro do ovário e outros, tais como cancro da mama, do cólon, da próstata e da tiróide [14]. ARNm TRPV6 é elevada em várias linhas celulares tumorais, incluindo os de cólon, próstata e leucemia humana [19] – [23]. No câncer de próstata, os níveis de mRNA TRPV6 são positivamente correlacionados com a progressão do tumor e agressividade, como indicado pela pontuação de Gleason, estágio patológico e metástases extra-prostática [20], [24]. Na verdade, os tumores de próstata TRPV6-positivas têm prognóstico reservado devido a uma propensão a invadir os tecidos circundantes [25].
A ligação entre o crescimento do tumor e sobre-expressão de TRPV6 pode envolver a potenciação da proliferação celular dependente de cálcio e inibição de apoptose. Schwarz et al. [26] demonstraram que doses baixas de econazol, um bloqueador do influxo de cálcio capacitiva reduzida, ambos os sinais de influxo de cálcio e a proliferação celular em células HEK-293 transfectadas com TRPV6. Na linha celular de cancro da próstata LNCaP, a sobre-regulação de TRPV6 aumenta a proliferação e a sobrevivência celular, enquanto retardando a apoptose através de um mecanismo que parece envolver a activação do factor nuclear das células T activadas factor de transcrição (NFAT) [27]; redução da proliferação TRPV6 com ARNsi reduzida e aumento da apoptose. Em células de câncer de mama, o tamoxifeno reduz a expressão de TRPV6 e sinalização de cálcio, um efeito que pode explicar em parte os efeitos anti-câncer desse antagonista de estrogénio [28]. Além disso, knockdown de TRPV6 com ARNsi melhorou a eficácia do tamoxifeno. Assim, tal como sugerido em uma publicação recente, a inibição do canal TRPV6 oferece uma nova estratégia terapêutica para o tratamento de tumores que sobre-expressam o canal TRPV6 [29].
Soricidin (número de acesso P0C2P6) é um novo peptídeo paralítico isolado das glândulas salivares submaxilares do musaranho de cauda curta do norte (
Blarina brevicauda
; um dos mamíferos mais comuns na costa atlântica do Canadá) e, relatados para inibir a absorção de cálcio
via
canais TRPV6 [ ,,,0],30]. Subsequentemente, duas sequências de péptido a partir da extremidade C-terminal de soricidin (SOR-C13 e SOR-C27; Tabela 1), se ligam TRPV6 em células de cancro do ovário com uma afinidade elevada [31]. Aqui, nós descrevemos a propriedades de SOR-C13 e C27-SOR e a capacidade destes péptidos para atingir tumores do ovário humano num modelo de ratinho de xenoenxerto de ligação TRPV6. Conjugando os peptídeos com um corante fluorescente ou de um agente de contraste de imagem por ressonância magnética (MRI), fomos capazes de monitorizar a bio-acumulação e bio-distribuição dos peptídeos
in vivo
, tumores, em última análise imaging expressar TRPV6. Estas descobertas novas vias de diagnóstico e /ou terapêuticas abertas para a detecção e tratamento de tumores ovarianos e potencialmente outros tumores ricos em TRPV6 incluindo os de mama, cólon, próstata e tireóide precoce, assim como certas leucemias e linfomas.
Materiais e Métodos
Os péptidos
As sequências de soricidin, péptidos SOR-C13 e C27-SOR são mostrados na Tabela 1. Os péptidos foram preparados por CanPeptide (Montreal, Canadá ) por síntese em fase sólida. SOR-C13 e SOR-C27 mostrou a massa molecular esperado por espectrometria de massa de tempo-de-voo (M
+ H
+ de 1.566,42 e 2.958,02) com pureza de péptidos (por HPLC) de 96,9% e 96,8%, respectivamente . O teor de péptido do pó liofilizado branco (sal de trifluoroacetato) foi 83,5% e 65,2%. concentrações peptídicas subsequentes foram calculados com base no péptido livre-base.
Solução estrutura de RMN de SOR-C27
Preparação de Amostras.
ressonância magnética nuclear (RMN) espectroscopia de dados foi adquirida para determinar as características estruturais conformacionais do péptido SOR-C27 sob várias condições. Uma solução estoque (amostra # 1) de 10 mM de SOR-C27 foi preparado de 90/10 H
2O /D
2O com 50 mM de tampão de fosfato de potássio a pH 6,6. A partir da amostra # 1, foram preparadas três amostras adicionais: # 2) de solução concentrada com NaCl 200 mM, # 3) de solução concentrada com dodecylphosphocholine 100 mM (DPC) e # 4) solução estoque diluído para 2 mM com dodecilsulfato de sódio 100 mM (SDS ). Amostra # 1 foi adquirido a temperaturas na gama 274-308 K. O péptido era completamente solúvel em todas as soluções e sob todas as condições.
espectroscopia de RMN.
Para as amostras 1-3
conjuntos de dados de RMN de 1H foram obtidos num espectrómetro de DRX-500 (Bruker BioSpin AG, Fällanden, Suíça) operando a 500,13 MHz utilizando uma sonda de um milímetro OD H [CN]. Para a amostra 4,
1H (e indiretamente
13 C e
15N) conjuntos de dados de RMN foram coletados em um espectrômetro AVANCEIII 700 operando a 700,13 MHz usando um 1,71 mm de diâmetro externo HC [N] sonda.
desvios químicos foram referenciados ao 1H 2,2-dimetil-2-silapentane-5-sulfonato através da ressonância da água calibrado em cada temperatura.
13 C e
turnos 15N químicos foram indirectamente referenciado por meio do
referenciamento 1H.
Para a determinação estrutural com amostras 1 e 4, 2D sensível à fase
1H-
1H conjuntos de dados NOESY (120, 250 e 400 ms tempo de mistura) e
1H-
1H TOCSY (MLEV17; 120 ms tempo de mistura, a amostra 4 DIPSI-2; 90 ms de tempo de mistura) conjuntos de dados foram gravados com um pré -saturation ou um pulso suave para a supressão de água. conjuntos de dados foram coletados com resolução de 1024 × 380 pontos complexos, apodizada com um 70 ° deslocado função de janela sine-quadrado-bell em ambas as dimensões, o zero preenchido e linear previsto na dimensão indireta para dar um espectro 2D finais de 2048 × 2048 pontos reais.
Cálculos estruturais.
espectros de RMN foram analisados, e as posições de pico e volumes determinados utilizando Sparky 3.110 software operando em um sistema Linux PC. Para determinação estrutural, todos os sistemas de spin foram identificados através de desvios químicos e TOCSY característica padrões de pico cruzado. cadeia lateral e ossos de volta ressonâncias de Asn7, Thr9, Phe17 e Val23 foram prontamente atribuído a partir de seus padrões TOCSY únicas e cada resíduo ocorre apenas uma vez na sequência. A partir desses resíduos, as atribuições específicas para a sequência de backbone e da cadeia lateral ressonâncias foram determinadas usando métodos padrão,
ou seja
a partir dos resíduos prontamente atribuídos, resíduos adjacentes foram sequencialmente determinada seguindo o H
α
i
-H
N
i + 1 | e H
N
i
-H
N
i + 1
conexões NOESY. Uma vez que os resíduos adjacentes foram identificadas, ligações NOESY mais distância foram atribuídos. Para cálculos de estrutura de SOR-C27 em água tamponada, DPC e SDS micelas, restrições de distância foram determinados a partir da integração das cruzadas picos de 250 ms (amostra 4; 200 ms) espectro NOESY, e classificados em quatro grupos: forte, média , fraca e muito fraca correspondente a intervalos de distância inter-protões 2,3, 2,0-3,5, 3,3-5,0 e 4,8-6,0 Å, respectivamente
Todos os cálculos estruturais foram baseadas em estudos anteriores usando o XPLOR. 3.1 pacote de software. Resumidamente, uma bobina de estrutura inicial aleatória estendida foi usada para gerar um total de 50 estruturas incorporados. Os contatos próximos foram removidos por minimização de energia de 1000 passos do gradiente conjugado antes de prosseguir para o recozimento simulado dinâmica molecular restrita (MD) cálculos. Oito passos compreendendo um tempo total de simulação de 120 ps foram usadas para as simulações MD. Inicialmente, o sistema foi ajustado para 1500 K e todas as constantes de força para ligado, NOESY e interacções não ligadas foram dimensionadas para 10% dos seus valores completos. Após o terceiro passo, as constantes de força tinha sido linearmente dimensionado para os respectivos valores completos. Nos últimos cinco passos, a temperatura foi diminuída de modo uniforme a 300 K. estruturas calculadas foram então energia minimizada com 2000 passos de gradiente conjugado.
Difusão ordenada espectroscopia (DOSY) é capaz de determinar com precisão as constantes de difusão de moléculas em solução . dados DOSY foi adquirida para a amostra SOR-C27 /SDS. Os 3 peptídeos kDa SOR-C27 e os 80 micelas kDa SDS têm taxas de difusão semelhantes consistentes com a forte ligação do péptido às micelas de SDS.
Cultura de linhas celulares
transfecção e expressão excessiva de TRPV6 nas células de HEK-293.
HEK-293 humanas (células de 6-9 passagens) foram plaqueadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 5 x 10
5 culas por po, 24 horas antes da transfecção . Cada poço foi diluída em meio isento de soro e incubou-se durante 5 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lentamente combinadas e incubadas a temperatura ambiente. Após uma incubação de 20 minutos, as células foram expostas ao complexo transfecção consistindo de 0,5 mg de DNA PDI-gato-L plasmídeo (uma oferta do Dr. V. Flockerzi, Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität des Saarlandes [23]) e 1,5 ul de reagente Lipofectamine 2000. PDI-CAT-L é um vector de expressão bicistrónico contendo ADNc para a região de codificação da proteína de TRPV6 e o mutado proteína verde fluorescente (S65T; EGPF) separados por um local de expressão do ribossoma interno (promotor β-actina /KOZAK /TRPV6 /IRES /EGFP em pCAGGS) [23]. O IRES foi derivada a partir de vírus da encefalomiocardite [32]. A transfecção de células HEK-293 com o vector bicistrónico permite a produção simultânea de TRPV6 e EGFP e selecção de células fluorescentes produzem TRPV6 para as medições de electrofisiologia. A partir de investigações anteriores usando este plasmídeo e outros semelhantes plasmídeos, foi determinado que o canal TRPV6 é altamente expresso, localizada na superfície da membrana, glicosilado e constitutivamente activa dando origem a uma Ca
2 + -invoked para dentro corrente [33] – [35].
Cultura de linhas celulares de cancro.
Todos linhas celulares foram obtidas da Colecção americana Tipo celular e cultivadas nas condições recomendadas de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2. SKOV-3 (ATCC, HTB-77) é uma linha de células de tumor derivadas originalmente a partir do líquido ascítico de um indivíduo do sexo feminino com um tumor do ovário. Elas foram cultivadas em meio 5a de McCoy com soro bovino fetal a 10% (FBS). DU145 (ATCC, HTB-81) é uma linha celular de tumor derivada de uma lesão de cérebro de um sujeito do sexo masculino com cancro da próstata metastático. Elas foram cultivadas em Eagle Meio Essencial Mínimo (ATCC) suplementado com FBS inactivado por calor a 10%. SKOV-3 e DU145 são tumorigénico em CD de 1 ratos nus, formando adenocarcinomas do ovário e da próstata primários, respectivamente.
eletrofisiologia TRPV6.
remendo de célula inteira gravações de fixação foram realizados em HEK-293 células que expressam TRPV6 e EGFP. As células transfectadas foram prontamente identificadas a partir de células não transf ectadas usando um microscópio fluorescente Axiovert 135 (Olympus). As gravações foram realizados utilizando um amplificador Axopatch 1D controlada e monitorizada utilizando o software pClamp 9 (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Os conjuntos de dados foram digitalizados a 20 kHz e filtrados a 2 kHz. Remendo pipetas foram puxados a partir de vidro de borosilicato usando um extractor de P-80C pipeta (Sutter Instrument, San Rafael, CA, EUA), e tinha uma resistência de 2-4 MQ quando preenchidos com a solução da pipeta contendo: 145 mM de césio-metano-sulfonato, NaCl 8 mM, MgCl 1 mM de
2, CaCl 3,64 mM
2, 10 mM de HEPES e 10 mM de EGTA (para tamponar o Ca intracelular
2+) com o pH foi ajustado para 7,2 utilizando CsOH. A solução extracelular continha: NaCl a 145 mM, CsCl 10 mM, CaCl 10 mM
2, 2 mM MgCl
2, KCl 2,8 mM, HEPES 10 mM e glucose 10 mM com o pH ajustado para 7,2 utilizando NaOH
para isolar correntes TRPV6, HEK-293 e as células HEK-293 transfectadas foram tensão fixada em 50 mV, com uma rampa linear 50 ms tensão (-110 mV a 90 mV) protocolo aplicado, na presença ou ausência de um inibidor TRPV6, La
3+ íons (10 �), SOR-C27, SOR-C13 ou SOR-C27-Cy5.5. Embora o La
3+ ião é um inibidor não-específico não existe actualmente nenhum inibidor selectivo conhecido do canal TRPV6. A rampa foi em média mais de 10 vezes em intervalos de 2 s entre rampas.
A análise foi realizada off-line usando IGOR (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR, EUA) software. A significância estatística foi determinada com o teste t de Estudantes emparelhados (bicaudal). Todos os valores são expressos em média ± SEM com um
p
-valor de .. 0,05 considerado significativo
Os estudos de imagem
Produção de tumores para estudos de imagem
Semelhante a inquéritos anteriores, ratinhos CD-1 nu (6-8 semanas de idade, Charles River) foram utilizados para a marcação fluorescente (ratos machos) e estudos de MRI (ratos fêmeas) [36], [37]. Os ratinhos foram alojados em gaiolas em grupos de 3-5, e mantidos num 12 horas luz programação /escuro a 22 ° C e humidade relativa de 50 ± 5%. alimentos esterilizados e água livremente disponíveis. implantação do tumor subcutâneo foi realizada em ratos sob anestesia isoflurano luz. SKOV-3 ou DU145 (6 × 10
6 células /50 ul de diluição de Matrigel 1:01 em solução salina) foram implantadas no flanco esquerdo dos ratinhos utilizados no estudo de fluorescência, enquanto 1 × 10
7 SKOV-3 as células foram injectadas em ratinhos utilizados no estudo de ressonância magnética. O tamanho dos tumores, calculado usando a fórmula de comprimento x largura
2/2, foi monitorizado com calibradores. Ao longo de um período de 6 semanas, os tumores cresceram até um tamanho máximo de 300 mm
3. Esta investigação foi realizada em conformidade rigorosa e cumprimento Canadian Council on Animal Care. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Cuidados com Animais da Universidade de Dalhousie (protocolo nº 09-047). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia adequada e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Preparação de SOR-C27-Cy5.5 de Estudos fluorescentes.
SOR-C27 (6,64 × 10
-4 mmole) foi derivatizada no único grupo tiol Cys14 por reacção com um excesso de 25% do derivado de maleimida de Cy5.5 (8,86 × 10
-4 mmol; GE Healthcare Amersham) de acordo com as instruções fornecidas. O péptido etiquetado foi separado de componentes que não reagiram, utilizando uma coluna G-25 Sephadex exclusão de tamanho (20 x 1,5 cm). As fracções contendo o péptido com etiquetas foram liofilizadas e a pureza confirmada por HPLC.
Desde SOR-C13 não contém um único sítio de conjugação original, o acoplamento do péptido a um éster Cy5.5-NBS (GE Healthcare Life Sciences. Baie d’Urfe, QC) resultou numa mistura de péptidos marcados por meio de Lys1 e Lis8. Consequentemente, os resultados de ligação e fluorescentes podem ser distorcidas e
In vivo
investigações foram realizadas.
Preparação e caracterização de SPIO- (SOR-C27)
x para estudos Assim, apenas preliminares de ressonância magnética .
Monitorização biodistribuição por MRI depende de um agente de contraste tal como o óxido de ferro super-paramagnéticas (SPIO grânulos) para ser quimicamente ligado ao composto de interesse SOR-C27 (C13-SOR não foi utilizado dado que não fez contém um único local de conjugação singular). grânulos SPIO funcionalizados com grupos maleimida (MicroMod 77-96-201) foram utilizados sem purificação adicional. grânulos foram feitos reagir com um excesso de 5 vezes molar de tamponada preparada de fresco e SOR-C27 (1 mM, 50 mM de PBS, pH 7,2) durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura foi diluída com 50% de metanol e centrifugou-se a 400 rcf até que o sobrenadante tinha uma cor ligeiramente vermelha proporcionando uma pelete de contas SPIO SOR-C27 funcionalizados. O sedimento SPIO-péptido foi lavada e re-suspensas em PBS estéril de Dulbecco (DPBS) a uma concentração de 2,5 mg Fe /ml para injecção em ratinhos. Para o controlo, grânulos SPIO foram preparados por reacção dos grânulos funcionalizado com maleimida com cisteína uma solução preparada de fresco utilizando um protocolo equivalente. Os blocos de cisteína grupos maleimida sobre as contas tornando-os não-reativo.
O número de peptídeos SOR-C27 per talão foi determinada por quantitativa
análise 1H NMR do sobrenadante para determinar o número de péptidos não reagiram moléculas. Em média 75 moléculas SOR-C27 foram conjugados com cada partícula SPIO. Conjugação do péptido às esferas foi verificada por digestão de tripsina da suspensão de esferas e análise dos fragmentos de péptido libertado por espectrometria de massa. Após a digestão e remoção das esferas por centrifugação, o sobrenadante resultante continha dois fragmentos peptídicos com sequências consistentes com a clivagem do péptido SOR-C27.
Fluorescent imagem set-up e coleta de dados.
Todos os experimentos com imagens ópticas foram realizadas utilizando um pequeno animal no domínio do tempo explorar Optix MX2 imager pré-clínica, e as imagens foram analisadas ou reconstituídas como mapas de concentração de fluorescência usando a arte Optix Optiview software de análise 2.0 (Tecnologias avançadas de pesquisa, Montreal, QC). A 670-nm diodo laser pulsado a uma frequência de repetição de 80 MHz e uma resolução de tempo de pulso de luz 12 ps foi usado para a excitação. A emissão de fluorescência a 700 nm foi recolhido por um sistema de contagem de fotão único correlacionados em tempo altamente sensível e detectada através de um tubo fotomultiplicador rápido. Os dados foram registrados como funções de ponto-propagação temporais (TPSF). Para geração de imagens, os ratos anestesiados isofluorano foram posicionados em um palco animais dentro de uma câmara que permitiu a manutenção da anestesia gasosa.
Depois de tumores atingiram um volume de -300 mm
3, SOR-C27-Cy5.5 (100 ug) foi injectada por via intraperitoneal (IP) em (SKOV-3) ratinhos TRPV6-positiva do tumor de xenoenxerto de rolamento, e opticamente fotografada em intervalos de tempo múltiplos (0,5, 1, 2, 4 e 24 horas pós-injecção). Para estudos de competição, péptido não marcado SOR-C27 (10 mg) foi injectado 10 minutos antes da injecção de Cy5.5 tag SOR-C27 (100 ug). No final da imagem, os animais foram sacrificados sob anestesia profunda por perfusão intracardíaca com solução salina. Os órgãos e tumores foram retirados e digitalizados
ex vivo
com o imager óptica.
processamento de imagem fluorescente e análise.
software de análise de ART Optix Optiview foi utilizado para estimar a fluorescência taxa de decaimento. O software de-convoluto a curva de decaimento a tempo de intensidade fluorescente medida utilizando o algoritmo de Levenberg-Marquardt, o qual aplica um algoritmo de mínimos quadrados não linear de minimização para calcular os coeficientes de expansão de multi-exponencial do decaimento da fluorescência. Um dois-expoente adaptação foi utilizado, e longa (τ
1) e curtos (τ
2) componentes de fluorescência ao longo da vida, em conjunto com o seu valor médio ponderado (τ
AV), foram calculados automaticamente de acordo com a seguinte equação:
onde a
1 representa a amplitude da primeira fluorescência exponencial e a
2 representa a amplitude da segunda fluorescência exponencial
imagiologia por ressonância magnética metodologia
Todos os exames de ressonância magnética foram realizados em uma cabeça clínica MR scanner de Magnex científica 3 Tesla (Oxford, Reino Unido) adaptados para geração de imagens de pequenos animais, utilizando uma bobina de gradiente Magnex Científica (diâmetro interno de 21 cm; a força máxima inclinação operacional de 200 mT /m) em interface com um espectrómetro Varian Inc. Direct drive (Palo Alto, CA). A ID 25 milímetros bobina de quadratura RF ‘Litzcage’ (Doty Scientific, Columbia, SC), ajustado para 128,8 MHz, foi usado como um transmissor /receptor de bobina de volume para geração de imagens.
In vivo
imagens foram obtidas utilizando um verdadeiro-FISP 3D (/T1 ponderado T2) sequência de imagens. tempo de repetição (T
R), tempo de eco (T
E), flip ângulo e largura de banda (BW) foram otimizados para melhor qualidade de imagem. A sequência consistiu de T
R /T
E = 8/4 ms, flip ângulo = 30 ° e BW = 50 kHz. Um campo de visão (FOV) de 38,4 × 25,5 × 25,5 com matriz de dimensões 256 × 170 × 170 foi usado para adquirir 150 mícrons
3 isotrópico imagens de resolução espacial com médias de 6 de sinal (~48 minutos por ressonância magnética). Este FOV permitido para imagiologia simultânea do local do tumor, bem como gânglios linfáticos inguinais e popliteos.
Os ratinhos foram anestesiados com uma dose de carga de 3% de isofluorano (em 100% de oxigénio) numa câmara de indução, e foram transferidos para um nariz cónico integrado e RF trenó imagiologia bobina (desenvolvido em casa) para ser mantida a 1,5-2% de isofluorano durante a duração da ressonância magnética. A taxa respiratória e da temperatura interna do corpo dos ratinhos foram monitorizadas usando uma compatível monitorização e gating sistema fisiológico (SA Instruments Inc, Stony Brook, NY) RM. A temperatura interna do corpo do rato (medida rectalmente) foi mantida a 37 ± 1 ° C por meio de circuito fechado de realimentação de controlo de temperatura e um sistema de aquecimento do ar.
Os ratinhos foram injectados com -300 uL que corresponde a aproximadamente 24 mg de Fe /kg peso corporal de qualquer cisteína bloqueou contas de SPIO (CYS-SPIO, controle,
n
= 9) ou SOR-C27 esferas conjugadas (SOR-C27-SPIO;
n
= 9) por qualquer intravenosa (iv) ou ip injecção e fotografada em 2 horas (dia 0) e 26 horas (dia 1) após a injecção. varreduras de linha de base (dia -1) de cada ratinho foram também realizados antes das injecções para permitir uma comparação adequada da morfologia do tumor e nó de linfa e contrastar pré- e pós-injecção. Após o tempo de curso MRI, os animais foram sacrificados e os tumores foram imediatamente retirado para análise histológica /bioquímico.
MRI Processamento de Imagem.
Todas as imagens eram cheias de zero usando ImageJ software (NIH), primeiro . As imagens foram co-registradas em RView (Colin Studholme, Universidade da Califórnia) para cada rato. Uma rotina de segmentação do volume semi-automatizado foi implementado através de segmentação no RView para determinar com precisão volumes tumorais.
Resultados
estrutura de RMN Solução de SOR-C27
As informações sobre SOR-C27 estrutura secundária do péptido foi derivada através da análise H
α desvios químicos em três condições diferentes, fosfato 10 mM de água tamponada, dodecilsulfato de sódio (SDS) e dodecylphosphocholine (DPC). cálculos estruturais utilizando o efeito Overhauser nuclear (nOe) distanciar restrições para 10 mM SOR-C27 em água tamponada, NaCl ou DPC (Fig. 1A) gerou um total de 40 estruturas de menor energia cada, que não tiveram violações de restrições NOESY 0,5 Å . Uma vez que nenhuma porção do peptídeo poderia ser identificada como a adopção de uma estrutura regular, não foram realizadas verificações de validação estruturais. No entanto, em SDS micelas mudanças na amida
1H deslocamentos químicos foram observados para os resíduos Lys15, Phe17, Leu18, His19, Ser21, Val23, e Arg27 indicativo de uma mudança estrutural no ambiente aniônicos. cálculo estrutura da SOR-C27 em 100 micelas de SDS mM por meio de restrições de distância nOe oferecidas duas voltas de um α-hélice (resíduos 15-25), que foi consistente no Top 10 mais baixas estruturas de energia do 50 calculada (Fig. 1B) .
Um representante RMN estrutura solução de 10 mM de SOR-C27 em tampão de fosfato de potássio 50 mM, NaCl a 200 mM ou 100 mM dodecylphosphocholine (a). Um representante RMN estrutura de solução de 2 mM de SOR-C27 em aniónico de sódio 100 mM micelas dodecilsulfato que mostra a indução da estrutura helicoidal a partir de resíduos 15 a 25 (B).
Electrofisiologia de TRPV6 e SOR-C27 e SOR -C13
células de tipo selvagem HEK-293 que não expressam canais TRPV6.
electrofisiologia experimentos foram realizados em células HEK-293 transfectadas com os canais TRPV6. Em primeiro lugar, para descartar a presença de canais TRPV6 em células HEK-293 tipo selvagem, as gravações de células inteiras patch clamp com 50 ms rampa de tensão linear (-110 mV a +90 mV) foi aplicado na ausência ou presença de La
3+ (10 m). iões de lantânio, que inibem a atual TRPV6, não teve efeito sobre as amplitudes das correntes evocadas pela rampa (controle: 106 ± 27 Pa; La
3+: 111 ± 13 Pa,
n
= 3;
P
0,05; Fig. 2). Whole-cell patch clamp gravações de células HEK-293 transfectadas com TRPV6 /EGFP foram adquiridos na ausência ou na presença de La
3+ (10 uM). íons lantânio reduziu as amplitudes das correntes TRPV6 evocados pelas rampas em 82 ± 5% (controle: 1065 ± 450 Pa; La
3+: 224 ± 105 Pa;
n
= 3; Fig . 2). As amplitudes das correntes evocadas pela rampa no tipo selvagem HEK-293 (106 ± 27 pA,
n
= 3) foram significativamente menores (
p
= 0,002) do que correntes em TRPV6 /EGFP transfectadas células HEK-293 (1.065 ± 450 pa,
n
= 3).
As correntes medidas em células do tipo selvagem HEK-293 são indutivos de não-expressão ao longo de canais TRPV6. Para TRPV6 /EGFP HEK-293, na ausência de La
3+ iões mostrou uma grande corrente com a corrente a ser eficientemente bloqueada na presença de La
3+. Efeito do La
3+ íons (10 mM) em correntes evocadas por uma rampa de 50 ms (parte inferior) em células de tipo selvagem HEK-293 e /EGFP células TRPV6 HEK-293.
SOR -C13 e C27-SOR reduzir a amplitude das correntes TRPV6.
Estudos similares foram efectuados para caracterizar o efeito de concentrações crescentes de péptidos SOR-C13 e C27-SOR em canais TRPV6. Na presença de 83,5 nM, 417,5 nM, 835 nM e 25 uM SOR-C13 a amplitude das correntes TRPV6 foi reduzida em 18 ± 4,0% (
P
0,05,
N
= 9), 22 ± 4% (
p Art 0,05,
n
= 9), 24 ± 4% (
p Art 0,05,
FIG.