Abstract

Fundo

A multirresistência (MDR) é uma das principais razões tratamentos baseados em quimioterapia falhar. Hipóxia é geralmente associado com chemoresistance tumor. Contudo, a correlação entre a hipoxia-inducible factor-1 (HIF-1) e da resistência a múltiplos fármacos (MDR1) gene /transportador de P-glicoproteína heterodimérica (P-gp) permanece pouco claro. Este estudo tem como objetivo explorar os mecanismos moleculares de reverter MDR cancro do cólon, centrando-se o gene alvo HIF-1α.

Métodos

Um ensaio de sensibilidade quimioterápico foi usado para observar a eficiência do MDR reversão LoVo esferóides multicelulares (MCS). O nível de apoptose induzida por drogas diferentes foi analisado por citometria de fluxo (FCM). A ligação de HIF-1α para o promotor do gene MDR1 foi avaliada por imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Foi analisada a relação entre a expressão e sensibilidade HIF-1α /P-gp à quimioterapia.

Resultados

A sensibilidade do LoVo MCS a todas as quatro drogas de quimioterapia foi diminuída em graus variados em condições de hipóxia. Depois de silenciamento do gene HIF-1α, as sensibilidades de LoVo MCS para todas as quatro drogas da quimioterapia foram restaurados. Os níveis apoptóticos que todas as drogas eram induzidos todos diminuíram em várias extensões no grupo hipóxico. Depois de silenciamento HIF-1α, o nível de apoptose induzida por todas as quatro drogas de quimioterapia aumentou. A expressão de HIF-1α e P-gp foi significativamente aumentada em LoVo MCS após o tratamento com hipóxia. A inibição de HIF-1α diminuíram significativamente a expressão de ARNm ou proteína /P-gp MDR1 em ambas as monocamadas LoVo e LoVo MCS. O ensaio mostrou que ChIP HIF-1α foi ligado ao promotor do gene MDR1. pacientes com carcinoma de cólon avançadas com expressão de ambos HIF-1α e P-gp foram mais resistentes à quimioterapia do que com a não expressão.

Conclusões

inibição HIF-1α inverte resistência a múltiplas drogas em células de cancro do cólon através de regulação negativa da MDR1 /P-gp. A expressão de HIF-1α e MDR1 /P-gp pode ser utilizado como um marcador preditivo para a resistência à quimioterapia no cancro do cólon

citação:. Chen J, Ding Z, Y Peng, Pan-F, J Li, Zou G, et al. (2014) HIF-1α Inibição inverte resistência a múltiplas drogas em células cancerígenas do cólon através de regulação negativa do MDR1 /P-glicoproteína. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10.1371 /journal.pone.0098882

editor: Michal Zmijewski, Universidade Médica de Gdansk, Polónia |

Recebido: 07 de dezembro de 2013; Aceito: 08 de maio de 2014; Publicação: 05 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No.30973430 e No.81101629). (https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon é um dos tumores malignos mais comuns em todo o mundo, e quimioterapia desempenha um papel importante no seu tratamento. No entanto, a sensibilidade a diferentes regimes quimioterapêuticos varia muito de indivíduo para indivíduo. Muitos pacientes com câncer desenvolvem resistência aos medicamentos, levando a pobres resultados do tratamento. Além disso, a resistência à droga ocorre principalmente em tumores sólidos in vivo, mas não in vitro em monocamadas em [1]. O microambiente do tumor desempenha um papel central na insuficiência quimioterapia e resistência a drogas [2] -. [4]

A hipoxia é uma característica comum de muitos tumores malignos, incluindo o cancro do cólon. Um microambiente do tumor hipóxico é cada vez mais considerada uma componente crítica na determinação da resistência à droga [5], [6]. A hipoxia-inducible factor-1 (HIF-1) é um factor chave na alteração das características biológicas dos tumores. proteína HIF-1α é sobre-expresso em vários tipos de câncer humano e está associada a um pior prognóstico em muitos tipos de câncer. Embora muitos estudos têm indicado que a hipóxia potencializa a resistência do tumor à quimioterapia e radioterapia [7], [8], como o microambiente hipóxico contribui para a resistência às drogas anticâncer ainda não foi estabelecida.

A multirresistência (MDR) é uma das principais razões pelas quais a falha do tratamento à base de quimioterapia ocorre. Dos muitos mecanismos de MDR, a expressão elevada do gene MDR1 humano e o transportador codificada por MDR1 P-glicoproteina (P-gp) é um importante foco de pesquisa [9]. As células tumorais que sobreexpressam MDR1 /P-gp geralmente apresentam resistência a vários agentes quimioterapêuticos [10], [11]. O nosso estudo anterior mostrou que a expressão da proteína HIF-1α está correlacionada com MDR1 expressão /P-gp em tecidos de carcinoma de cólon e de uma linha celular de cancro do cólon, e os níveis de expressão de ARNm de HIF-1α e MDR1 são significativamente mais elevados no mesmo tipo de células em condições hipóxicas que, em condições de normóxia [12]. Ainda não está claro se e como HIF-1α está envolvido em MDR no câncer de cólon através da interação de MDR1 /P-gp.

Explorando a influência da hipóxia sobre o câncer de cólon MDR vai ajudar a melhorar o efeito da quimioterapia. No ambiente hipóxico, assumimos que o HIF-1α pode induzir directamente a expressão do MDR1 /P-gp que leva a MDR, e a reversão de cancro do cólon MDR pode ser alcançado quando a expressão de HIF-1α é especificamente inibida. No presente estudo, pretendemos explorar os mecanismos moleculares potenciais ea viabilidade de reverter MDR cancro do cólon, centrando-se o gene alvo HIF-1α. Esperamos fornecer uma base teórica e evidências experimentais para aplicações mais tarde relacionados em tratamento clínico.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Foi obtida a linha de células de cancro do cólon humano LoVo a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em alta concentração de glicose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (HyClone, EUA) e antibióticos (1% de penicilina e 1% de estreptomicina). Por exposição a hipoxia, as células foram cultivadas durante 24 horas numa câmara modulador incubadora a 37 ° C com 1% de O

2, 5% de CO

2, e 94% de N

2. esferóides multicelulares (MCS) foram obtidos através da utilização da técnica de sobreposição de líquido [13]. Em resumo, as células em crescimento exponencial LoVo foram adicionados ao meio de cultura placas que foram previamente revestidas com 2% de agarose. As placas foram suavemente horizontalmente e rodado durante 10-15 minutos por 2-3 horas nas primeiras 24 horas, e, em seguida, durante 10 minutos, a cada 4 horas. meio apropriado foi atualizado a cada dois dias. Para os experimentos de hipóxia, apropriado MCS foram estabelecidos em normoxia por 48 horas e depois cultivados em hipóxia por mais 24 horas.

Chemicals

adriamicina (ADR, Hisun Pharmaceutica, China), vincristina (VCR, Hisun Pharmaceutica, China), 5-fluorouracilo (5-FU, Sigma, MO, EUA), ou de irinotecano (CPT-11, Hengrui Medicina, China) foram todos preparados no dia da utilização por dissolução da concentração necessária em DMEM com soro fetal bovino a 10%.

quimioterapêutico sensibilidade do ensaio

LoVo células foram tripsinizadas, ressuspensas e contadas, e 1000 células foram semeadas em placas de 96 poços previamente revestidos com 2% de agarose para se obter nos MCS normoxia. Para as experiências de hipoxia, apropriado MSC foram transferidos em hipoxia durante 24 horas e depois incubadas com concentrações de gradiente de drogas por mais 24 horas em hipoxia. A viabilidade celular foi medida pela 3- (4, 5-dimetiltiazol-Z-il) -3 ensaio, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT, BD Biosciences, NJ, EUA). As placas foram incubadas com MTT a 37 ° C durante 4 horas, e a absorvância a 490 nm foi medida pelo Modelo 550 Leitor de Microplacas (Bio-Rad, CA, EUA).

quantitativa PCR em tempo real

o ARN total foi extraído com o reagente TRIZOL (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados foram: 5′-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 ‘e 5′-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3′ para a HIF-1α; 5’-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 ‘e 5′-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3′ para MDR1; 5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA -3 ‘e 5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3’ para 18sRNA. A síntese da primeira cadeia de ADNc foi realizada com o kit de síntese de ADNc (Takara, Dalian, China). Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando o kit em tempo real SYBR Green PCR (Takara). Todos os normalizations foram feitas utilizando níveis 18sRNA e as mudanças de dobragem foram calculados pelo método de delta-Ct Delta. Todos os experimentos foram realizados em três réplicas biológicas.

Análise Western Blot

de proteína total (50 ug) foi separada por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio. Após a transferência da proteína para membranas microporosas de fluoreto de polivinilideno (Bio-Rad), as membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e incubadas sequencialmente com os anticorpos primários (HIF-1α 1:500; actina p-1, P-gp 1:200 :5000), seguido por incubação com o-fluoresceína ligada anti-murganho (anti-coelho) IgG (1:1000) e, em seguida, a incubação com anticorpo conjugado com fosfatase alcalina anti-fluoresceína (1:5000). Todos os anticorpos foram comprados a partir de Santa Cruz, CA, EUA. Os complexos imunitários foram detectados com o reagente de quimioluminescência aumentada (Pierce, EUA). Para a quantificação, os sinais eram densitometricamente normalizada para p-actina por Quantidade Uma imagem de software de análise (Bio-Rad).

siRNA Construção e transfecção

sequências de RNAi-miRNA Pré HIF-1α para o alvo genes de HIF-1α e MDR1 foram concebidos e sintetizados. Depois de os dois vectores específicos da expressão de miARN ARNi com o EmGFP gene repórter alvo o HIF-1α humana e os genes MDR1, respectivamente, foram construídos e identificados por digestão com enzimas de restrição e sequenciação, os plasmídeos de ARNi de HIF-1α e MDR1 foram transfectados em células LoVo utilizando o lipossoma Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EUA). Os clones positivos estáveis ​​foram seleccionados usando blasticidina. Os graus de knockdown de HIF-1α e MDR1 foram identificados por PCR. Foram selecionados os plasmídeos RNAi com melhores efeitos de supressão para a construção posterior de miRNA clones de expressão lentivírus. Dois clones de expressão de lentivírus miARN, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-HIF-1α e pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-MDR1, foram construídos utilizando técnicas de gateway de recombinação (Invitrogen) e co-transfectados para 293FT células com o ViraPower mistura de embalagens (Invitrogen). O título foi examinada após infecção de células NIH /3T3 com o sobrenadante de vírus. Em seguida, as células LoVo foram infectados com os dois sistemas de lentivírus mediada por vetores miRNA RNAi e de forma estável selecionados por blasticidina.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

As células foram cultivadas em placas de 100 mm de diâmetro e , após 24 horas, incubadas com 1% de formaldeído durante 10 minutos a 37 ° C a proteínas de ligação cruzada com o ADN. A reacção de reticulação foi temperada por meio da adição de um décimo de volume de 1,25 mol /L de glicina. As células foram lavadas duas vezes com gelo frio 1 × PBS; ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação e mantido em gelo durante 30 minutos. Em seguida, os lisados ​​de células foram sonicadas em gelo com um sonicador de ultra-som Hielscher UP200S (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemanha), até que os cromatinas reticuladas foram cortados para se obter fragmentos de ADN entre 200 e 1000 pb. Os sobrenadantes foram incubados com ADN de esperma de salmão /proteína de 50% de pasta de agarose para reduzir o fundo não específico. A imunoprecipi tacão foi, então, realizada durante a noite a 4 ° C com 5 ug de anticorpo anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, EUA). Estes sobrenadantes foram suplementadas com 5 mol /L de NaCl e aquecida durante a noite a 65 ° C para inverter proteína-ADN ligações cruzadas. Os imunocomplexos foram ainda tratados com DNase-livre e proteinase K sem RNase, e o ADN foi purificado por extracção com fenol /clorofórmio e precipitação com etanol. A PCR foi realizada com os iniciadores específicos para a região que contém o local de hipoxia potenciador responsivo (5′-GCGTG-3 ‘) do promotor MDR1 [14]. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: 5’-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 ‘e 5′-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3’. Como relatado anteriormente [24], o factor de crescimento endotelial vascular humano (VEGF, um gene alvo de HIF-1 estabeleceu) foi usada como um controlo positivo e iniciadores que flanqueiam o potenciador responsivo a hipóxia do promotor de VEGF foram 5′-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 ‘e 5 ‘-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3’. A imunoprecipitação com IgG não específica (Santa Cruz) foi realizada como controlo negativo. Uma amostra que representa a amplificação linear do ADN de entrada total foi utilizado como controlo de entrada.

Detecção de apoptose por citometria de fluxo (FCM)

As células foram preparadas e tratadas como descrito acima e, em seguida, coradas com aloficocianina (APC) -conjugated anexina V e iodeto de propídio (PI) durante 10 minutos à temperatura ambiente, de acordo com as instruções do fabricante (anexina V-APC /PI Apoptosis Detection Kit; Jingmei Biotech, China). A população de células viáveis ​​e anexina V-negativo anexina V-apoptóticos positivo foi avaliado por CCF. Os dados foram coletados em um instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) e analisados ​​utilizando software CellQuest (BD Biosciences).

Pacientes e Tumor amostras

Cento e vinte pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma do cólon avançado e que foram submetidos quimioterapia à base de 5-FU no Hospital Southwest, Third Military Medical University, Chongqing, China, entre 2004 e 2008 foram elegíveis para este estudo. Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética e do Protocolo de Revisão do Hospital Southwest, Terceira Universidade Médica Militar e todos os pacientes fornecidas formulário de consentimento escrito. Os pacientes tinham idades compreendidas entre 30 e 79 anos (idade média de 54 anos); 73 eram do sexo masculino e 47 do sexo feminino. resposta à quimioterapia foi avaliada por tomografia computadorizada ou outros meios radiográficos após dois ciclos de tratamento, adotando os Critérios de Avaliação de Resposta em critérios Grupo Tumores Sólidos. Com base na sua resposta à quimioterapia, os pacientes foram classificados como respondedores ou não respondedores. As amostras de tecido foram fixadas em 10% de formalina, embebidos em parafina e cortados em secções em série de 4 uM. A expressão de HIF-1α e P-gp foi examinada por imuno-histoquímica como previamente descrito [12]. coloração castanha-amarela clara restrita aos núcleos, citoplasma, membrana celular ou indicado expressão positiva do HIF-1α ou P-gp. A expressão positiva foi registrada como (+) e expressão negativa como (-).

Análise Estatística

Todos os dados são fornecidos como a média ± SD. Os resultados foram analisados ​​pelo teste do qui-quadrado, teste t de Student e análise de uma via de variância (ANOVA).

p Art 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

LoVo MCS são mais resistentes à quimioterapia do que monocamadas em condições de hipóxia

Para imitar o ambiente hipóxico de um tumor in vivo [15], [16], LoVo MCS foram obtidos usando a técnica de sobreposição de líquido. células LoVo aglomeradas umas com as outras e proliferaram rapidamente. Depois de ter sido cultivadas durante 48 horas, LoVo MCS foram feitos de um número de aglomerados de células (Figura 1B). Quantitative PCR em tempo real mostraram que a expressão do HIF-1α foi significativamente maior no MCS LoVo LoVo que em monocamadas, não só em condições hipóxicas, mas também em normoxia (

P

0,05) (Figura 1C). Foram avaliadas as sensibilidades droga para o 5-FU, e os resultados mostraram que o MCS LoVo foram mais resistentes a 5-FU do que eram monocamadas em hipoxia (

P

0,05). Além disso, tanto LoVo MCS e as monocamadas foram mais resistentes a 5-FU em condições hipóxicas que em normoxia (Figura 1D).

(A) A morfologia das monocamadas LoVo. Barra de escala = 50 mm. (B) A morfologia da LoVo MCS. Barra de escala = 50 mm. (C) Quantitative real-time PCR detectou expressão de mRNA de HIF-1α em LoVo MCS e em monocamadas sob normóxicas e condições hipóxicas. Os níveis 18sRNA foram utilizados como controle interno e as mudanças de dobra foram calculados pelo método Ct delta-delta. As experiências foram efectuadas em três repetições biológicos e de PCR para cada gene foi realizado em duplicado (*

P

0,05). (D) as sensibilidades à droga (média ± DP, n = 3) de LoVo e LoVo MCS monocamadas de 5-FU em hipóxia ou normoxia (*

P

0,05, N: normoxia, H: hipóxia).

HIF-1α Inibição inverte multirresistência em LoVo MCS

Porque LoVo MCS mostrou maior resistência à quimioterapia do que monocamadas fez em hipóxia, queríamos investigar se a resistência aos medicamentos mudou quando HIF- expressão 1α foi especificamente inibida. Nós com sucesso estabeleceu um modelo LoVo MCS e estável LVV-HIF-1α e grupos LVV-MDR1 miR-infectados. Em condições hipóxicas, a sensibilidade de LoVo MCS à quimioterapia com cada um dos quatro medicamentos diminuiu em graus variados. A concentração -inhibiting 50% (IC

50) valores no grupo hipóxico foram maiores do que aqueles no grupo normóxica (ADR, VCR, e 5-FU,

p Art 0,01; CPT- 11,

P

0,05) (Figura 2). Depois de silenciamento do gene HIF-1α, as sensibilidades de LoVo MCS para todas as quatro drogas de quimioterapia foram restaurados para diferentes extensões. A proporção relativa entre reversão grupo LVV-HIF-1α miR-infectadas (hipoxia) e MCS (hipoxia) para cada fármaco foi a seguinte: ADR, 82,8% (

P

0,01); Videocassete, 83,8% (

p Art 0,01); 5-FU, 70,7% (

P

0,01); e CPT-11, 48,5% (

P

0,05). Depois de silenciamento do gene MDR1, a proporção relativa entre reversão grupo LVV-MDR1 miR-infectadas (hipoxia) e MCS (hipoxia) para cada fármaco foi a seguinte: ADR, 74,2% (

P

0,01) ; VCR, 70,9% (

p Art 0,01); 5-FU, 58,1% (

P

0,05); e CPT-11, 15,2% (

p Art 0,05)

(A) ADR.. (B) VCR. (C) 5-FU. (D) CPT-11. (E) IC50 de diferentes grupos LoVo MCS para agentes quimioterapêuticos (média ± DP, n = 3, **

P

0,01, *

P

0,05, N: normoxia, H :. hipoxia)

a inibição HIF-1α Melhora a apoptose induzida pela quimioterapia drogas em LoVo MCS

em seguida, observou-se a apoptose induzida por drogas quimioterápicas em LoVo MCS quando a expressão HIF-1α foi especificamente inibida. A análise da apoptose por FCM demonstraram que (Figura 3), em comparação com LoVo MCS sob condições de normóxia, os níveis apoptóticos induzidos pelos quatro drogas foram menores em diferentes graus no grupo hipóxico (ADR, VCR, e 5-FU,

p Art 0,01; CPT-11,

p Art 0,05). Depois de silenciamento eficientemente o gene alvo de HIF-1α, o nível de apoptose induzida por ADR, VCR e 5-FU foi notavelmente aumentada (

P

0,01) e foi 9,2 vezes, 7,4 vezes, e 2.6- vezes, respectivamente, em contraste com a dos MCS LoVo (grupo de hipoxia). No entanto, o nível de apoptose induzida por CPT-11 foi de apenas 1,1 vezes o grupo de hipóxia, sem significância estatística (

p Art 0,05).

A proporção de anexina V-apoptótica positiva células (quadrante inferior direito) foi avaliada por citometria de fluxo utilizando anexina V aloficocianina (APC) e coloração com iodeto de propídio (PI) de LoVo MCS após o tratamento com (B) ADR (25 ug /ml), (C) videocassete (25 ug /ml), (D) 5-FU (200 ug /ml) e (e) CPT-11 (200 ug /ml). células não tratadas foram utilizados como controle negativo. Os dados de cada gráfico estatístico de anexina V-APC coloração /PI é expressa em% de células no quadrante inferior direito e representam a média ± DP de três experiências independentes. Os gráficos de barras na parte inferior da citometria de fluxo gráficos de dispersão representam a% de células em apoptose no quadrante inferior direito. (**

P

0,01, N: normoxia, H: hipóxia)

MDR1 /P-gp Protein Expression é reduzida na LoVo MCS após LVV-HIF-1α miR transfecção em hipóxia

Para explorar os mecanismos moleculares potenciais de reverter MDR, incidindo sobre o gene alvo HIF- 1α, foi detectada a expressão de genes relacionados com a MDR em LoVo MCS quando a expressão de HIF-1α foi especificamente inibida. Western blot mostrou que a expressão do HIF-1α e P-gp em LoVo MCS foi significativamente aumentada após o tratamento durante 24 horas em hipoxia (

P

0,01). Quando HIF-1α foi derrubado na LVV-HIF-1α miR infectado MCS, tanto HIF-1α e expressão da proteína P-gp foi regulada negativamente em comparação com o grupo controle negativo (

p Art 0,01). E, no LVV-MDR1 miR infectado MCS, o nível de expressão da proteína HIF-1α não mostrou nenhuma diferença, enquanto P-gp foi reduzida significativamente em comparação com o grupo controle negativo (Figura 4). Os resultados indicaram que o gene MDR1 foi jusante do HIF-1α e expressão MDR1 /P-gp será reduzida em LoVo MCS enquanto HIF-1α foi inibida.

(A), foram realizadas análises de Western blot. β-actina foi utilizada como controlo interno. (B) os níveis relativos de proteína (média ± DP, n = 3) de HIF-1α e P-gp foram determinadas em cada um grupos (**

P

0,01, N: normoxia, H: hipóxia) .

MDR1 /P-gp mRNA e expressão de proteínas são reduzidos em LoVo monocamadas após LVV-HIF-1α miR transfecção em hipóxia

Uma vez que a expressão da proteína MDR1 /P-gp foi reduzida em LoVo MCS após LVV-HIF-1α miR transfecção, foi detectada ainda mais a expressão de genes relacionados com a MDR em monocamadas LoVo em hipoxia. Depois de infectar de modo estável monocamadas LoVo com LVV-HIF-1α miR e LVV-MDR1 Mir, Quantitative real-time PCR e transferência de Western (Figura 5) demonstraram que, em hipóxia, os níveis de mRNA e da expressão da proteína de HIF-1α e MDR1 na LVV -HIF-1α grupo miR foram significativamente mais baixos do que os dos grupos de miR controlo não tratado e negativo (

P

0,01). No entanto, no grupo LVV-miR MDR1, apenas os níveis de mRNA e da expressão da proteína do gene MDR1 eram estatisticamente inferiores aos dos grupos não tratados e de controlo negativo RIM em hipoxia (

P

0,01) , ao passo que há diferenças de HIF-1α mRNA e proteína foram observados (

p Art 0,05).

(a, B) Quantitative PCR em tempo real detectado HIF-1αor expressão de mRNA MDR1 em monocamadas LoVo (hipoxia) com LVV-HIF-1α miR (A) ou LVV-MDR1 miR (B) estavelmente transduzidas. monocamadas não tratadas em normoxia foram utilizados como controle normóxica. Os níveis 18sRNA foram utilizados como controle interno e as mudanças de dobra foram calculados pelo método Ct delta-delta. As experiências foram efectuadas em três repetições biológicos e de PCR para cada gene foi realizado em duplicado (**

P

0,01). (C-F) de transferência de Western detectou HIF-1α e expressão de proteína P-gp em monocamadas LoVo (hipoxia) com LVV-HIF-1α miR (C) ou LVV-MDR1 miR (E) estavelmente transduzidas. monocamadas não tratadas em normoxia foram utilizados como controle normóxica. (D, F) A comparação dos níveis de expressão de (média ± DP, n = 3) de HIF-1α e proteína MDR1 de cada grupo (**

P

0,01).

a ligação de HIF-1α a do promotor do gene MDR1

em seguida, utilizou-se um ensaio de chip para avaliar em LoVo MCS (tanto em normoxia e hipoxia) se HIF-1α ligado à região promotora do gene MDR1. Após precipitação de lisados ​​celulares com um anticorpo específico anti-HIF 1α, o promotor do gene MDR1 e o promotor do gene de VEGF (um gene alvo de HIF-1 estabelecido) foram amplificados por PCR com primers específicos. Os resultados (Figura 6) mostrou que o HIF-1α foi ligado ao promotor do gene MDR1 em LoVo MCS não só em condições hipóxicas, mas também em condições de normóxia.

A ligação de HIF-1α na MDR1 e o gene de VEGF promotores foi medida pelo chip. A análise de PCR para a região promotora do gene MDR1 foi realizada em amostras de imunoprecipitação (IP) com anticorpo anti-HIF-1α e com ADN purificado total de entrada do MCS LoVo (normóxia e hipóxia). O promotor do gene de VEGF (um gene alvo de HIF-1 estabeleceu) foi usada como um controlo positivo. A imunoprecipitação com IgG não específica foi realizada como controlo negativo. Uma amostra que representa a amplificação linear do DNA total de entrada foi usado como controle de entrada.

Pacientes com HIF-1α (+) /P-gp (+) são mais resistentes à quimioterapia

O nosso estudo anterior mostrou que HIF-1α e MDR1 /níveis de expressão P-gp correlacionar em tecidos tumorais de carcinoma do cólon [12]. Para determinar se a expressão de HIF-1α e MDR1 /P-gp em pacientes com cancro do cólon difere, assim como a sensibilidade relacionada com quimioterapia, técnicas de imuno-histoquímica foram empregues para detectar a expressão de HIF-1α e P-gp em tecidos tumorais de 120 pacientes com carcinoma de cólon avançado que receberam a quimioterapia baseada em 5-FU. Descobrimos que 73 dos 120 casos (60,8%) expressa tanto HIF-1α e P-gp, e este HIF-1α (+) /P-gp (+) população de pacientes foi mais resistentes à quimioterapia do que foi o HIF-1α ( -) /P-gp (-.) população (

p

= 0,001, OR 5,647, 95% CI 1,920-16,606) (Tabela 1)

Discussão

o nosso estudo anterior mostrou que a expressão da proteína HIF-1α está correlacionada com a expressão de P-gp em tecidos de carcinoma de cólon e de linhas celulares de cancro do cólon, e HIF-1α e MDR1 mRNAs foram encontrados para ser significativamente maior nas mesmas células sob condições hipóxicas que sob condições de normóxia [12]. No presente estudo, mostramos que o HIF-1α pode influenciar directamente a expressão do MDR1 /P-gp em ambiente hipóxico e, em seguida, mediar a resistência à quimioterapia não apenas em monocamadas de células cultivadas mas também em esferóides multicelulares, e HIF-1α inibição pode inverter a múltiplas drogas resistência via regulação baixa de MDR1 /P-gp. Muito evidências têm demonstrado que um microambiente hipóxico é propício para o desenvolvimento e manutenção de cânceres [17]. Além disso, as células cancerosas em condições de hipóxia mostrar mais resistência aos medicamentos antineoplásicos [18], [19]. Alguns estudos que tentaram explicar este fenómeno descobriram que células em condições de hipóxia geralmente dividem mais lento do que aqueles em condições de normóxia, tornando terapias que visem as células de crescimento rápido menos eficaz [17]. Entretanto, um estudo mostrou que a hipoxia poderia induzir um número de genes, incluindo MDR1 /P-gp, em esferóides multicelulares [16]. Em nosso estudo, descobrimos que HIF-1α ligado ao promotor do gene MDR1 em LoVo MCS não só em condições de hipóxia, mas também em condições de normóxia.

Nós estabelecida com sucesso um modelo LoVo MCS para imitar o microambiente hipóxico de tumores na Vivo. A sensibilidade quimioterapia e alterações apoptóticas de LoVo MCS ADR, VCR, 5-FU, CPT-11 e foram examinados em normoxia e hipoxia. Os resultados mostraram que as sensibilidades de quimioterapia e a apoptose de LoVo MCS em resposta aos quatro drogas foram todos diminuíram a diferentes graus em condições de hipóxia. Dos quatro drogas citotóxicas, 5-FU e CPT-11 são as mais vulgarmente utilizadas no cancro do cólon, ao passo que a resistência à ADR e VCR é pensado para ser estreitamente relacionado com MDR1 /P-gp [20]. Silenciamento do gene HIF-1α restaurado as sensibilidades de LoVo MCS para ADR, VCR, e 5-FU e induziu um aumento significativo no nível de apoptose de cada fármaco correspondente (

P Art 0,01). Estes resultados indicam que a resistência aos medicamentos de LoVo MCS pode ser invertida com uma combinação de sistema de miR-LVV HIF-1α e os fármacos anteriores. Esta descoberta está de acordo com as descobertas anteriores de que a inibição de HIF-1α pode aumentar a sensibilidade aos agentes quimioterapêuticos em células cancerosas, tais como fibrossarcoma, cancro gástrico, e carcinoma da mama [21] – [23]. Desde Unruh

et

al.

[24] verificaram que a eficácia antiproliferativa de carboplatina e etoposido é significativamente melhorada pela inactivação do HIF-1α em fibroblastos de rato embrionários, a contribuição de HIF-1α a resistência a drogas tem sido observado em vários tipos de células neoplásicas em anos recentes [21], [25] – [29]. No entanto, os dados disponíveis sobre a relação entre o HIF-1α ea chemoresistance de células cancerosas são conflitantes. Por exemplo, alguns estudos demonstraram que a inactivação do HIF-1α em normoxia não tem efeito sobre respostas ao fármaco em células de neuroblastoma e o adenocarcinoma pulmonar [30], [31]. Estudos recentes também têm defendido um efeito de mediação de resistência do HIF-1α, pelo menos em alguns cancros humanos [4]. Além disso, encontramos houve uma tendência de maior sensibilidade após o HIF-1α ou inibição MDR1, mas as sensibilidades quimioterapia para CPT-11 não foram significativamente diferentes nos grupos LoVo MCS. O resultado indicou que o mecanismo de quimioresistência para CPT-11 não depender de P-gp, mas sim passou por outra via, tal como o produto de CPT-11 metabólica SN-38 [32] – [34].

O mecanismo pelo qual o HIF-1α contribui para MDR é complexo e ainda não está claro. HIF-1α podem mediar MDR através da regulação de efluxo de droga, alterando a proliferação e sobrevivência celular, inibição de danos de ADN, ou reprogramando o metabolismo. Como um dos principais membros da família transportadora de ABC, MDR1 /P-gp reduz as concentrações intracelulares de drogas citotóxicas bombeando activamente os fármacos para fora das células, protegendo assim as células de cancro a partir de seus efeitos antitumorais [35]. MDR1 é um gene alvo de HIF-1. Em anos recentes, a contribuição de HIF-1 mediada por expressão da P-gp a resistência à droga induzida por hipoxia tem sido observada em muitas células de tumor, tais como o cancro gástrico, gliomas e carcinoma da mama [14], [21], [26 ], [36]. Neste estudo mostramos que a expressão de HIF-1α e P-gp foi significativamente reforçada em LoVo MCS após o tratamento em hipoxia. inibição HIF-1α por transfecção de células com um siRNA específico para HIF-1α diminuíram significativamente a expressão de ARNm de MDR1 /P-gp e proteína em ambas as monocamadas LoVo e LoVo MCS. Além disso, o HIF-1α foi ligado ao promotor do gene MDR1 directamente. Nós indicaram que a ativação HIF-1α pode induzir diretamente a expressão da MDR1 /P-gp e, em seguida, levar a MDR.

Para determinar se a expressão de HIF-1α e MDR1 /P-gp em pacientes com cancro do cólon difere , bem como a sensibilidade para a quimioterapia relacionada, foram imuno-histoquímica utilizada para detectar a expressão de HIF-1α e P-gp em tecidos tumorais de 120 pacientes com carcinoma de cólon avançado que receberam a quimioterapia baseada em 5-FU. Descobrimos que 73 dos 120 casos (60,8%) expressa tanto HIF-1α e P-gp, e este HIF-1α (+) /P-gp (+) população de pacientes foi mais resistentes à quimioterapia do que foi o HIF-1α ( -) /P-gp (-) da população. Portanto, o HIF-1α /MDR1 pode ser um alvo promissor no tratamento do cancro do cólon, e a reversão de cancro do cólon MDR pode ser alcançado quando a expressão de HIF-1α /MDR1 é especificamente inibida. Sugere-se que a expressão de HIF-1α e MDR1 /P-gp pode ser utilizado como um marcador preditivo para a resistência à quimioterapia no cancro do cólon.

Em conclusão, relatam que a inibição de HIF-1α inverte MDR em cancro do cólon células, que está associada com regulação negativa de MDR1 /P-gp. Nossos resultados podem ter implicações clínicas gerais para os pacientes do cólon com HIF-1α (+) /P-gp (+) padrões de expressão, e terapias de combinação destinadas a modulação da expressão HIF-1α em conjunto com regimes de quimioterapia padrão pode fornecer uma estratégia para superar tumor resistência.