Abstract
Embora CD133 tem sido relatada a ser um marcador de células-tronco de câncer de cólon promissor, o funções biológicas de CD133
+ células cancerígenas do cólon permanecem controversos. No presente estudo, investigamos as diferenças biológicas entre CD133
+ e CD133
– células cancerígenas do cólon, com um foco particular em suas interações com fibroblastos associados ao câncer, especialmente CD10
+ fibroblastos. Utilizaram-se 19 tecidos de câncer de cólon primário, 30 culturas primárias de fibroblastos derivados de tecidos de cancro do cólon e linhas celulares de cancro do cólon 6. Nós isolado CD133
+ e CD133
– subpopulações dos tecidos com cancro do cólon e células cultivadas.
In vitro
análises revelaram que as duas populações mostraram comportamentos biológicos similares em sua proliferação e quimio-sensibilidade.
In vivo
análises revelaram que CD133
+ células mostraram significativamente maior crescimento do tumor do que CD133
– células (
P
= 0,007). Além disso, em co-culturas com fibroblastos primários derivados de tecidos de cancro do cólon, CD133
+ células exibiram comportamentos significativamente mais invasivo do que CD133
– células (
P Art 0,001), especialmente em co-culturas com CD10
+ fibroblastos (
P Art 0,0001). Além disso
in vivo
análises revelaram que CD10
+ fibroblastos aumentou o crescimento do tumor da CD133
+ células significativamente mais do que CD10
– fibroblastos (
P Art 0,05) . Estes dados demonstram que o
in vitro
propriedades invasivas e
in vivo
crescimento do tumor da CD133
+ células cancerígenas do cólon são reforçadas na presença de fibroblastos específicos associados ao câncer, CD10
+ fibroblastos, sugerindo que as interações entre estas populações de células específicas têm um papel importante na progressão do cancro. Portanto, essas interações específicas podem ser alvos promissores para novas terapias contra o câncer de cólon
Citation:. Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru M, Nakata K, et al. (2010) Prospectivamente isolados câncer Associated CD10
+ Os fibroblastos têm interações mais fortes com CD133
+ células cancerígenas do cólon do que com CD133
– células cancerosas. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10.1371 /journal.pone.0012121
editor: Irene Oi Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 08 de março de 2010; Aceito: 15 de julho de 2010; Publicação: 12 de agosto de 2010
Direitos de autor: © 2010 Cui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Compatível com parte por uma Grant-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, e uma bolsa da Takeda Science Foundation, da Sociedade japonesa de Gastroenterologia, a Fundação Uehara Memorial, ea Fundação Nakajima. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental e sua incidência está a aumentar nos países asiáticos, como resultado de mudanças em direção a uma dieta ocidentalizada [1]. Recentemente, o conceito de cancro de células estaminais (CCC) tem sido focada em cima na biologia do cancro colo-rectal. O cancro do cólon mostra um acentuado grau de heterogeneidade morfológica e funcional nas suas células. Entre estas populações de células, em particular CSCs têm sido relatados como possuindo actividades tumorigénicas e resistentes ao tratamento [2]. Por conseguinte, o isolamento e caracterização de CSCs cólon pode ajudar para o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e terapêuticos [3].
Humano prominin-1 (PROM1, CD133) é uma glicoproteína transmembranar-5 de 865 aminoácidos com um peso molecular total de 120 kDa. Foi inicialmente descrito como um antigénio de superfície específico de células-tronco hematopoiéticas humanas [4], [5] e um marcador para as células neuroepiteliais de murino e várias outras células epiteliais embriónicas [6]. Embora as funções biológicas de CD133 permanecem desconhecidos [7], CD133 sozinho ou em combinação com outros marcadores é actualmente utilizado para isolar células estaminais a partir de vários tecidos [4], [5], assim como a próstata [8], fígado [9 ] e pâncreas [10], [11]. Recentemente, CD133 foi relatado para ser um marcador de CSC no cancro do cólon [3], [12]. IETA et ai. [13] ainda informou que CD133
+ células derivadas de linhas celulares de cancro do cólon apresentam maior potencial tumorigénico do que CD133
– células. No entanto, Shmelkov et ai. [14] demonstraram que CD133 é amplamente expresso por células epiteliais de cancro do cólon primários humanos, e que tanto CD133
+ e CD133
– subpopulações tumorais metastáticas são capazes de tumorigênese de longo prazo
in vivo
. Portanto, as implicações de CD133 como um marcador CSC permanecem controversos.
Foi sugerido que as interacções entre as células cancerosas e os fibroblastos estromais circundantes têm papéis críticos na invasão tumoral e metástase [15], [16]. Embora os tumores a granel são conhecidas por consistir em células cancerosas heterogéneo com diferentes actividades de proliferação, invasão e metástase, não há relatos de focagem na heterogeneidade de fibroblastos associados ao cancro. Na maioria dos estudos anteriores [17], [18], [19], [20], apenas dois ou três culturas primárias de fibroblastos associados ao cancro têm sido utilizados para investigações. Portanto, para um melhor entendimento das interações celulares de células-estromal de câncer, é importante focalizar a heterogeneidade de fibroblastos associados ao câncer, semelhante à heterogeneidade das células cancerosas, tais como CSCs.
No presente estudo , investigamos as implicações biológicas da CD133
+ células cancerígenas do cólon através da análise de expressão de CD133 em tecidos de câncer de cólon primário humanos e avaliar os comportamentos biológicos de CD133
+ e CD133
– células derivadas de linhas celulares de cancro do cólon
in vitro
e
in vivo
. Foram encontradas diferenças significativas na capacidade de invasão entre estas duas populações em co-culturas com fibroblastos primários derivados de tecidos de cancro do cólon, especialmente em co-culturas com fibroblastos positivos para CD10, uma metaloendopeptidase membrana. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que CD133
+ células de cancro do cólon são mais invasiva na presença de fibroblastos associados ao cancro específicos, especialmente CD10
+ fibroblastos, e que estas populações de células podem ser alvos promissores para a inibição de metástases e tumores recorrência.
resultados
expressão CD133 em tecidos de câncer de cólon primário cirurgicamente ressecados
Até o momento, dados inconsistentes foram relatados em relação à CD133
+ e CD133
– as populações de células em tecidos de cancro do cólon primários [3], [14]. Nós investigamos as percentagens da CD133
+ e CD133
– populações de células em tecidos de cancro do cólon primários por citometria de fluxo. Nós usado 26 tecidos de câncer de cólon primário e 24 tecidos normais epiteliais do cólon de 26 pacientes. Analisamos o CD133
+ populações nestes tecidos do cólon após a exclusão
+ células CD45
+ e CD31. Todas as amostras de câncer de cólon continha tanto CD133
+ e CD133
– células (Tabela 1; CD133
+ células: 2-54%). Nós também detectou CD133
+ células a 0-5% em tecidos de cólon normais. Para avaliar as implicações clínicas de expressão CD133, investigamos as correlações entre a expressão CD133 e os achados clínico-patológicos, tais como o grau do tumor, classificação Dukes, metástases em linfonodos, invasão linfática e invasão venosa (Tabela 2). Foram encontradas correlações significativas entre a expressão CD133 e classificação Dukes (
P
= 0,010) e entre a expressão de CD133 e metástases em linfonodos (
P
= 0,023).
comparações de comportamentos malignos entre CD133 ordenada
+ e CD133
– células cancerígenas do cólon
Usando citometria de fluxo, examinamos a presença de CD133
+ populações em linhas celulares de cancro do cólon 6 . Verificou-se que todas as linhas celulares possuíam CD133
+ (células de 6-91%; Figura 1A). Em particular, foram detectadas duas populações distintas, uma que consiste de apenas CD133
+ células e o outro consiste de apenas CD133
– células, em células DLD-1, enquanto que as outras linhas celulares pareceu possuir uma população constituída por tanto CD133
+ e CD133
– células. Nós classificados células DLD-1 com base na expressão de CD133 e reanálise mostrou selecção eficaz (CD133
+: 98%; CD133
-: 100%; Figura 1B). Posteriormente, investigaram-se as alterações dependentes do tempo na expressão de CD133 em células parentais DLD-1 não triados e separados CD133
+ e CD133
– células. Como mostrado na Figura 1B, classificado CD133
+ células apresentaram alterações dependentes do tempo significativas no CD133
+ e CD133
– populações durante a cultura de longo prazo, enquanto as percentagens do CD133
+ e CD133
– populações não se alterou em células parentais e classificadas CD133
– células. Em seguida, para comparar os comportamentos biológicos de CD133 ordenada
+ e CD133
– células, utilizou-se as células DLD-1 e HCT-116 e investigada a sua proliferação celular, capacidade de formação de colónias e quimiorresistência de 5-fluorouracilo (5-FU) e doxorrubicina (DOX). Não encontramos diferenças significativas nestes comportamentos celulares entre CD133
+ e CD133
– células (Figuras S1, S2, S3, S4)
(A) CD133
+ populações em. painel de linhas celulares de cancro do cólon humano. Citometria de fluxo foram realizadas análises para investigar o CD133
+ populações em linhas celulares de cancro do cólon 6. (B) Análise da CD133
+ população de células e reanálises de ordenada CD133
+ células (98%) e CD133
parentais DLD-1 – células (100%) (painéis superiores). As alterações dependentes do tempo no CD133
+ populações não separados dos pais e classificadas CD133
+ e CD133
– células DLD-1 também são mostrados (painel inferior). O CD133 ordenada
+ células apresentam alterações dependentes do tempo significativas no CD133
+ e CD133
– populações durante a cultura de longo prazo, enquanto as percentagens do CD133
+ e CD133
– populações não mudam nas células parentais e classificadas CD133
– células. (C) O crescimento do tumor foi avaliado em 1 mês após a injecção de 5 × 10
6 CD133
+ ou CD133
– células DLD-1 em 6 SCID, respectivamente. fotografias representativas são mostrados no painel superior (esquerda: CD133
– tumor derivado de células; direita: CD133
+ tumor derivado de células). Barra de escala = 1 cm. O CD133
+ tumores derivados de células são significativamente maiores do que o CD133
– tumores derivados de células (
P
= 0,007; painel inferior). Os dados representam médias ± DP
Para avaliar o potencial tumorigénico e
in vivo
crescimento do tumor da CD133
+ e CD133
-. Células DLD-1, nós transplantado números de série de CD133
+ e CD133
– células em camundongos imunodeficiência Combinada grave (SCID). Embora tenha havido uma tendência para a detecção precoce de formação de tumores em camundongos injetados com CD133
+ células em comparação com camundongos injetados com CD133
– células, as diferenças não foram significativas (Tabela 3). Às 10 semanas após o transplante, a injeção de mais de 5 × 10
6 CD133
+ ou CD133
– células gerado tumores visíveis em todos os ratos. No entanto, quando os tamanhos dos tumores foram comparados, o CD133
+ tumores derivados de células foi significativamente maior do que o CD133
– tumores derivados de células. (
P
= 0,007; Figura 1C)
fibroblastos associados ao câncer aumentar a capacidade de invasão das células CD133
+ células de forma mais eficaz do que a de CD133
– células
Para elucidar os fatores que causam as diferenças no
in vivo
crescimento do tumor entre CD133
+ e CD133
– células, foram investigados os efeitos da co-culturas com fibroblastos associados ao câncer na capacidade de invasão dessas células. Descobrimos que não houve diferença na capacidade de invasão entre CD133
+ e CD133
– células quando as células foram cultivadas isoladamente (Figura 2A). Em contraste, quando as células foram co-cultivadas com fibroblastos associados ao cancro, CD133
+ células mostraram significativamente maior do que a invasividade CD133
– células e as células parentais (
P
0,001 para ambos; Figura 2A). Foram examinados os efeitos de 12 culturas primárias de fibroblastos sobre a capacidade de invasão das células CD133
+ células, e descobriram que os efeitos de células co-cultivadas em CD133
+ invasão de células variou de 0,88 vezes, para 1,76 vezes (Tabela 4 ).
() células invadir um foram medidos após 48 h de monocultura ou co-cultura com fibroblastos associados ao câncer (f11). CD133
+ células co-cultivadas com fibroblastos associados ao câncer mostram significativamente maior capacidade de invasão de CD133
– e células parentais (
P Art 0,001). Barras de escala = 100 pm. (B) As percentagens do CD10
+ população de células e as actividades destas células para induzir a invasão de células cancerígenas do cólon co-cultivadas foram investigados em 12 culturas primárias de fibroblastos. Há uma correlação positiva entre o aumento da CD133
+ capacidade de invasão das células e a percentagem do CD10
+ população de células (
P Art 0,0001). (C) A citometria de fluxo análises foram realizadas para investigar o CD10
+ populações em tecidos de câncer de cólon primário. Há uma correlação significativa entre as percentagens da CD133
+ e CD10
+ populações em tecidos de cancro do cólon (
P
= 0,015).
correlações entre as percentagens de populações marcador positivo da superfície celular em fibroblastos associados ao câncer e sua valorização da invasão câncer
Para caracterizar as culturas primárias de fibroblastos associados ao câncer, examinamos as expressões de superfície associado a células do estroma marcadores CD10, CD105, CD44 e CD54 em 32 culturas primárias de fibroblastos, por citometria de fluxo (Tabela 4). Em seguida, investigaram as correlações entre o aumento da CD133
+ capacidade de invasão das células e as percentagens de populações positivas para estes marcadores de superfície. Encontramos uma correlação significativa entre o aumento da CD133
+ capacidade de invasão das células e a percentagem do CD10
+ população (
P Art 0,0001; ρ = 0,928; Figura 2B; Tabela 5). Como mostrado na Tabela 4, a percentagem de CD10
+ população em culturas primárias de fibroblastos associadas a cancro do cólon estabelecidas a partir de tumores variou de 0,39% para 73,33%. Encontramos também uma significativa correlação inversa entre as percentagens do CD10
+ e CD105
+ populações (
P Art 0,0001; Tabela 5), bem como uma significativa correlação inversa entre o aumento de CD133
+ capacidade de invasão das células e a percentagem do CD105
+ população (
P
= 0,0268; Tabela 5).
em seguida, investigamos a expressão CD10 em ressecada cirurgicamente tecidos primários e descobriram que 0,4-25% das células derivadas de tecidos de cancro do cólon eram CD10
+ (Tabela 1). Em seguida, examinaram as correlações entre a percentagem do CD10
+ população e os achados clínico-patológicos. Encontramos tendências de correlações positivas entre a percentagem do CD10
+ população e classificação Dukes e entre a percentagem de CD10
+ população e metástases em linfonodos, embora eles não foram estatisticamente significativas (Tabela 2). Também foram investigadas as correlações entre os marcadores da superfície celular nos mesmos pacientes e encontraram uma correlação significativa entre as percentagens da CD133
+ e CD10
populações + (
P
= 0,015; ρ = 0,4063 ;. Figura 2C)
CD10
+ fibroblastos melhorar as
in vitro
invasão e
in vivo
crescimento do tumor da CD133
+ células cancerosas
Para investigar as diferenças funcionais entre CD10
+ e CD10
– fibroblastos, resolvemos CD10
+ e CD10
– fibroblastos (Figura 3A) de culturas primárias de fibroblastos associados ao câncer. Os níveis de
CD10
mRNA nestas duas populações foram consistentes com os níveis de expressão da proteína de superfície celular CD10 (Figura 3A). Usando essas duas populações de fibroblastos, investigamos os seus efeitos sobre a capacidade de invasão das células CD133
+ e CD133
– células cancerosas. CD10
+ fibroblastos reforçada a capacidade de invasão das células CD133
+ células cancerosas significativamente mais do que CD10
– fibroblastos (
P Art 0,0001; células HCT116, Figura 3B; DLD-1 células, Figura 3C). CD10
+ fibroblastos também aumentou ligeiramente a capacidade de invasão das células CD133
– as células cancerosas mais do que CD10
– fibroblastos, mas significativamente menos do que os seus efeitos sobre a capacidade de invasão das células CD133
+ células cancerosas (
P
0,001; Figura 3C). Para avaliar os efeitos de CD10
+ e CD10
– fibroblastos em
in vivo
o crescimento do tumor, nós cotransplanted CD133
+ ou CD133
– células cancerosas HCT116 e CD10
+ ou CD10
– os fibroblastos em ratinhos SCID. CD10
+ fibroblastos aumentou o crescimento do tumor da CD133
+ células cancerosas significativamente mais do que CD10
– fibroblastos (
P Art 0,05; Figura 3D)
(. A) Análise de culturas primárias de fibroblastos associados ao câncer de cólon (painel esquerdo) e reanálises de CD10 classificadas
+ células (painel superior meio) e CD10
– células (meio painel inferior). O
CD10
níveis de mRNA do CD10 ordenada
+ e CD10
– fibroblastos foram medidos por qRT-PCR (painel da direita). (B, C) A capacidade de invasão das células CD133
+ e CD133
– células cancerosas co-cultivadas com CD10
+ ou CD10
– fibroblastos foi avaliada. Fotografias representativas são mostradas (B, células HCT116; C, as células DLD-1). Barras de escala = 100 pm. CD10
+ fibroblastos aumentar a capacidade de invasão das células CD133
+ células cancerosas significativamente mais do que CD10
– fibroblastos (
P Art 0,0001). (D) Os efeitos do CD10
+ e CD10
– fibroblastos em
in vivo
crescimento do tumor foram avaliados em 4 semanas após cotransplantation de CD133
+ ou CD133
– câncer HCT116 células e CD10
+ ou CD10
– os fibroblastos em ratinhos SCID (
n
= 6 para cada grupo). Fotografias representativas são mostradas (painel superior). Barra de escala = 1 cm. CD10
+ fibroblastos aumentar o crescimento do tumor da CD133
+ células cancerosas HCT116 significativamente mais do que CD10
– fibroblastos (
P Art 0,05; painel inferior). Os dados representam médias ± DP.
Efeito do CD10 knockdown no CD10
+ fibroblastos sobre a invasão de células cancerígenas do cólon co-cultivadas
Para verificar se a proteína CD10 em fibroblastos contribui funcionalmente a melhoria da invasão de células cancerosas co-cultivadas, fibroblastos transfectados com
CD10
-targeting pequenos ARN interferentes (siRNAs) (siARN-1 e siRNA-2) ou um ARNsi de controlo foram utilizados para ensaios de invasão. Ambos do
CD10
siRNAs -targeting inibiu 90% da
CD10
mRNA expressão. Knockdown de expressão CD10 CD10 em
+ fibroblastos notavelmente reduziu a capacidade de invasão das células CD133 co-cultivadas
+ células cancerosas HCT116 (
P Art 0,001; Figura 4), mas teve um efeito limitado sobre a invasão de CD133 .
– células cancerosas
Knockdown de expressão CD10 CD10 em
+ fibroblastos notavelmente reduz a capacidade de invasão das células CD133 co-cultivadas
+ células cancerosas HCT116 (
P Art 0,001) , mas tem um efeito limitado sobre a invasão de CD133
– células cancerosas. fotografias representativas (painéis superiores) e gráficos (painel inferior) são mostrados. Barras de escala = 100 mm
perfil de expressão diferencial de CD10
+ e CD10
-. fibroblastos
Para elucidar as moléculas-chave envolvidas no CD10
+ aprimoramento mediada por fibroblastos do
in vitro
células cancerígenas do cólon invasão e
in vivo
crescimento do tumor da CD133
+, realizamos análises de microarray usando CD10
+ e CD10
– fibroblastos primários-cultivadas derivadas de tumores de cólon. As comparações dos dados de microarranjos entre CD10
+ e CD10
– fibroblastos primários-cultura identificou 20 genes que foram upregulated por 2 vezes na CD10
+ fibroblastos (Tabela S1). Para validar estes dados de microarray, qRT-PCR foi realizado. Foram selecionados
ALDH1A1
,
GPNMB
,
MMP3
e
IGFBP2
dos genes listados na Tabela S1 porque estes genes foram relatados para ser envolvido em invasão de células de cancro do cólon e células estaminais também foi relatado para expressar ALDH1 [21], [22], [23], [24], [25]. Os dados validados foram consistentes com os dados de microarranjos (Figura S5).
Para avaliar os efeitos do
CD10
knockdown nas expressões dos quatro genes associados à invasão (
MMP3
,
ALDH1A1
,
GPNMB Comprar e
IGFBP2) em CD10
+ fibroblastos, CD10
+ fibroblastos foram transfectadas com
CD10
-targeting ou controle siRNAs, e as expressões dos quatro genes associados à invasão foram avaliados. Não houve mudanças significativas nas expressões destes quatro genes (Figura S6).
Discussão
No presente estudo, os nossos
in vitro
experiências revelaram que CD10
+ fibroblastos derivados de tecidos de cancro do cólon aumentou significativamente a invasão de CD133
+ células cancerígenas do cólon, em comparação com CD10
– fibroblastos. Nós também descobrimos que knockdown de CD10 CD10 em
+ fibroblastos parcialmente reduzido a capacidade de invasão das células CD133
+ cancro do cólon co-cultivadas. Além disso, o nosso
in vivo
análises demonstraram que cotransplantation de CD10
+ fibroblastos aumentou significativamente o crescimento do tumor da CD133
+ células cancerígenas do cólon, em comparação com cotransplantation de CD10
– fibroblastos. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que um subconjunto específico de células cancerígenas do cólon, CD133
+ células, tem interações importantes com um subconjunto específico de fibroblastos associados ao câncer, CD10
+ fibroblastos. Este é o primeiro relatório para descrever as interacções celulares de cancro de células-estromais entre prospectivamente classificadas subconjuntos específicos de células cancerígenas do cólon e fibroblastos associados ao câncer.
CSCs têm sido isoladas de câncer de cólon com base na sua expressão da célula marcador de superfície CD133 [3], [12], [26]. Embora vários investigadores têm recentemente relatórios sobre CD133 publicada
+ células cancerígenas do cólon [3], [12], [26], não havia dados inconsistentes quanto à capacidade de iniciação tumor da CD133
+ células cancerígenas do cólon. No presente estudo, encontramos potencial tumorigénico, tanto CD133
+ e CD133
– células cancerígenas do cólon, de acordo com os resultados de Shmelkow et al. [14]. Além disso, não foram encontradas diferenças significativas entre estas duas populações de células em sua
in vitro
proliferação celular, a formação de colónias e chemoresistance. No entanto, o presente
in vivo
análises revelaram que CD133
+ células geradas tumores significativamente maiores do que CD133
– células. Para compreender as implicações dos resultados inconsistentes entre o
in vitro Comprar e
in vivo
experiências, nós nos concentramos em interações celulares de células-estromal câncer, que são conhecidos por terem um papel crucial na progressão do cancro [ ,,,0],27]. Em co-culturas com várias culturas primárias de fibroblastos associados ao cancro, a capacidade de invasão das células CD133
+ células de cancro do cólon foi significativamente aumentada em comparação com a de CD133
– células, enquanto que as culturas primárias de outros fibroblastos associados ao cancro não parecem ter tal potencial para aumentar a capacidade de invasão das células cancerosas. Portanto, caracterizado essas culturas primárias de fibroblastos associados ao câncer, e descobriu que CD10
+ fibroblastos desempenhou um papel significativo na melhoria da CD133
+ capacidade de invasão de células cancerosas no
in vitro Comprar e
in vivo
experimentos
no presente estudo, foram utilizados CD133
+ e CD133
– células isoladas de linhas de células cultivadas, porque não fomos capazes de obter resultados reprodutíveis para ensaios de tumorigenicidade e experimentos co-cultura quando usamos CD133
+ e CD133
– células isoladas de tumores dos pacientes em um estudo preliminar. No entanto, é importante investigar as funções biológicas de CD133
+ e CD133
– subpopulações isoladas de tumores de doentes. Portanto, outros exames são necessários para esclarecer a relação entre CD133 primária tumor derivado
+ células cancerosas e CD10
+ fibroblastos. No entanto, precisamos melhorar nossos métodos de culturas primárias de células cancerosas antes que tais exames podem ser realizados. Além disso, foram utilizados modelos subcutâneos no presente estudo devido às dificuldades encontradas na avaliação do tamanho do tumor em modelos ortotópicos. No entanto, considerando a importância do microambiente tecido, estudos utilizando modelos ortotópicos deve ser realizada como o passo seguinte.
CD10 é uma superfície celular metaloprotease dependente de zinco, 90-100 kDa, que é amplamente expresso em células pelos vários tecidos, tais como células linfóides progenitoras, células mioepiteliais e as células do estroma da medula óssea normal e endométrio [28], [29], [30], [31]. Além disso, foi relatado para CD10 ser um marcador para categorizar leucemias agudas e linfomas malignos subclassifying [32]. estudos de imuno-histoquímica recentes revelaram que a frequência de expressão do estroma positivas CD10 nos tumores foi significativamente correlacionada com o prognóstico de pacientes com câncer de mama [18], bem como a invasão e metástase de cancros gástricos [19]. Ogawa et ai. [31] realizado um estudo imuno-histoquímica do cancro colo-rectal e relatou que a expressão de CD10 em células do estroma foi mais frequentemente detectada em tumores invasivos do que em tumores não invasivos. As conclusões destes estudos imunohistoquímicos anteriores são consistentes com os de nosso estudo funcional presente.
Os resultados deste estudo demonstraram que o knockdown de expressão CD10 CD10 em
+ fibroblastos parcialmente, mas significativamente, diminuiu a capacidade invasiva de co-cultivadas CD133
+ células cancerígenas do cólon. Os dados de microarray identificou vários genes que estão envolvidos na invasão de células cancerosas, mas knockdown da expressão de CD10 não afectou a expressão destes genes. Os dados podem sugerir que CD10
+ fibroblastos têm ambos os mecanismos dependentes de CD10 e independente de CD10 para promover a invasão de co-cultivadas CD133 células
+ do cancro do cólon, embora mais exames são necessários para elucidar os mecanismos detalhados dessas interações.
em conclusão, os presentes análises funcionais sugerem que as interações entre CD133
+ cólon células cancerosas e CD10 associado a um cancro
+ fibroblastos têm papéis importantes na progressão do câncer de cólon. Estas interações podem ser alvos promissores para terapias contra o câncer de cólon.
Materiais e Métodos
Ética declaração
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Kyushu (número de aprovação, 19 -13) e conduzida de acordo com as Diretrizes éticas para Genoma Humano /Gene Research promulgadas pelo Governo japonês. Todos os pacientes assinaram documento de consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para fins de investigação não especificados. Para todos os experimentos envolvendo ratos, os animais foram alojados em armários de fluxo laminar sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em locais aprovados pela Universidade de Kyushu (número de aprovação, A020-018-0).
Células e reagentes
linhas de células cancerígenas do cólon humano (DLD-1, RCM1 e Colo201) foram adquiridos da coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação (Osaka, Japão). As linhas de células LOVO e Colo205 foram obtidos a partir de RIKEN (Tsukuba, Japão) e a linha celular HCT116 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Nós estabelecemos 32 culturas primárias de fibroblastos associadas a cancro do cólon derivadas de tumores de cólon ressecados a partir de 26 pacientes, como descrito anteriormente [33]. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com estreptomicina (100 ug /ml), penicilina (100 U /ml) e soro de bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° C num ambiente humidificado de 90% de ar e 10% de CO
2. Todas as experiências foram realizadas utilizando células cultivadas em meio suplementado com FBS a 10%. Todas as amostras de tecido foram obtidas na altura da cirurgia no Departamento de Cirurgia I, Hospital Universitário de Kyushu (Fukuoka, Japão). patologistas experientes realizados exames histológicos de todos os tecidos adjacentes aos espécimes.
5-FU e DOX foram gentilmente cedidas pela Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japão) e Nippon Roche KK (Kamakura, Japão), respectivamente.
A citometria de fluxo
As amostras de tecido foram lavadas extensivamente com solução salina tamponada com fosfato (PBS), cortados em fragmentos de aproximadamente 1 mm
3 cubos usando tesouras e dissociadas em células isoladas através de digestão com colagenase (Wako Pure Chemical Industries). As células dissociadas foram passados através de um filtro. As células primárias derivadas de tecidos ressecados e dissociado células DLD-1 foram suspensas em gelo frio 1% de FBS em PBS a 1 × 10
6 células /100 uL. Cada suspensão foi incubada com um anticorpo em gelo durante 40 min. As células marcadas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo EPICS ALTRA (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) equipado com dois lasers que fornecidos comprimentos de onda de excitação de 488 nm para a fluoresceína isotiocianato (FITC), ficoeritrina (PE) e iodeto de propídio (PI) sinais e 635 nm para os sinais de aloficocianina (APC). As emissões de fluorescência resultantes foram recolhidos utilizando conjuntos de filtros passa banda a 525 ± 15 nm para FITC, 575 ± 10 nm para o PE, 610 ± 12 nm para PI e 675 ± 25 nm para a APC. software citometria de fluxo EXPO32 (Beckman Coulter Inc.) foi utilizada para quantificar os sinais de fluorescência e para definir os parâmetros eletrônicos acopladas ao lógicos. Os anticorpos primários utilizados para as análises de FACS estão listados na Tabela S2.
qRT-PCR
O ARN total foi extraído de células cultivadas e /ou classificados usando um Kit de Isolamento de RNA High Pure (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemanha) com ADNase I (Roche Diagnostics) de tratamento, de acordo com as instruções do fabricante. Nós projetamos primers específicos (Tabela S3) e realizado pesquisas BLAST para garantir as especificidades desses iniciadores. Um passo de qRT-PCR foi realizada utilizando um Kit de QuantiTect SYBR Green transcrição reversa-PCR (Qiagen KK, Tóquio, Japão) e um previamente Chromo4 em tempo real do sistema de detecção de PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), como descrito [ ,,,0],34]. Cada amostra foi executado em triplicado e a expressão de cada gene foi apresentada como a razão entre a expressão de cada mRNA do gene alvo e que de
18S rRNA
.
CD10
siRNAs
de inibição de
CD10
expressão de genes foi conseguida por interferência com ARN de ARNsi contra
CD10
(siARN-1: sentido, 5′-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 ‘, anti-sentido, 5’-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 ‘; siRNA-2: sentido, 5′-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3′, anti-sentido, 5’-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 ‘; Qiagen, veneno Information Center Mainz, Alemanha), como descrito anteriormente [35].