Abstract

Fundo

Com base em nossos resultados pré-clínicos, estamos a avaliar a eficácia da injeção intratumoral de células dendríticas (DC ) transduzidas com um vector adenoviral que expressa o gene secundária quimiocinas linfóide (CCL21) (Ad-CCL21-DC), em um ensaio de fase I no cancro do pulmão avançado de células não pequenas (NSCLC). Embora esta abordagem mostra melhorar a resposta imune, a preparação de DC autólogas para a modificação genética é incómodo CCL21, caro e demorado. Estamos avaliando uma abordagem não-DC, que utiliza nanopartículas vault para entrega CCL21 intratumoral para mediar a atividade antitumoral no cancro do pulmão.

principais conclusões

Aqui nós descrevemos que a plataforma vault nanocápsulas para entrega provoca CCL21 actividade anti-tumoral com a inibição do crescimento do cancro do pulmão. Vault nanocápsulas CCL21 embalados (CCL21-abóbadas) demonstraram atividade funcional em ensaios de actividade quimiotáticos e apresentadoras de antígenos. cofres recombinantes impactado migração quimiotática das células T e este efeito foi predominantemente CCL21 dependentes como CCL21 neutralização revogada a valorização CCL21 mediada na quimiotaxia. administração intratumoral de CCL21-abóbadas em camundongos com câncer de pulmão aprimorados infiltrados leucocitários (CXCR3

+ T, CCR7

+ T, IFN-y

+ linfócitos T, DEC205

+ DC), o crescimento do tumor do cancro do pulmão inibida e reduziu as frequências de células supressoras [imunes mielóides derivadas de células supressoras (MDSC), células T reguladoras (Treg), IL-10 de células T]. CCL21-abóbadas induziu respostas antitumorais sistêmicos aumentando a actividade lítica de células T do baço contra células tumorais parentais.

Significância

Este estudo demonstra que a nanocápsulas vault pode eficientemente entregar CCL21 para sustentar a actividade anti-tumoral e inibir pulmão o crescimento do câncer. O nanocápsulas vault pode servir como “off the shelf” uma abordagem para entregar citocinas antitumorais para o tratamento de uma ampla gama de doenças malignas

Citation:. Kar Reino Unido, Srivastava MK, Andersson Å, Baratelli F, Huang M, Kickhoefer VA , et ai. (2011) Novel CCL21-Vault nanocápsulas intratumoral Entrega inibe o crescimento do câncer pulmonar. PLoS ONE 6 (5): e18758. doi: 10.1371 /journal.pone.0018758

editor: Siyaram Pandey, da Universidade de Windsor, Canadá |

Recebido: 21 Dezembro, 2010; Aceito: 09 de março de 2011; Publicado em: 03 de maio de 2011

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Universidade da Califórnia Descoberta Grant (para LHR e VAK) um Jonnson Comprehensive Cancer Center Fellowship para UKK) e pela National Institutes of Grants Saúde (SR1 CA95686 e SR1 CA126944), University of California Los Angeles Programa de Cancro do pulmão, Departamento de Veterans Affairs Medical fundos de pesquisa e Tabaco relacionadas doença Programa Award Program, da Universidade da Califórnia (15RT-0207). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos e em todo o mundo [1]. Se atualizado com as formas existentes de tratamento, a sobrevida global a longo prazo é de apenas 15%. Assim, são necessárias novas estratégias terapêuticas. Estamos avaliando um romance nanocápsulas vault como uma prova de conceito para a entrega de citocinas potenciadores do sistema imunológico para um “off the shelf reagente” para a terapia imune base para câncer de pulmão.

Vaults são partículas de ribonucleoproteínas onipresentes citoplasmáticos descritas pela primeira vez em 1986 [2]. abóbadas nativos são 12,9 ± 1 esferas ovóides MDA com dimensões totais de cerca de 40 nm de largura e 70 nm de comprimento [3], [4], presentes nos organismos quase todos os eucariotas que possuam entre 10

4 e 10

7 partículas por célula [5]. Apesar de sua abundância celular, função vault permanece indefinida, apesar de terem sido associada a muitos processos celulares, incluindo a resposta imune inata, resistência a múltiplas drogas em células cancerosas, vias de sinalização multifacetadas e transporte intracelular [6].

Como naturalmente ocorrendo nanocápsulas, a partícula abóbada pode ser uma estrutura ideal para a engenharia de um sistema terapêutico para o composto de encapsulamento, a protecção e entrega. Abóbadas são estruturas altamente estáveis ​​in

in vitro

, e uma série de estudos indicam que as partículas são não-imunogénico [7]. Vaults pode ser projetado e expressos usando um sistema de expressão de baculovírus e proteínas heterólogas podem ser encapsulados dentro destas partículas recombinantes utilizando um domínio de metas de proteína denominada INT para a interação vault. Várias proteínas heterólogas foram fundidos com o domínio INT (por exemplo, proteínas fluorescentes e enzimáticas), e estas proteínas de fusão, quando embalado em cofres recombinantes, que mantenham as características nativas, e, portanto, conferem novas propriedades vault [8], [9].

CCL21 foi identificado como uma quimiocina linfóide que é predominantemente expresso constitutivamente e por vénulas endoteliais elevadas em gânglios linfáticos e placas de Peyer, os vasos linfáticos e células estromais no baço e no apêndice [10]. CCL21 liga-se ao receptor de quimioquinas CCR7 e é um quimioatraente para células maduras dendríticas (DC), células T naive e de memória [11], [12]. Esta quimioquina, juntamente com CCL19, é necessário para a organização do tecido linfóide normal, que é em última análise, essencial para as interacções eficientes célula T-DC. natural killer (NK) e natural killer T (NKT) efetores antitumorais também expressam receptor CCR7 e são quimio atraídos por CCL21. A utilização das quimiocinas CC para atrair, linfócitos, NK e NKT efectores em tumores podem servir como uma estratégia anti-tumoral eficaz. Com base neste conceito, mostrámos previamente que a administração intratumoral de CCL21 recombinante reduz a carga tumoral em modelos de cancro de pulmão de murino [13]. A actividade antitumoral induzida por CCL21 recombinante no entanto necessária alta dosagem frequente e porque as proteínas administradas intratumoral não são mantidas por períodos prolongados localmente. Embora estes estudos delineadas do papel de CCL21 como um agente anti-tumoral eficaz, de alta dose de administração intratumoral frequente é clinicamente limitativo com o potencial de toxicidade sistémica desnecessária. Com base nas limitações desta abordagem, que analisou a utilização de DC para entrega intratumoral CCL21 [14], [15]. Em estudos pré-clínicos que demonstraram que a administração intratumoral de gene modificado CCL21 DC levou a erradicação do tumor em modelos de cancro de pulmão de murino. Seguindo a descrição inicial das actividades antitumorais de CCL21, diversos grupos relataram que CCL21 possui propriedades antitumorais potentes em uma variedade de sistemas de modelo [16], [17], [18], [19], [20]. Em todos os modelos, CCL21 demonstrou regressão potente de tumores, que se mostrou ser dependente de imunidade de células T do hospedeiro.

Baseado em extensa avaliação pré-clínica, começamos um estudo clínico NCI financiado há um ano a avaliação da intratumoral injecção de DC transduzidas com um vector adenoviral que expressa o gene CCL21 (Ad-CCL21-DC) num ensaio clínico de fase I em cancro avançado não-pequenas células do pulmão (NSCLC) [21]. Enquanto os nossos estudos clínicos que utilizam a administração intratumoral de gene modificado CCL21 DC mostra melhorar a resposta imune, a preparação de CCL21 que expressam DC autólogo é pesado, dispendioso e moroso. Um reagente de fora-do-prateleira eficaz iria facilitar a avaliação da terapia à base de quimiocina. No sentido de alcançar este objetivo, estamos avaliando uma abordagem não-DC, que utiliza nanopartículas vault para entrega CCL21 intratumoral com a finalidade de iniciar respostas imunes antitumorais no câncer de pulmão. Prevemos que o uso de nanopartículas vault vai contornar preparação DC autólogo, minimizar o lote a variabilidade do lote e permitir a comparabilidade e padronização. Em adição, nanopartículas vault engenharia para libertar CCL21 pode ser utilizado para tratar uma ampla gama de doenças malignas.

Neste estudo foi avaliado o efeito de abóbada entrega nanocápsulas de CCL21 sobre o crescimento de pulmão de Lewis (3LL) de tumores

in vivo

. Nossas descobertas indicam que uma única administração intratumoral de nanocápsulas CCL21-vault recruta efetores antitumorais, induz potente actividade antitumoral e inibe o crescimento do tumor.

Materiais e Métodos

recombinantes Vaults

A cDNA CCL21 foi fundida na estrutura, quer INT ou mCherry-INT [22]. CCL21 de murino foi amplificado por PCR com os iniciadores: CCL21- GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG para a frente e reversa CCL21- GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG. Para formar mCCL21-mCherry-INT em pFastBac, CCL21 produto de PCR purificado foi digerido com BamH1 e Bgl I e ​​ligado ao BamH1 tratado com fosfatase mCherry-INT pFastBac. CCL21 humana foi amplificado por PCR com os iniciadores: CCL-21 F-SpeI CCCCACTAGTC CAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG, CCL-21-NheI CCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG, INT com NheI CCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA, INT com XhoI GGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA para formar hCCL21-INT. Recombinante (r) baculovírus foram gerados como descrito [7]. As células Sf9 foram infectadas com mCCL21-mCherry-INT, hCCL21-INT ou CP-MVP que codificam baculovírus, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 durante 65 horas. As células infectadas foram preparadas como descrito [7]. Os lisados ​​contendo CP-MVP abóbada foram misturados com lisados ​​contendo mCCL21-mCherry-INT ou hCCL21-int e foram incubadas em gelo durante 30 min para permitir que as proteínas de fusão INT para embalar no interior de abóbadas. Vault foram purificados como descrito [8], ressuspendidas em PBS estéril e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA (Bio-Rad, CA). a integridade da amostra foi analisada por microscopia electrónica de mancha negativa ou coloração com Coomassie de SDS-PAGE seguido por análise de transferência de Western. proteína CCL21-INT no cofre foi quantificada por análise densitométrica de borrões ocidentais contra purificado proteína recombinante INT como padrão.

Os anticorpos

Os anticorpos primários para análises de Western blot foram coelho anti-MVP anticorpo (1 diluição /1000) [23] ou o anticorpo de coelho anti-VPARP (diluição 1/500) [24] e secundário de cabra anti-coelho HRP-anticorpo (diluição 1:2000) (Amersham). A CCL21 e CXCR3 (220,803) mAb eram de R D, (Minneapolis, MN), a imunocoloração CD3 mAb primário foi da Dako (Cytomation, Carpinteria, CA, EUA). FlTC, PE, APC, PerCP ou PerCP-Cy7 conjugado mAb anti-rato a CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7) e anticorpo de controlo de isotipo foram da BD Biosciences (San Diego, CA), mAb para detectar Tregs com CD4 (GK1.5), CD25 (PC61), intranuclear Foxp3 (FJK-16) IL-10 (JES5-16E3), IFNy (XMG1.2), DEC205 (205yekta), CCR7 ( 4B12) e EpCam (G8.8) eram de eBioscience (San Diego, CA), mAb CD11b (M1 /70), Gr1 (RB6-8C5), eram de BioLegend (San Diego). o corante de Bradford proteína de quantificação foi de Sigma.

Ensaio de Quimiotaxia

ensaios de quimiotaxia foram realizados utilizando placas de 24 poços com 3 uM de tamanho dos poros inserções (Costar /Corning, Corning, Nova Iorque), de acordo com o as instruções do fabricante. 2,0 × 10

5 células T2 em meio isento de soro foram carregados na câmara superior. 200 ng /ml de CCL21-mCherry-INT /abóbada, 600 ng /ml rCCL21 (R D), 200 ng /ml CCL21-mCherry-INT vault /CP-MVP com anticorpo neutralizante CCL21 (5 ug /ml), 600 ng /ml com anticorpo CCL21 CCL21 (5 ug /ml) foram adicionados às câmaras inferiores. Após 2 horas de incubação, as células migradas foram enumeradas por FACS.

processamento e apresentação de antigénios ensaio

DC2.4 (5 × 10

4C /poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços com proteína OVA (350 ng /ml), linha de células T CD8 B3Z (10

5c /poço), na presença de abóbadas de controlo (200 ng /ml) ou mCCL21-abóbadas (200 ng /ml) ou rCCL21 (200 ng /ml) durante 24 horas. Para determinar o impacto da actividade de APC em CCL21, CCL21 foi neutralizada com anti-CCL21 Ab (5 ug /ml). A IL-2 segregada pelas células T CD8 + activadas foi quantificada por ELISA (eBioscience).

cultura celular

A linha de células de carcinoma de pulmão de Lewis (3LL) foi obtido a partir de ATCC (Manassas, VA) e foi cultivado como descrito [25]. A linha celular estava livre micoplasma e utilizado antes da décima passagem

Tumorigênese Modelo

isentos de agentes patogénicos C57BL /6 ou UBC-GFP /BL6 (6-8 semanas de idade; Jackson Laboratory). foram mantidos no biotério Veterans Affairs Pesquisa animal de acordo com as diretrizes da junta de revisão de animais da instituição. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com o cuidado Veterans Affairs Institucional Animal e diretrizes de uso das Comissões: id A3002-01. O conselho de revisão institucional aprovou todos os estudos que envolvam animais neste manuscrito. Animais que apresentem sinais de dor ou que preencham os critérios de endpoint foram sacrificados imediatamente de acordo com o protocolo da instituição com base aceitos. células tumorais 3LL (1,5 × 10

5) foram injetados

s.c

. na zona supra-escapular direita de ratinhos. Os ratinhos portadores de tumores estabelecidos com 9 dias de idade foram tratados com uma única injecção intratumoral de mCCL21-mCherry-INT /abóbadas CP-MVP (200 ng), abóbadas CP- MVP (200 ng) em 200 ul NS ou diluentes. Os volumes de tumor foram monitorizados e calculado como descrito [25]. Para determinar os linfócitos infiltrantes nos tumores, os ratinhos UBC-GFP /BL6 com tumores de 9 dias foram tratados e 7 dias após o tratamento, os tumores não necróticas foram isoladas e congeladas em outubro O tecido congelado foi seccionado, fixo e contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e observados sob um 1 × 71 Olympus microscópio de fluorescência. As imagens foram obtidas usando o programa Image Pro.

modelo ortotópico

células

3LL-GFP (5 × 10

3) foram implantados no pulmão esquerdo, tal como descrito [25]. Uma semana após a inoculação do tumor, os ratos foram tratados com diluente, abóbadas de controle ou mCCL21-abóbadas

via

injecção transtorácica. Quatro semanas após a implantação do tumor, os pulmões foram retirados para avaliação da carga tumoral e infiltrados leucocitários como descrito [25].

Imunomarcação

Tumores seção foram preparadas de acordo com o protocolo padrão [26]. As lâminas foram incubadas com anticorpo primário (CD3 1:200) durante a noite a 4 ° C, lavadas e incubadas com biotinilado secundário. As lâminas foram desenvolvidas com o kit Vectastain ABC-AP e solução de substrato Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina.

Citometria de Fluxo

FACs análises foi realizada para CD3, CD4, CD8, CCR7, CD11b, Gr1, DEC205, CD25, FOXP3, CXCR3 e células T intracitoplasmática de IFN-y e IL-10 em uma suspensão de células de tumor de pulmão único, como descrito [25].

célula citólise T

esplênica T lise de linfócitos foi avaliado contra células de melanoma 3LL autólogo e B16 controle, como descrito [25] .

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando testes t ou Mann-Whitney. Todas as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad PRISM 5 software.

Resultados

CCL21 embalagem em cofres recombinantes

Várias proteínas exógenas foram embalados dentro de cofres recombinantes (luciferase, verde fluorescente proteína, proteína fluorescente mCherry, proteína de adenovirus VI, e a principal proteína da membrana externa de Chlamydia) quando fundido com um domínio de 162 aminoácidos de direccionamento abóbada (INT) derivado da proteína associada a abóbada (VPARP, aminoácidos 1563-1724). Estas proteínas de fusão ligam-se com elevada afinidade para o interior da partícula de abóbada, são protegidos contra o ambiente externo, e mantêm as suas propriedades nativas, conferindo assim novas características nas partículas vault recombinantes [7], [9], [22]. A CCL21 quimiocina rato foi fundido com int para criar uma proteína de fusão CCL21 (mCCL21-INT) que pode ser empacotado dentro de abóbadas recombinantes. A mistura de lisados ​​contendo recombinante CCL21-int e MVP rato gerados em células Sf-9 permitiu a formação de um complexo macromolecular abóbada contendo a proteína de fusão CCL21 que poderia ser isolado por ultracentrifugação em gradiente de densidade. Os cofres purificadas continham ambos MVP bem como CCL21-INT (daqui em diante referido como CCL21-abóbadas) como indicado por tingimento e análises de imunotransferência de Coomassie (Fig. 1). Para estes estudos foram preparados três diferentes cofres. Um deles foi empacotado com CCL21 rato fundido com a proteína fluorescente mCherry-INT (mCCL21-mCherry-INT cofres /CP-MVP, abreviado aqui mCCL21-abóbadas), um segundo vault foi empacotado com humano CCL21-INT (hCCL21-INT /CP- abóbadas MVP, abreviado aqui hCCL21-abóbadas) eo terceiro era um controle vault vazio (abóbadas CP-MVP [27]) (Fig. 1A e B). Estimou-se a quantidade de CCL21 embalados dentro dos cofres por Western blot quantitativos. A nossa análise indicaram que 20-30 moléculas de proteína CCL21-INT foram embalados em cada partícula CCL21 da abóbada. Isto é consistente com a nossa experiência anterior em embalagens múltiplas cópias de outras proteínas de fusão recombinantes abóbadas int em [22]. Com uma estimativa de 20-30 proteínas CCL21-int por abóbada, é provável que este está em ou perto de um nível de saturação para a embalagem de tamanho desta proteína. Os CCL21-abóbadas também exibiu um perfil de sedimentação muito semelhante em gradientes de sacarose como partículas vault contendo o domínio INT fundido com luciferase, [7], [9], [22] o que sugere que a incorporação de CCL21-INT não influenciar a estrutura normal de partículas vault recombinantes. Para verificar isso, examinamos complexos vault purificado por microscopia eletrônica de transmissão coloração negativa (Fig. 1C). Os CCL21-abóbadas exibiu a morfologia em forma de barril característica de abóbadas, de acordo com a morfologia previamente estabelecido de abóbadas contendo proteínas de fusão recombinante-INT [9], [27].

A. Mancha de Coomassie de abóbadas purificados fraccionados num 4-16% de SDS-PAGE. Pista 1, marcadores de peso molecular. Pista 2, abóbadas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP. A banda de 97 kDa MVP é indicado pela seta. Pista 3, abóbadas hCCL21-INT /CP-MVP. Pista 4, CP-MVP abóbadas. B. análises de transferência de Western de abóbadas purificado para confirmar as presenças de MVP ou as proteínas de fusão indicados INT (setas). Pista 1, abóbadas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-MVP. Pista 2, abóbadas mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-INT. Pista 3, abóbadas hCCL21-INT /CP-MVP foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-INT. C. micrografias eletrônicas Negative-manchados de abóbadas purificada. abóbadas CP-MVP (à esquerda), mCCL21-mCherry-INT /CP-MVP abóbadas (centro), hCCL21-INT /abóbadas CP-MVP (direita).

CCL21-abóbadas são biologicamente ativos e induzir a migração de células T2 e aumentar a actividade de APC DC

Um ensaio de quimiotaxia foi usada para determinar se CCL21 retém a função biológica, quando embalado nas abóbadas recombinantes. A actividade quimiotáctica de CCL21 é mediada por meio de seu receptor CCR7 para induzir a migração de células T e DC. Para avaliar a actividade biológica de CCL21 no cofre, utilizou-se células de hibridoma que expressam constitutivamente T2 CCR7. Dois diferentes concentrações de CCL21-abóbadas (200 ng e 600 ng), abóbadas vazios (600 ng), e CCL21 recombinante (600 ng) foram colocados na câmara inferior de um de 24 cavidades placas Transwell e 2 × 10

5 as células T2 foram adicionadas à câmara superior. O número de células que migraram para a câmara inferior foi determinada por citometria de fluxo e representados como% de migração (Fig. 2A). Mais do que 7,5% das células T2 respondeu a 200 ng de mCCL21-abóbadas em comparação com ≤2.5% das células T2 incubadas com 600 ng de CCL21 recombinante. Isto é uma resposta potente, considerando que a concentração observado acima é para CCL21-abóbadas e a concentração real de CCL21 nos cofres é estimada para ser ≤20 ng. O aumento da bioactividade da mCCL21-abóbadas pode ser devido a um aumento da estabilização da CCL21 resultantes de uma embalagem da proteína para o meio ambiente protector do lúmen vault. Como a proteína de fusão associados não-covalente dentro de cofres, a respiração vault em solução pode liberar CCL21 de uma forma gradiente. Assim, o número de células que migram em resposta a mCCL21-abóbadas foi maior do que o CCL21 recombinante porque um gradiente abrupto é formado. Para determinar se a migração de células T2 foi dependente de CCL21, um anticorpo neutralizante anti-CCL21 foi utilizado para bloquear a actividade quimiotáctica de ambos CCL21 recombinante e mCCL21-abóbadas. O anti-CCL21 bloqueado mCCL21-abóbada actividade funcional indicando actividade quimiotáctica de uma forma específica CCL21 (Fig. 2A). O impacto da mCCL21-abóbadas sobre a atividade DC APC foi avaliada

in vitro

. Em comparação com o controlo abóbadas, mCCL21-abóbadas aumentada capacidade de DC para processar e apresentar ovalbumina e activar as células T CD8 a secretar IL-2. Neutralização de CCL21 revogada o aumento na actividade de APC DC para controlar os níveis (Fig. 2B). Resultados semelhantes foram observados com hCCL21-abóbadas sobre a actividade de APC DC (dados não mostrados).

. CCL21-abóbadas aumento da migração de células T2. 2,0 × 10

5 células T2 foram plaqueadas em meio isento de soro na câmara superior. mCCL21-mCherry-INT /abóbadas CP-MVP (200 ng /mL ou 600 ng /ml), CCL21 recombinante (600 ng /ml), abóbadas de controlo (CP-MVP abóbadas 600 ng /ml) ou anticorpo neutralizante anti-CCL21 recombinante (5 ug /ml) foram adicionados à câmara inferior dos poços. Após 2 horas de incubação, a migração de células T2 foram analisadas por citometria de fluxo. mCCL21-abóbadas efetivamente aumentou a migração T2, em comparação com o controle. Anti-CCL21 neutralizar Ab para CCL21 revogou o aumento da migração T2 sugerindo que CCL21 no cofre predominantemente mediar a migração quimiotática das células T2. Os dados do painel são representativos de 2 experiências independentes. bares; Média ± SEM, * p 0,05 entre os mCCL21-abóbadas e abóbadas de controlo ou os grupos de tratamento de anticorpo anti-CCL21. B. mCCL21-abóbadas actividade melhorada DC APC e bloqueando CCL21 inverteu o aumento na actividade de APC. células B3Z (1 × 10

5 células /200 ul /poço) foram co-cultivadas com DC 2,4 (5 × 10

4 células /200 uL /​​poço) e ovalbumina (350 ug /ml) na presença ou ausência de mCCL21-abóbadas (200 ng /ml) e anticorpo anti-CCL21 (5 ug /ml) ou anticorpo de controlo (5 ug /ml de IgG de cabra) durante 24 horas. abóbadas de controlo foram utilizados a uma concentração de 200 ng /ml. estado de activação das células T foi medida por produção de IL-2 por ELISA. Os dados são representativos de 2 expericias independentes. bares; A média ± SEM, * p . 0,05 entre as mCCL21-cofres e abóbadas de controle ou os grupos de tratamento anticorpo anti-CCL21

CCL21-abóbadas melhorar o recrutamento de infiltrados leucocitários e inibir o crescimento de tumores 3LL

Foi determinada a atividade antitumoral do mCCL21-abóbadas no tumor 3LL estabelecida

in vivo

. Uma injecção intra-tumoral única de mCCL21-abóbadas (200 ng) levou à diminuição significativa no crescimento do tumor em comparação com abóbadas vazios (Fig. 3a). O grupo de tratamento mCCL21-vault se observado aumento na infiltrados leucocitários intratumorais em comparação com abóbadas de controle (Fig. 3B) e coloração imunológica demonstrou que os infiltrados foram predominantemente CD3 expressando células T (Fig. 3C parte inferior do painel da direita). A eficácia antitumoral da mCCL21-abóbadas foi determinada no modelo de cancro pulmonar 3LL ortotópico estabelecida de 7 dias. mCCL21-abóbadas carga tumoral inibido por 7 vezes em comparação com os controlos (Fig. 4A-B). No controle de grupos de tratamento (diluentes ou abóbada de controlo), foram 7-9% de diminuição no peso corporal médio no final do período experimental, mas sem alteração significativa de peso foi observado no grupo de tratamento CCL21 da abóbada. Uma avaliação das populações leucocitária intratumorais se observado aumento na frequência de CD4, CD8, CD3 CXCR3, CD3 CCR7 e DEC205 mas freqüência de MDSC e Tregs (Fig. 4C) reduzida.

A. CCL21-abóbadas inibiu o crescimento do tumor e maior de células T intratumoral infiltra no câncer de pulmão. C57BL /6 ratos portadores de 9 dias 3LL tumores estabelecidos (

s.c.

) Foram tratados intratumoral com abóbadas de controle (200 ng), mCCL21-abóbadas (200 ng) ou diluente solução salina normal (NS). diâmetros tumorais bisecting foram medidos com compassos. B-C. mCCL21-abóbadas aumento do influxo de células T CD3 expressar no tumor, em comparação com o controle de abóbadas. camundongos UBC-GFP /BL6 com tumores estabelecidos 9 dias foram tratados intratumoral com abóbadas de controle ou mCCL21-abóbadas. Outubro tecido congelado foi seccionado, fixados em lâminas e contrastadas com o corante nuclear DAPI (azul). Os tumores de controlo (

painel superior

) demonstram fluorescência muito limitado verde (células da infiltração), sob uma visão de alta potência (ampliação, × 400). A maioria das células fluorescentes verdes são grandes células estromais poligonais, enquanto as células tumorais são contrastadas azul por DAPI. coloração imunológica de células T mostra muito poucos CD3 expressar linfócitos T (painel superior direito). Em contraste, os linfócitos infiltrantes tumorais proeminentes, pequenas células fluorescentes verdes redondos são evidentes nos tumores dos ratinhos tratados com mCCL21-vault (seta,

painel inferior

). coloração imunológica de células T mostra que os infiltrados são CD3 expressando células T (canto inferior direito). Dados; A média ± SEM, * p 0,05 entre mCCL21-vault e grupo controle, n = 10 ratinhos /grupo

5 × 10

3 células tumorais 3LL-GFP foram injetados no pulmão esquerdo. por via transtorácica. Uma semana após as injecções de tumor, os ratinhos foram tratados com diluente (NS), abóbadas de controlo (2 ug) ou mCCL21-abóbadas (2 ug) por via transtorácica no pulmão esquerdo. implantação de tumor Dia 28 pós, os pulmões foram retirados para a análise da carga tumoral e infiltração leucocitária. A. H E a coloração de secções de tumor de pulmão de diluente ou de controlo mostraram um aumento abóbadas massas de tumor (massa de tumor representado pela seta painel de topo e se infiltra painel inferior direito) em comparação com a massa tumoral reduzida no grupo de tratamento CCL21 da abóbada. B. Carga tumoral foi calculado em percentagem total de células de tumor que expressam GFP e EpCAM no total Digest pulmão. pulmonar Naïve foi utilizado como controle para configurar o portão. tratamento CCL21-vault reduziu o crescimento do tumor. C. CCL21-abóbadas aumentada CD4, CD8, CXCR3

+ CD3

+ T, CCR7

+ CD3

+ T e DEC205

+ DC infiltra e tinha reduzido frequências de MDSC e Tregs. D-E. Os ratos tratados CCL21-vault tinha aumentado tumor infiltra com alta de IFN-y, mas reduziu IL-10 expressando células T em relação aos controles. F. tratamento CCL21-vault reforçada a actividade citolítica de células T esplénicas purificadas contra tumores 3LL parentais

in vitro

(E:T de 20:01 e 40:1). As barras de dados, a média ± SEM, * p 0,05 entre CCL21-abóbadas e grupos vault controle, n = 10 ratinhos /grupo

CCL21-abóbadas aumentar tumor infiltrando células T com aumentada de IFN-y, mas reduziu IL. -10 e aumentar a actividade citolítica das células T sistémica

T tumor linfóide se infiltra a partir de ratinhos tratados mCCL21-abóbada tinha aumentado intracitoplasmática de IFNy e IL-10 reduzida (Fig. 4D-e). Intratumoral mCCL21-abóbadas atividade imunológica antitumoral sistêmica induzida:. Células T do baço de ratinhos tratados mCCL21-vault tinha aumentado atividade lítica contra células tumorais parentais

in vitro

(Fig. 4F)

Discussão

Nós temos mostrado previamente que o gene CCL21 ou CCL21 recombinante intratumoral modificada DC induzir uma redução tumor dependente de células T em modelos de murino de câncer de pulmão [13], [14], [15], [28], [29]. Baseado em extensa de modelagem pré-clínico, convertemos nossa abordagem DC-AdCCL21 intratumoral para tratar o câncer de pulmão avançado estágio numa fase I de ensaios clínicos. Embora os resultados iniciais deste estudo sugerem melhorar a resposta imune, estamos avaliando mecanismos de entrega CCL21 que evitará a necessidade de isolar e autólogo cultura DC. Para este fim, avaliou nanocápsulas CCL21-vault como um “off the shelf” plataforma terapêutica contra o crescimento do tumor

in vivo

utilizando o modelo de câncer de 3LL bem caracterizado. Nosso racional para a administração de nanocápsulas CCL21-vault intratumorais é promover o recrutamento de linfócitos T e CC no microambiente do tumor para uma atividade antitumoral robusto.

Como um não-imunogênica, nanoescala de ocorrência natural, à base de proteínas cápsula, a partícula de abóbada tem o potencial de servir como um veículo de entrega terapêutica flexível. Engineered no sistema de baculovirus, as partículas auto-monta a partir de uma única proteína expressa que pode ser modificado para permitir direccionamento celular, endocitose específica e penetração do endossoma [7], [8], [9], [30]. As proteínas e péptidos fundidos a um domínio de direccionamento abóbada são embaladas em partícula, protegido do ambiente externo e liberta lentamente. Este é o primeiro estudo para descrever essa nanocápsulas vault podem ser projetados para embalar e manter CCL21 biologicamente ativo. Os nossos resultados demonstram que, embora abóbadas vazios e rCCL21 são cada quimiotáctica, o empacotamento do quimiocina em abóbada sinergicamente aumentada migração de células T, sugerindo que a libertação sustentada de CCL21 pela partícula abóbada pode estabelecer um gradiente quimiotática íngreme. anticorpos neutralizantes para CCL21 revogada a atividade quimiotática da CCL21-vault demonstrando que a actividade quimiotáctica foi predominantemente CCL21 dependente. Com base nos resultados das experiências quimiotácticos, foi avaliado o impacto do CCL21-abóbadas na actividade da APC DC. CCL21-abóbadas aumentada atividade DC APC e neutralização de CCL21 revogada essa atividade. Em comparação com rCCL21, CCL21-abóbadas estimulou a atividade DC APC para níveis superiores a um décimo da concentração de rCCL21, sugerindo uma maior afinidade DC para o nanocápsulas CCL21-vault.

Com base em nossa

in vitro

descobertas, CCL21-abóbadas foram avaliadas em um modelo de cancro do pulmão terapêutica

in vivo

. Os nossos resultados demonstram que a concepção abóbada é eficaz em inibir o crescimento de tumores estabelecidos. Uma injecção intra-tumoral única de CCL21-abóbadas levou a uma inibição significativa no crescimento do tumor em comparação com os controlos. Os nossos dados sugerem que a formulação CCL21-abóbada é tão eficaz em comparação com as doses elevadas de frequentes rCCL21 [13]. Em ambos os modelos de tumor de pulmão subcutâneos e ortotópicos a terapia CCL21-vault foi administrado intratumoral. Em estudos futuros ao avaliar a eficácia de rotas nanocaspsules vault de vacinação específicas de antígeno tumoral nas configurações de proteção e terapêuticas que incluem

iv

ou

ip

rotas de entrega, as mudanças no plasma /nível das transaminases séricas será quantificados para efeitos vault na função hepática. Embora no ensaio de migração, as abóbadas de controlo demonstrou uma actividade quimiotáctica, abóbadas de controlo não afectou o crescimento do tumor em comparação com o grupo de tratamento diluentes. Isto sugere que CCL21 é o componente crítico no nanocápsulas abóbada para a indução da actividade antitumoral. Em trabalhos futuros que vai exibir tanto as proteínas pró-apoptóticos e anti-apoptóticos nos tumores para determinar mudanças na resposta à terapia nanocápsulas CCL21-vault para explorar mecanicamente os programas apoptóticos induzidos por esta terapia.

In vivo

, CCL21 contendo abóbadas humanos foram tão eficazes como a CCL21 murina-abóbada na redução do crescimento do tumor 3LL (dados não mostrados). Em comparação aos controles, tratamento CCL21-vault resultou em tumor extensa T e DC infiltrados leucocitários.