tem uma exigência de ferro e muitos estudos experimentais, bem como clínica ensaios, demonstraram que quelantes de ferro são potenciais agentes anti-câncer. O ligando, 2-benzo�piridina 4-etil-3-tio-semicarbazona (Bp4eT), demonstra ambas as propriedades anti-neoplásicos e anti-retrovirais potentes. Neste estudo, Bp4eT e sua amidrazona recentemente identificada e metabolitos semicarbazona foram examinados e comparados em relação à sua actividade anti-proliferativa contra células cancerosas (HL-60 de leucemia humana promielocítica, MCF-7 de adenocarcinoma da mama humano, carcinoma do cólon humano HCT-116 e A549 humanas adenocarcinoma de pulmão), as células não-cancerosas (H9c2 cardiomyoblasts derivadas de ratos neonatos e fibroblastos 3T3 de embrião de ratinho) e sua interação com piscinas de ferro intracelulares. Bp4eT foi demonstrado ser um agente anti-neoplásico altamente potente e selectivo que induz a paragem na fase S do ciclo celular, despolarização mitocondrial e apoptose em células MCF-7. Ambos os semicarbazona e amidrazona metabolitos mostraram pelo menos uma diminuição de 300 vezes na actividade citotóxica do que Bp4eT em direcção tanto do cancro e linhas de células normais. Os metabólitos também perdeu a capacidade de:

(1)

promover o ciclismo redox de ferro;

(2)

ligar e mobilizar ferro a partir de pools intracelulares instáveis; e

(3)

evitar

captação 59Fe de

transferrina 59Fe marcado por células MCF-7. Assim, este estudo demonstra que o ligando altamente activo, Bp4eT, é metabolizado para análogos não-tóxicas e farmacologicamente inactivas, o que mais provavelmente contribuem para o seu perfil farmacológico favorável. Estes resultados são importantes para o futuro desenvolvimento desta droga candidatos e contribuir para o entendimento das relações destes agentes estrutura-actividade

Citation:. Potůčková E, Roh J, Macháček M, Sahni S, Stariat J, Šesták V, et al. (2015)

In Vitro

Caracterização das propriedades farmacológicas dos Anti-Cancer quelante, Bp4eT, e sua fase I metabolitos. PLoS ONE 10 (10): e0139929. doi: 10.1371 /journal.pone.0139929

editor: Ashley I. Bush, da Universidade de Melbourne, na Austrália

Recebido: 01 de junho de 2015; Aceito: 19 de setembro de 2015; Publicação: 13 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Potůčková et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este estudo foi apoiado pela Fundação científica checa (concessão 13-15008S; www.gacr.cz).. D.R.R. graças Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália por um Diretor Sênior Research Fellowship e de receber subvenções. DSK apreciado um NHMRC RD Wright Training Fellowship e uma subvenção de projecto (www.nhmrc.gov.au)

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o ferro é um cofactor essencial para a actividade de muitas enzimas cruciais para a proliferação celular, incluindo a ribonucleótido-redutase, que catalisa o passo limitante da velocidade na síntese do ADN [1]. Como as células de cancro são geralmente metabolicamente mais activos do que as suas contrapartes normais, eles necessitam de maiores quantidades de ferro [2]. Assim, a segmentação de ferro nas células cancerosas, utilizando agentes quelantes específicos é uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes anti-cancro [3]. A classe tiossemicarbazona de quelantes de ferro têm mostrado alta eficiência anti-neoplásica, tanto

in vitro

e

in vivo

estudos e alguns agentes também estão em fase I e II ensaios clínicos [4,5, 6,7].

O ligando, 2-benzo�piridina 4-etil-3-tio-semicarbazona (Bp4eT, Figura 1), foi inicialmente sintetizado e caracterizado por West

et ai. [8]. Foi mais tarde demonstrado ser um quelante de ferro, que possuía um ponto baixo, Fe positiva

3 + /2 + potencial redox [9], o que resultou na formação de espécies tóxicas de oxigénio reactivas (ROS), tanto em solução [9] e em células do cancro [10]. Na verdade, Bp4eT mostraram alta actividade anti-proliferativa contra células neuroepithelioma SK-N-MC humanas com baixa toxicidade para células MRC-5 de fibroblastos humanos normais [10]. Para além da sua actividade anti-cancro, Bp4eT mostraram inibição potente da transcrição de HIV-1 com uma eficácia comparável à de um clinicamente utilizado anti-retroviral agente, roscovitin, e exibiu baixa citotoxicidade na linha celular de célula T humana de linfoblastos semelhante, CCRF- . CEM [11]

Bp4eT, 2-benzo�piridina 4-etil-3-tio-semicarbazona; Bp4eA;

N

3

-etil

N

1 | – [fenil (piridina-2-il) metileno] formamidrazone; Bp4eS, 2-benzo�piridina 4-ethylsemicarbazone.

Em termos de sua farmacocinética, Bp4eT foi mostrado para permear facilmente monocamadas confluentes de células Caco-2, com características de permeabilidade semelhantes aos medicamentos comuns administrados por via oral, indicando a biodisponibilidade por esta via terapêutica [12,13]. Merlot

et al

. revelou que a captação celular de

14C-Bp4eT em células neuroepithelioma SK-N-MC foi mediada por difusão passiva e que o complexo de Fe-Bp4eT foi sequestrado no interior das células para uma extensão maior do que a do ligando livre Bp4eT [14,15 ]. Estudos adicionais revelaram que

Bp4eT foi excretada rapidamente a partir de camundongos

via

urina e foi excretada mais lentamente

via

as fezes, com os principais locais de

14C marcado com 14C Bp4eT deposição sendo os órgãos associados com a excreção

e

.

g

., vesícula, intestino delgado e intestino grosso [15].

O metabolismo e farmacocinética de Bp4eT foi ainda mais estudado em ratos, utilizando um método LC-MS sensível [16,17,18]. Em primeiro lugar, foi demonstrado que Bp4eT existia como uma mistura de dois interconversíveis

E

e

Z

isômeros em ambos os meios aquosos e plasma, enquanto o

Z

forma foi predominante em estado sólido [16,17,18]. Em segundo lugar, Bp4eT foi mostrado sofrer metabolismo

via

oxidação do seu radical tiocarbonilo tanto

in vitro

e

in vivo

, resultando na geração do análogo semicarbazona (2- benzo�piridina 4-ethylsemicarbazone; Bp4eS, Figura 1) e o derivado de amidrazona (

N

3

-ethyl-

N

1

-[phenyl(pyridin-2-yl)methylene]formamidrazone; Bp4eA, figura 1) [17]. O metabolito hidroxilado amidrazona foi ainda

In vivo

, mas a localização específica do grupo hidroxilo no anel de fenilo não puderam ser identificados [17].

O metabolito Bp4eS foi detectado como dois

E

/

Z

isómeros que foram, em contraste com o composto parental, não interconvertíveis [18]. investigações farmacocinéticas revelou que, após a administração intravenosa de Bp4eT, a exposição de ratos a do metabolito, Bp4eS, foi apenas pequenas em relação ao Bp4eT [18]. Pelo contrário, a conversão metabólica de Bp4eT administrada ao metabolito Bp4eA parecia ser uma biotransformação importante, pois a exposição era de 20% do que o composto original de [18].

Examinar as propriedades biológicas de metabolitos de drogas é um passo importante no desenvolvimento farmacêutico, como os metabolitos podem contribuir significativamente para as propriedades farmacológicas da droga original [19,20] e pode também ser de interesse para a descoberta de drogas. Assim, para melhor caracterizar Bp4eT como candidato droga promissora, avaliamos a

in vitro

atividades citotóxicos de si Bp4eT e seus dois metabolitos principais, Bp4eA e Bp4eS, em quatro linhas de células cancerosas humanas e duas células não-cancerosas linhas. Como agentes quelantes de ferro é um elemento chave no mecanismo de acção do Bp4eT, examinamos a capacidade de Bp4eT e seus metabolitos, para:

(I) ligam-se

ferro a partir da piscina de ferro lábil (LIP) de células cancerosas;

(ii)

mobilizar celular

59Fe; e

(iii)

impedir a captação celular de

59Fe de

59Fe

2-transferrina. A capacidade dos complexos de ferro de Bp4eT e seus metabolitos para promover a formação de ROS também foi investigada usando o ensaio de oxidação de ascorbato. Além disso, também foram determinadas a progressão do ciclo celular e o modo de morte celular após a sua exposição a Bp4eT e seus metabólitos.

Materiais e Métodos

Chemicals

Bp4eT foi sintetizado de acordo com a Kalinowski

et al

. [9] e os seus metabolitos foram sintetizados como descrito por Stariat

et ai. [17,18]. Componentes para vários tampões e outros produtos químicos (

e

.

g

., Vários sais de ferro) foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) ou Penta (Praga, República Tcheca República) e eram as de maior farmacêutica ou grau analítico disponível

cultura celular

a linha de células de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 foi adquirido da European Collection of Cell Cultures (ECACC;. Salisbury, REINO UNIDO). As células humanas HL-60 leucemia promielocítica, células de carcinoma HCT116 colorectais humanos, as células do adenocarcinoma A549 do pulmão humano, a linha H9c2 celular, derivada de tecido de coração de rato embrionário, e 3T3 de ratinho fibroblastos de embrião foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). O MCF-7, HCT116, A549, 3T3 e H9c2 tipos de células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Lonza, Basileia, Suíça). No caso de células MCF-7, foi utilizado meio DMEM sem vermelho de fenol. DMEM foi suplementado com 10% de soro (v /v) inactivado pelo calor fetal bovino (FBS; Lonza), 1% de penicilina /estreptomicina solução (Lonza) e tampão HEPES 10 mM (pH 7,0-7,6; Sigma-Aldrich). A linha celular HL-60 foi mantida em meio RPMI (Sigma-Aldrich) suplementado com-inactivado pelo calor 10% de FBS e 1% de solução de penicilina /estreptomicina. Todas as linhas celulares foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura de tecido (TPP, Trasadingen, Suiça) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. células aderentes sub-confluentes, ou a suspensão de células HL-60, foram sub-cultivadas a cada 3-4 dias.

estudos de citotoxicidade

Para as experiências de citotoxicidade, as células de cancro foram semeadas a uma densidade de 5.000 (MCF-7), 10,000 (HL-60) ou 2000 células /poço (HCT116 e A549) em placas de 96 poços (TPP) durante 24 h /37 ° C antes da adição de agentes examinados. As células não cancerosas, as células 3T3 e H9c2, foram cultivadas durante 24 h /37 ° C em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células /poço, o meio foi depois mudado para sérica e DMEM isento de piruvato (Sigma- Aldrich) e incubados com as células durante mais 24 h /37 ° C. Os efeitos citotóxicos de Bp4eT e dos seus metabolitos foram avaliados em diferentes concentrações, após uma incubação de 72 h C /37 °. A fim de auxiliar a dissolução dos ligandos lipofílicos, 0,1% de sulfóxido de dimetilo (v /v) (DMSO, Sigma-Aldrich) estava presente no meio de cultura de todos os grupos. A esta concentração, DMSO não teve qualquer efeito sobre a proliferação celular ou a viabilidade.

A viabilidade das células foi determinada utilizando um ensaio de MTT (Sigma-Aldrich) de acordo com métodos previamente estabelecidos [21,22]. A densidade óptica de MTT solúvel foi medida a λ = 570 nm, subtraindo-se o fundo λ = 690 nm, utilizando um leitor de placas Tecan Infinito 200M (Tecan Group, Männedorf, Suíça). A viabilidade ou a proliferação de grupos experimentais foi expressa como uma porcentagem dos controles não tratados (100%).

ensaio de calceína-AM para avaliação da taxa de permeação da membrana celular e acesso à piscina de ferro lábil

Estes experimentos foram realizados de acordo com Glickstein

et al

. [23] com ligeiras modificações. As células MCF-7 foram semeadas em placas de 96 poços (10000 células /poço) e deixadas a aderir durante 24 h /37 ° C. As células foram carregadas com ferro utilizando o doador celular de ferro, citrato de amónio férrico (530 ug /ml) [24], 24 h antes da experiência, e em seguida, lavou-se. Para evitar a interferência potencial, especialmente no que diz respeito aos vários oligoelementos, o meio foi substituído com tampão de ADS (preparado utilizando água Millipore suplementado com NaCl 116 mM, KCl 5,3 mM, CaCl 1 mM

2, MgSO 1,2 mM

4 , 1,13 mM NaH

2 PO?

4, 5 mM de D-glicose e 20 mM de HEPES, pH 7,4). As células foram, em seguida, carregado com 2 | iM do éster de acetoximetilo calceína verde célula-permeável (calceína-AM; Molecular Probes, Oregon, EUA) durante 30 min /37 ° C e lavadas. esterases celulares clivar os grupos acetoximetilo, para formar o composto da membrana impermeável célula, calceína verde [23]. A fluorescência de verde calceína é extinta por ferro [23] vinculativo. A fluorescência intracelular (λ

ex = 488 nm; λ

em = 530 nm) de verde calceína foi seguida como uma função de tempo (10 min após a adição de 10 uM Bp4eT ou seus metabolitos), a 37 ° C utilizando o leitor de placas Tecan Infinito 200M. A eficácia de quelação de ferro dos metabolitos nas células foi expresso como uma percentagem da eficácia do quelante de pai, Bp4eT (100%).

Preparação de

59Fe

2-transferrina

transferrina humana (Sigma) foi marcado com

56Fe ou

59Fe (PerkinElmer, Massachusetts, EUA) para produzir

56Fe

2-transferrina ou

59Fe

2-transferrina (

59Fe

2-TF), respectivamente, com uma actividade específica final de 500 pCi /pmol Fe, como descrito anteriormente [24,25]. Não consolidado

59Fe foi removido por diálise exaustiva vácuo contra um grande excesso de NaCl 0,15 M tamponado a pH 7,4 com 1,4% de NaHCO

3 por métodos padrão [24,25].

O efeito de Bp4eT e os seus metabolitos na mobilização celular

59Fe.

para examinar a capacidade dos compostos estudados para mobilizar celular

59Fe a partir de células MCF-7, as experiências de efluxo de ferro foram realizadas utilizando técnicas estabelecidas [21,22] . Em resumo, após a pré-rotulagem confluentes células em placas de 6 poços com 0,75? M de 7 células MCF-

59Fe

2-TF durante 3 h /37 ° C, as células foram lavadas quatro vezes com PBS gelado e em seguida, subsequentemente incubadas com 25 uM de Bp4eT ou seus metabolitos durante 3 h /37 ° C. O meio contendo sobrejacente lançado

59Fe foi então decantada a partir das células. A radioactividade foi medida em ambas as células e o sobrenadante utilizando um contador de cintilação-γ (Wallac Assistente 3, Turku, Finlândia).

Efeito dos agentes estudados na prevenção de absorção de

59Fe celular de

59Fe

2-transferrina.

a capacidade dos agentes quelantes para evitar a absorção celular

59Fe de

59Fe

2-transferrina foi examinada utilizando técnicas convencionais [26,27]. Em breve, confluentes células MCF-7 em placas de 6 poços foram incubadas com 0,75? M

59Fe

2-TF durante 3 h /37 ° C na presença de Bp4eT ou os seus metabolitos (25 uM). As células foram então lavadas quatro vezes com PBS gelado e o nível de internalizado

59Fe foi determinada através da incubação a monocamada de células durante 30 min /4 ° C com a protease geral, pronase (1 mg /ml; Sigma-Aldrich ). As células foram então removidas a partir da monocamada com uma espátula de plástico em gelo e centrifugadas durante 1 min /12.000 x

g

/4 ° C. O sobrenadante representa ligada à membrana, pronase sensível

59Fe que foi lançado pela protease, enquanto a fração Pronase-insensitive representa internalizado

59Fe [21,26,27]. A quantidade de internalizado

59Fe foi expressa como uma percentagem de

59Fe internalizados por células de controlo (não tratadas).

oxidação ascorbato ensaio

O ensaio de ascorbato de oxidação foi utilizado para avaliar a actividade redox dos complexos de ferro dos quelantes utilizando um protocolo estabelecido [26,28]. Em resumo, 100 uM de ácido ascórbico foi preparada imediatamente antes da experiência e incubados isoladamente ou na presença de 10 uM de FeCl

3 em um excesso molar de 50 vezes (500 uM) de citrato e os quelantes. Quelantes foram ensaiadas em equivalentes de ligação de ferro (IBE) de 0,1 (excesso de ferro), 1 (complexos de ferro-quelante totalmente coordenadas) e 3 (excesso de quelante livre). A diminuição na absorvância a 265 nm = λ foi medida após 10 e 40 minutos de incubação à temperatura ambiente, utilizando o leitor de placas Tecan Infinito 200M. A diminuição de absorvância entre os dois pontos de tempo foi calculada e expressa como uma percentagem do controlo sem o agente quelante.

ciclo celular análise

Para examinar o efeito dos agentes sobre o ciclo celular, as células MCF -7 células foram semeadas em placas de Petri de 60 mm a uma densidade de 240000 células /prato e incubou-se com Bp4eT ou seus metabolitos para 72 h /37 ° C. As células foram então colhidas, fixadas com etanol e coradas pelo iodeto de propídio (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) durante 30 min /37 ° C, como descrito anteriormente [29]. As células foram analisadas usando fluxo Accuri C6 citómetro (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA EUA). iodeto de propídio foi animado com λ

ex = 488 nm e fluorescência analisadas em λ

em = 585 nm (FL-2) com um total de 10.000 eventos coletados por análise.

avaliação de microscopia de fluorescência

marcadores utilizados para avaliar autofagia /apoptose /necrose em células MCF-7 e as mudanças de lisossomal e morfologia mitocondrial foram observadas utilizando um Eclipse Ti invertido epifluorescência microscópio (Nikon, Tokyo, Japão), que estava equipado com um digital arrefecida câmera Zyla 5,5 scmos (Andor Tecnologia, Belfast, Reino Unido) e NIS-Elements C 4.1 software (Laboratory Imaging, Praga, República Checa). As células MCF-7 foram semeadas em placas de 6 poços com tampa desliza sobre o fundo a uma densidade de 150.000 células /poço e incubadas como descrito acima na presença ou na ausência de 10 ou 100 nM Bp4eT.

Para avaliar o mecanismo de morte celular após incubação com Bp4eT, coloração tripla com cadaverina monodansyl (MDC; 50 uM; λ

ex = 390 nm; λ

em = 455 nm; Sigma-Aldrich), anexina V-FITC ( 5 ul /ml; λ

ex = 495 nm; λ

em = 519 nm; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e iodeto de propídio (5 ug /ml; λ

ex = 560 nm; λ

em = 630 nm) foi utilizada. CDM é um marcador de autofagossomas e lisossomas e resulta em fluorescência azul [30,31]. Como um controlo positivo para autofagia, as células MCF-7 foram incubadas com 1 nM de rapamicina (Sigma-Aldrich) durante 30 min /37 ° C, que é um indutor de autofagia estabelecida [30]. Anexina V tem uma elevada afinidade para a fosfatidilserina, que é translocado para a superfície de células apoptóticas, tanto precoce e de fase tardia [32,33]. Assim, anexina V-FITC serviu como um marcador da apoptose quando as células apoptóticas tinham membranas citoplasmáticas fluorescentes verdes. O iodeto de propídio é um marcador necrótica, ou um marcador de apoptose fase tardia, uma vez que não permeiam membranas citoplasmáticas de células intactas com [34]. As células foram incubadas com estas sondas para 10 min /37 ° C, lavou-se com meio de cultura fresco e as imagens captadas usando o microscópio descrito acima.

Para determinar o efeito da morfologia mitocondrial em Bp4eT, as células foram incubadas com MitoTracker

® verde FM (0,25 mM; λ

ex = 490 nm; λ

em = 516 nm; Molecular Probes) durante 10 min /37 ° C. As células foram então lavadas com meio fresco e as imagens capturadas utilizando o microscópio descrito acima.

análise Western blot

protocolos estabelecidos foram usadas para preparar lisatos celulares e executar análise de imunotransf erência [35]. Os anticorpos primários utilizados incluem: LC3 coelho (Cat #: MBPM036; 1:. 2000) a partir do ábaco (Brisbane, Austrália) e de ratinho β-actina a partir de Sigma-Aldrich (Cat #:: A1978, 1 10000.). Os anticorpos secundários seguintes foram utilizados: peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-coelho (Cat #:. A6154, 1: 1,0000) e anti-rato (Cat. #: A4416, 1: 10.000) anticorpos da Sigma-Aldrich . Para assegurar o carregamento igual de proteínas, as membranas foram sondadas para β-actina.

avaliações de actividade da caspase

Para avaliar o efeito dos compostos sobre a actividade da caspase, células MCF-7 foram incubadas com 100 nM Bp4eT ou seus metabolitos para 3, 24 ou 72 h /37 ° C em placas de 96 cavidades, como descrito acima. As células foram então lisadas por adição de 100 uL de tampão de lise frio (HEPES 100 mM, CHAPS 10 mM, D-G-10 ditiotreitol, pH 7,4) a 100 mL de meio em cada poço. Os lisados ​​foram imediatamente congeladas a -80 ° C. lisados ​​descongelados foram usadas para avaliar a actividade caspase utilizando kits luminescentes para caspases 3/7, 8 e 9 (Promega, Madison, WI, EUA). A luminescência foi medida utilizando o leitor de placas Tecan Infinito 200M. atividade da caspase nos grupos experimentais foi corrigido de acordo com a viabilidade celular de cada grupo e expresso como uma percentagem de actividade do controlo não tratado (100%).

A análise dos dados e estatísticas

SigmaStat para o Windows 3.5 (Systat software, San Jose, CA, EUA), pacote de software estatístico foi utilizado para analisar os resultados. Os dados são expressos como a média ± SD de um determinado número de experiências. A significância estatística foi determinada utilizando um ANOVA de uma via com um Bonferroni

post-hoc

teste ou Estudante de

t

-teste. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando

P

0,05. O

50 valores IC foram calculados utilizando software CalcuSyn 2.0 (Biosoft, Cambridge, UK). análise do ciclo celular foi avaliada utilizando multicycle Software AV (Sistemas de Fluxo de Phoenix, San Diego, CA, EUA).

Resultados e Discussão

Bp4eT é metabolizado em compostos com pelo menos uma diminuição de 300 vezes na citotoxicidade contra ambas as células não-cancerosas e cancro

a actividade citotóxica de Bp4eT foi comparado com Bp4eA (utilizado como uma mistura de

e

e

Z

isómeros) e Bp4eS (em duas formas isoméricas:

E-

Bp4eS e

Z-

Bp4eS). O

E e

Z

isômeros de Bp4eS foram examinados separadamente, pois ambos eram detectados

in vivo Online em estudos anteriores [18], e, portanto, são biologicamente significativo. No entanto, estes dois isómeros não são intercambiáveis ​​e são compostos distintos que podem ser isoladas e analisadas [18]. Em contraste, Bp4eA interconverts prontamente entre o

E e

Z

estados isoméricos [18], e devido a esta propriedade física inerente, somente a mistura desses isômeros pode ser avaliado. Nestes estudos, os efeitos dos agentes sobre as células cancerosas foram estudados utilizando HL-60 de leucemia promielocítica humana, MCF-7 de adenocarcinoma da mama, carcinoma colo-rectal HCT116 humano e linhagens de células A549 do adenocarcinoma do pulmão humano, bem como dois não-canceroso cell- tipos, a saber de rato H9c2 cardiomyoblasts, e fibroblastos 3T3 de ratinho.

Depois de uma incubação de 72 h, o composto parental, Bp4eT, mostraram efeitos citotóxicos potentes contra muito, MCF-7 e HCT-116 células HL-60, em que a IC

50 valores variaram de 3 a 15 nM (Tabela 1 e Fig 2A). A actividade anti-cancro de Bp4eT para estas linhas de células foi significativamente maior do que a dos agentes quelantes utilizados clinicamente, deferoxamina ou deferasirox, que possuem IC

50 valores na gama uM contra células cancerosas [9,36,37,38] . A IC

50 valor de Bp4eT contra células A549 foi moderada (IC

50 = 0,593 ± 0,148? M) e era comparável aos efeitos citotóxicos de Bp4eT contra cardiomyoblasts H9c2 (IC

50 = 0,524 ± 0,157 uM; Tabela 1). A IC

50 valor de Bp4eT contra células 3T3 de fibroblasto (IC

50 = 1,309 ± 0,337 uM; Tabela 1) foi duas vezes maior do que a observada com as células H9c2. De facto, fibroblastos 3T3 foram os mais resistentes de todos os tipos de células para cada agente examinados. Além disso, a citotoxicidade de Bp4eT contra células 3T3 de fibroblasto foi similar ao observado previamente contra células de fibroblastos MRC-5 humana, com IC

50 valores variando de 0,7 a . 6 pM [9,10,39]

Para a determinação da actividade anti-proliferativa, as linhas celulares de cancro (

i

.

e

., HL-60, MCF-7, HCT116 e A549) e não linhas celulares -Câncer (

i

.

e

., H9c2 e 3T3) foram incubadas com os agentes de 72 h /37 ° C e a proliferação, em seguida, avaliada utilizando o ensaio de MTT. Os resultados são a média ± SD (

n

≥ 4 experiências).

O índice terapêutico foi calculado dividindo-se o IC

50 em células normais pelo IC

50 obtida em células neoplásicas e este índice actuou como uma medida da selectividade do agente para as células cancerosas (Tabela 2). Mais importante, os índices terapêuticos de Bp4eT para com as células cancerosas HL-60 HCT-116, MCF-7 e foram alta (34,9-436,3; Tabela 2), que indica a selectividade de Bp4eT contra estes cancerosas-tipos. Isto está de acordo com estudos anteriores mostrando a actividade anti-neoplásica potente e selectivo da Bp4eT [9,40]. Como descrito acima, a selectividade de Bp4eT contra células A549 foi baixa, resultando em índices terapêuticos de 0,9-2,2 (Tabela 2).

Os metabolitos Bp4eT demonstraram uma acentuada diminuição na citotoxicidade contra ambos cancro e não linhas celulares -cancerous (Tabela 1 e Figura 2) e os seus sub IC

50 valores eram 300 vezes mais elevada relativamente ao agente matriz. A amidrazona, Bp4eA, o qual foi identificado como o principal metabolito de Bp4eT [18], foi geralmente mais citotóxico contra as células cancerosas (com a excepção de células HCT116) do que o metabolito semicarbazona, Bp4eS. O IC

50 valores de Bp4eA contra células cancerosas variou de 52 a 207 uM (Tabela 1). Além disso, a citotoxicidade contra as células de Bp4eA não-cancerosas foi inferior em comparação com as células de cancro examinados, com IC

50 valores de 416,1 ± 122,1 1027,4 ± iM e 203,9 uM para H9c2 e 3T3, respectivamente. Isso também se refletiu nos índices terapêuticos de Bp4eA, que variaram 2,0-19,7 (Tabela 2). Importante, as concentrações tóxicas de Bp4eA contra células normais não foram atingidas no plasma durante o estudo de farmacocinética anterior, em que a maior concentração de Bp4eA alcançado foi 1 mM após 300 min pós

i

.

v

. administração de Bp4eT [18]. Isto sugere claramente que os níveis no plasma Bp4eA estavam em concentrações não tóxicas.

Tanto a não interconvertíveis

E e

Z

isómeros do metabolito Bp4eS foram previamente identificados em concentrações baixas ( 0,02 ^ M) no plasma [18]. Os nossos resultados demonstraram que Bp4eS tinham geralmente mais pobre actividade anti-proliferativa do que Bp4eA (Tabela 1 e Figura 2), com IC

50 valores que variam entre 46 a 536 uM em células cancerosas e 343? M e 1 mm de não-canceroso células H9c2 e 3T3, respectivamente. Surpreendentemente, cada linha de células mostrou sensibilidade diferencial ao

E

e

Z

isômeros de Bp4eS. Embora as células HL-60 e H9c2 foram significativamente (

p Art 0,001) mais sensíveis à

Z

isômero, as células HCT116 e A549 foram significativamente (

p Art 0,01) mais sensíveis à

E

isómero de Bp4eS (Tabela 1). Em contraste, as células MCF-7 foram, aproximadamente, igualmente sensíveis tanto à

E e

Z

isómeros de Bp4eS (Tabela 1). Em relação ao Bp4eT, os índices terapêuticos do

E

e

Z

isômeros de Bp4eS foram geralmente baixas, especialmente contra as células H9c2 e variou de 0,6 a 21,6 (Tabela 2). Como o

E e

Z

isómeros de Bp4eS só foram detectados em concentrações muito baixas no plasma [18], e uma vez que os seus efeitos citotóxicos ocorrer apenas em concentrações elevadas, pode-se sugerir que Bp4eS iria mostrar a atividade anti-proliferativa baixo contra as células cancerosas e toxicidade para as células normais

in vivo

.

a capacidade de metabolitos Bp4eT de quelato de ferro a partir do pool de ferro lábil, mobilizar celular

59Fe e prevenir

captação celular 59Fe de

59Fe

2-transferrina é insignificante em comparação com Bp4eT

a capacidade de Bp4eT e seus metabolitos para quelato de ferro do LIP em células MCF-7 foi investigada neste estudo usando o ensaio de calceina-AM, como agentes quelantes de ferro e depleção acredita-se que desempenham um papel na actividade anti-cancro das tiossemicarbazonas [3,9]. O composto progenitor, Bp4eT (10 uM), mostrou um aumento dependente do tempo na fluorescência, devido à capacidade de Bp4eT para quelar o ferro da calceina-AM em células MCF-7 (Figura 3A). Em contraste, a adição dos metabolitos Bp4eT teve quase nenhum efeito sobre a calceina-AM de fluorescência (Figura 3A). Quando expressos como uma percentagem da fluorescência a Bp4eT

t

= 600 s, o metabolito, Bp4eA, mostrou apenas 5,9% da eficácia de quelação Bp4eT, enquanto que ambos os isómeros de Bp4eS demonstrado ≤1.0% da fluorescência de Bp4eT (Figura 3B).

a eficácia da Bp4eT ou seus metabolitos para quelar o ferro a partir do lábio de células MCF-7 foi medido utilizando o ensaio de calceina-AM. (A) A fluorescência da calceina livre após a adição de 10 uM Bp4eT ou seus metabolitos para 10 min /37 ° C. (B) Intensidade de fluorescência da calceina livre na presença de metabólitos a

t

= 600 s foi expressa como uma percentagem da fluorescência da calceina livre na presença de Bp4eT. Os resultados de (A) e (B) são a média ± DP (

n

= 6 experiências). A significância estatística (ANOVA): ***

p Art 0,001 em comparação com Bp4eT. (C) efluxo de

59Fe mediada por meio de controlo ou meio contendo os agentes (25 uM), após 3 h /37 ° C de incubação de células MCF-7 com prelabeled

59Fe da transferrina. (D) A absorção de

59Fe de

59Fe

2-transferrina por células MCF-7 na presença de meio de controlo ou meio contendo os agentes (25 uM) foram determinados após 3 h /37 ° C incubação. Os resultados da (C) e (D) são a média ± SD (

n

≥ 3 experiências). A significância estatística (ANOVA): ***

p Art 0,001 em comparação com o grupo controlo (não tratado). (E) O ensaio de ascorbato de oxidação foi utilizado para examinar a formação de complexos de activos redox. Bp4eT e os seus metabolitos foram ensaiados em equivalentes de ligação de ferro (IBE), de 0,1 (excesso de ferro para quelante); 1 (shell coordenação totalmente concluída); e 3 (excesso de quelante de ferro). Os agentes quelantes, DFO e de EDTA, foram utilizados como controlos anti-oxidantes, ou pró-oxidativos, respectivamente. Os dados são expressos como uma percentagem do grupo de controlo sem agente quelante ao mesmo IBE (100%). Os resultados de (E) são a média ± SD (

n

≥ 3) experiências. A significância estatística (ANOVA): ***

p Art 0,001 em comparação com o grupo de controlo (ferro com ascorbato) no mesmo IBE. células (F) MCF-7 foram incubadas durante 72 h /37 ° C com 100 nM de Bp4eT ou seus metabolitos, Bp4eA e Bp4eS. análise do ciclo celular foi processado por citometria de fluxo usando o iodeto de propídio. quantificação fase foi avaliada utilizando Software AV multicycle. Os resultados da (F) são a média ± SD (

n

≥ 3 experiências). A significância estatística (ANOVA): *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0.001, em comparação com o grupo controle.

Além disso, Bp4eT demonstrou alta eficácia mobilização

59Fe e foi capaz de mediar a libertação de 46,4% do total celular

59Fe (Fig 3C). Nenhum dos metabolitos Bp4eT resultou em uma libertação significativa de celular

59Fe e foram comparáveis ​​com a testemunha (3,5% do total

59Fe; Fig 3C).

A capacidade de Bp4eT e seus metabólitos para evitar que a captação celular de

59Fe de

59Fe

2-transferrina, após 3 h /37 ° C de incubação foi também examinada em células MCF-7. É importante ressaltar que o quelante pai, Bp4eT, demonstrou alta eficácia de quelação

59Fe e absorção inibida internalizado

59Fe para 11,5% do controle (Fig 3D). Como observado no

ensaio de efluxo de 59Fe, tanto Bp4eA e Bp4eS mostrou fraca eficácia de quelação

59Fe e sua capacidade de inibir

59Fe captação foi comparável com a testemunha (Fig 3D).