Abstract
Micro (mi) RNAs são importantes reguladores envolvidos em vários processos físicos e patológicos, incluindo o cancro. A família miARN-302 tem sido documentada como tendo um papel crítico na carcinogénese. Neste estudo, nós investigamos o papel de miRNA-302a no cancro da próstata (PCA). expressão miRNA-302a foi detectada em 44 tecidos APC e 10 tecidos da próstata normais, e seu significado clínico-patológico foi analisada. A proliferação celular e a análise do ciclo celular foram realizadas em células CaP que expressavam estavelmente miARN-302a. O gene alvo de miRNA-302a e a via de jusante foram ainda investigadas. Em comparação com os tecidos da próstata normais, expressão miRNA-302a foi regulada negativamente em tecidos APC, e foi ainda menor em tecidos APC, com uma pontuação de Gleason ≥8. A sobre-expressão de miARN-302a induzida G1 /S paragem do ciclo celular em células APC, e suprimiu a proliferação de células CaP tanto in vitro como in vivo. Além disso, inibe miRNA-302A
AKT
expressão pela directamente vinculativa para a sua região não traduzida 3, resultando em alterações posteriores da
AKT-GSK3β-ciclina D1
e
AKT-p27
KIP1
via. Estes resultados revelam miARN-302a como um supressor tumoral em APC, sugerindo que miARN-302a pode ser utilizado como um alvo potencial para a intervenção terapêutica em CaP
citação:. Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL , Qin XJ, Zhang HL, et al. (2015) MicroRNA-302a Suprime Tumor Proliferação celular inibindo
AKT
no câncer de próstata. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10.1371 /journal.pone.0124410
Editor do Academic: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA
Recebido: 21 de outubro de 2014; Aceito: 13 de março de 2015; Publicação: 29 de abril de 2015
Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (Grant No. NSFC 81.202.003) (https://www.nsfc.gov.cn . /) e Science Foundation of Shanghai Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar (Grant No. 2.010.145) (https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) para GHS
Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
Como o tumor maligno mais comum entre os homens nos países desenvolvidos [1], o cancro da próstata (PCA) mostra igualmente um aumento constante na incidência na China mais Nas últimas décadas. De acordo com o Relatório Anual de Registro de Câncer Chinês (2012), o PCA tornou-se o sexto tipo de câncer mais comum ea nona principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em homens, especialmente em áreas urbanas [2]. Além disso, até 70% de pacientes com CaP têm metástases no momento do diagnóstico, o que resulta em diminuição dramaticamente a sobrevivência a longo prazo [3]. Portanto, há uma necessidade imperiosa de explorar os mecanismos pelos quais a geração e progressão CaP são iniciadas.
A evidência crescente indica que microRNAs (miRNAs), um tipo de endógeno, pequenos RNAs não-codificantes, participar de diversos processos celulares. Através de se ligar especificamente e clivagem de ARNm inibindo a sua tradução ou [4,5], miARNs função tanto como oncogenes ou supressores de tumor [6]. A família miRNA-302 foi identificado pela primeira vez em células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células de carcinoma embrionárias humanas em 2004. Desde então, vários estudos sobre a família miRNA-302 têm-se centrado sobre o seu papel potencial na reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas , bem como embrionário auto-renovação [7]. Vários fatores de transcrição que são expressas no início do desenvolvimento de células-tronco do câncer e manutenção, tais como
Oct4
,
Sox2
, e
Nanog
, foram encontrados essencial para a regulação da transcrição de a família miARN-302 [8]. Curiosamente, Fareh et ai. demonstraram que a expressão estável de miRNA-302 foi capaz de induzir perda de
Oct4
,
Sox1
, e
Nanog
[9]. O papel do miRNA-302 na tumorigénese foi debatida recentemente, como conclusões conflitantes foram elaboradas por diferentes grupos de pesquisa. Por exemplo, endógena miARN-302 não foi detectada em células de cancro do colo do útero, e a expressão ectópica de miARN-302 inibiu a proliferação celular e a formação de tumor [10]. Em contraste, a transfecção de miRNA-302b em células de cancro do cólon resultou em um aumento da capacidade de colônia-formação, invasão e migração in vitro [11]. No entanto, até à data, foram realizados alguns estudos para investigar o possível papel do miRNA-302 em CaP.
No presente estudo, verificou-se que, em comparação com tecidos da próstata normais, tecidos CaP expressa inferior miRNA-302a níveis, e expressão miRNA-302a foi inversamente associado com pontuação de Gleason (GS). Também mostram que a sobre-expressão de miARN-302a em células CaP pode induzir a paragem do ciclo celular e inibir a proliferação celular na formação in vitro e in vivo do tumor. Além disso, identificamos
AKT
como um gene alvo através do qual miRNA-302a exerce seu papel inibitório na CaP.
Materiais e Métodos
As amostras dos pacientes
tecido CaP e tecido benigno da próstata foram obtidos a partir do banco de tecidos na Universidade de Fudan Shanghai Cancer Center. características clinicopatológicas destes pacientes foram recuperados a partir da base de dados Departamento de Urologia. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Conselho de Pesquisa de Revisão Institucional na Fudan University Shanghai Cancer Center e consentimento informado assinado foi obtido de todos os participantes do estudo.
cultura celular
linhas de células CaP Humano, rim embrionário humano 293T (HEK293T) e células epiteliais da próstata normais (RWPE-1) foram adquiridos a partir do Instituto de Pesquisa de células da Academia chinesa de Ciências (Shanghai, República Popular da China). LNCaP e 22Rv1, PC-3, DU145, e células HEK293T foram cultivadas em meio RPMI 1640, meio F-12K, meio MEM, meio DMEM e, respectivamente, todos suplementados com soro fetal bovino a 10%. células RWPE-1 foram cultivadas em meio K-SFM suplementado com extracto de pituitária bovina e o factor de crescimento epidérmico humano recombinante. As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO
2.
ARN, extracção miARN, e quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase
O ARN total foi isolado a partir de células cultivadas e tumoral tecidos, utilizando o reagente Trizol. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de ADNc RevertAid First Strand síntese (Life Technology, Carlsbad, CA), que foi então usada para real-time polymerase chain reaction (PCR), em conjunto com iniciadores directos e inversos e a potência SYBR Green PCR master Misturar.
β-actina
foi usado como um controlo interno para
AKT níveis
transcrição. As sequências dos iniciadores foram os seguintes:
AKT
-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, inverta: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; -Β-actina para a frente: ACCGAGCGCGGCTACAG, inverter:. CTTAATGTCACGCACGATTTCC
De acordo com as instruções do fabricante, miARN a partir de tecidos e células foi extraído utilizando o kit de isolamento miRvana miARN (Life Technology, Carlsbad, CA), e os níveis de expressão de miRNA-302a foram detectados por ensaios TaqMan miRNA (tecnologia de vida, Carlsbad, CA), utilizando RNA nuclear pequeno U6 como um controlo interno.
construção Vector, a produção de lentivírus, e transfecção de células
a sequência de HSA-miARN-302a maduro foi sintetizado e introduzido no vector para produzir PLKO.3G PLKO.3G-miR-302a. Um vector de restauração AKT foi construído através da introdução do
AKT
CDS que foi amplificado a partir de ADNc de PC-3 no vector de CMV-pCDH-MCS-EF1-copGFP. O repórter vector luciferase-3 não traduzida (UTR) foi gerado através da construção do
AKT
3UTR, que carrega um local de ligação miRNA-302a putativa em MT01 vetor. Todos os vectores construídos foram verificadas por sequenciação.
PLKO.3G-miR-302a e misturado com psPAX2 PMD2-G foi transfectado em células HEK293T, utilizando lipofectamina 2000 de reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante . Quarenta e oito horas mais tarde, lentivírus foi colhido e utilizado para infectar células PC-3 e DU145. Em seguida, as células foram separadas por citometria de fluxo (Coulter Beckman, Brea, CA) para estabelecer linhas celulares estáveis que expressam constitutivamente miARN-302a (PC-3-302a e células DU145-302a).
Os ensaios de luciferase
Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas utilizando 50 mL de tampão de lise passiva. Em seguida, um ensaio de luciferase dupla foi realizada tal como indicado pelo fabricante (Promega, Madison, WI). A proporção de pirilampo para Renilla actividade de luciferase foi usado para expressar as actividades da luciferase. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
Proteína colheita e Western Blot
As proteínas totais foram colhidas usando o kit de extração CelLytic (Roche, Basileia, Suiça) contendo inibidores de protease e, em seguida quantificado usando o BCA Protein kit de reagente de ensaio de (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de separar as proteínas utilizando electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida, a proteína foi transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno e, em seguida, bloqueadas em leite sem gordura a 5%. Utilizando os anticorpos primários e anti-coelho ligado a peroxidase de rábano (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) como o segundo anticorpo, as proteínas alvo foram sondados e então visualizadas utilizando o PlusWestern Blotting sistema ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
β-actina
foi utilizado como um controlo de carga. Os anticorpos primários incluíram o seguinte:
AKT
(1: 1000), fosforilada
AKT
(
pAKT
)
(Ser473)
(1: 500 ),
GSK3β
(1: 500),
pGSK3β (Ser9)
(1: 500),
ciclina D1
(1: 1000),
p27
KIP1
(1: 1000),
PI3K
(1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) e
β-actina
(1: 2000). (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX): Os ensaios de
proliferação de células e ciclo celular
edu ensaios de CCK-8 e foram realizados para detectar a proliferação de células. Resumidamente, CCK-8 ensaios foram realizados como se segue: As células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 1 × 10
4 células /poço. Após a adesão, as células foram cultivadas em meio fresco misturado com CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Xangai, China) durante 2 horas, antes de a absorvância foi medida com um leitor de microplacas a 450 nm. Para os ensaios de edu, as células foram incubadas em solução EdU (1: 5000) durante 2 horas, em seguida foram colhidas e coradas utilizando o Cell-Luz EdU Apollo 643 In vitro Citometria de Fluxo Kit (Ribobio, Cantão, China), de acordo com as instruções do fabricante . As células foram depois analisadas por citometria de fluxo
Um ensaio de ciclo celular foi também realizada utilizando a citometria de fluxo:. Resumidamente, as células foram fixadas com etanol frio a 75% durante a noite, e, em seguida, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, o iodeto de propídio (50 ug /ml) contendo ARNase foram adicionados às células para coloração de ADN antes de análise de citometria de fluxo.
Colónia ensaio de formação de
células isoladas foram inoculadas em placas de 60 mm a uma concentração de 500 células /poço e depois incubados em 5% de CO
2 a 37 ° C. Vinte dias mais tarde, as células foram coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 30 minutos. número de colónias em cada placa foram contadas usando um microscópio invertido.
In vivo tumorigenicidade
As células PC-3 PLKO.3G-SCR-transfectadas (células PC-3-SCR) e PC- 3-302a células foram injectadas subcutaneamente em cada flanco posterior do mesmo 4-6 semanas de idade, macho BALB /c nu rato, que foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Laboratory Animais Co., Ltd. (Xangai, China). Os tamanhos dos tumores foram medidos utilizando compassos de calibre de pelo menos três vezes por semana. Os ratinhos foram sacrificados com CO
2 no dia 44. O volume do tumor foi calculado e o peso do tumor foi medido após o sacrifício. Os tumores foram, em seguida, dividido em duas partes, cada parte fixada com formalina a 10% ou conservados em -80 ° C. Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em Estudos Animais de Fudan University Shanghai Cancer Center.
Imunohistoquímica
A imuno-histoquímica (IHQ) coloração de espécimes embebidos em parafina foi realizada como previamente descrito [ ,,,0],12]. Resumidamente, coelho anti-
AKT
e anticorpo anti-rato /rábano anticorpo marcado com peroxidase de coelho (Univ-bio, Xangai, China) foram utilizados como o primário e o segundo anticorpo, respectivamente.
análise estatística
a diferença entre as variáveis contínuas foi analisada por meio de Student
t
-teste ou análise de variância. Frente e verso
P
-Valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 20.0 (IBM Corporation, NY).
Resultados
expressão miRNA-302a é suprimida em tecidos APC e é menor com o GS maiores
CaP tecidos foram adquiridos a partir de um total de 44 pacientes do sexo masculino com idade média de 67 anos (variando de 49 a 77 anos) com diagnóstico recente, patologicamente confirmada CaP. Entre eles, 32 pacientes tinham recebido a prostatectomia radical e 12 pacientes tinham recebido a ressecção transuretral da próstata. tecidos da próstata normais patologicamente confirmados foram adquiridos a partir de 10 pacientes do sexo masculino com cancro da bexiga que havia recebido cistectomia radical. As características clínicas e patológicas de todos os pacientes estão detalhados na Tabela S1.
Detectamos níveis de expressão de miRNA-302A em 44 tecidos APC e 10 tecidos da próstata normais e descobriram que, em comparação com tecidos da próstata normais, tecidos CaP expressa menor níveis de miARN-302a (Fig 1A). Além disso, foi analisada a relação entre os níveis de miRNA-302A e características clínico-patológicas em pacientes APC. Não houve associação significativa observada entre os níveis de miRNA-302A e idade, os níveis de antígeno específico da próstata, ou estágio clínico (S1 Tabela). No entanto, a comparação dos níveis de expressão de miARN-302A em diferentes tecidos CaP revelou que a expressão de miARN-302a significativamente diminuída quando GS 7 (Figura 1B). Colectivamente, postulamos que a regulação negativa da expressão de miRNA-302a pode desempenhar um papel importante na progressão do CaP.
expressão (A) miRNA-302a foi reprimidos no tecido CaP em comparação com o tecido da próstata normal. (B) a expressão miRNA-302a foi menor em tecidos APC com a GS 7 em comparação com aqueles com GS = 7. (C) Níveis mais baixos de expressão de miARN-302a foram detectados em quatro linhas de células humanas de CaP em comparação com as células epiteliais da próstata normais. (D) Elevados níveis de expressão miRNA-302a foram detectados em células CaP expressando estavelmente miRNA-302a (*
P Art 0,05).
A superexpressão de miRNA-302a inibe CaP o crescimento de células in vitro e in vivo
Para investigar a função de miRNA-302a em APC, medimos a expressão de miRNA-302a em quatro linhas de células humanas CaP (LNCaP, 22Rv1, PC-3 e DU145) e células epiteliais de próstata normais (RWPE-1), através quantitativa PCR em tempo real. Como mostrado na Fig 1C, houve menor expressão de miARN-302a em todas as quatro linhas celulares em comparação com células RWPE-1. Porque especulamos que a sobre-expressão de miARN-302a pode inibir o crescimento celular de APC, que sobre-expresso de forma estável miARN-302a em células PC-3 e DU145, que foi confirmado por transcriptase reversa quantitativa (qRT) -PCR (Figura 1D).
O CCK-8, Edu e ensaios de formação de colónias foram realizados para examinar se miRNA-302a superexpressão afetados proliferação de células CaP in vitro. Como mostrado na Figura 2, houve um número significativamente menor (
P
0,05) taxa de crescimento em células DU145-302a em comparação com os controlos e PC-3-302a. As análises de citometria de fluxo indicou que a percentagem de células EDU-positivos em ambos os PC-3-302a e células DU145-302a foram menores do que nos controlos. Além disso, em comparação com os controlos, ambas as células PC-DU145-302a 3-302a e desenvolveram menos colónias nos dias 20 e 15, respectivamente. Portanto, em experiências in vitro demonstram que miARN-302a exercido um papel supressivo na proliferação de células CaP.
Um ensaio CCK-8 foi realizado para medir a proliferação de células em (B) DU145 PC-3 e (a). Os dados representam a média ± desvio-padrão do valor de densidade óptica (DO) a 450 nm, detectada a partir de três experiências independentes. A proliferação celular foi detectado em (c) (D) DU145 PC-3 e as células utilizando o ensaio de EdU analisadas por citometria de fluxo. (E, F) ensaios de formação de colónias indicado menos colónias em miRNA-302a com superexpressão células APC. (*
P Art 0,05).
Para validar ainda mais nossas observações in vivo, as células PC-3-RCS e células PC-3-302a foram injectadas na esquerda e flanco posterior direita de cinco ratinhos nus, respectivamente. Os volumes dos tumores foram medidos utilizando compassos de calibre em diferentes pontos de tempo após a inoculação, e os pesos dos tumores foram medidos após o sacrifício. Tanto o volume e massa eram notavelmente mais baixa em tumores PC-3-302a que em PC-3-Scr tumores (
P
0,05; Figura 3). Tomados em conjunto, foi observada inibição da proliferação celular óbvio após a sobre-expressão de miARN-302a em células APC.
células PC-3-GFP e células PC-3-302a foram injectados no lado esquerdo e direito flanco posterior de murganhos BALB /C ratinhos nus, respectivamente (A, B). O volume de tumor (C) e de massa (D) no grupo PC-3-302a foram notavelmente mais baixa do que no grupo de PC-3-GFP. (*
P Art 0,05).
A superexpressão de miRNA-302a induz a paragem do ciclo celular em células CaP
Agora que a inibição do crescimento foi observado em células CaP , foi realizada a análise do ciclo celular para averiguar se a sobre-expressão de miARN-302a resultou em alterações no ciclo celular. Como mostrado na Fig 4, a proporção de células em fase G1-aumentou notavelmente em células PC-3-302a, enquanto a proporção de células na fase S foram notavelmente menos do que no controlo. Resultados análogos foram observados em células DU145-302a, sugerindo que miARN-302a induzir eficazmente /paragem do ciclo celular G1 S em células CaP
.
A percentagem de células em fase G1-aumentou significativamente em células PC-3-302a (a, C) e DU145-302a células (B, D) em comparação com os controlos, enquanto que a proporção de células na fase S foram notavelmente menos do que os controlos. (* P 0,05).
Suprime
miRNA-302A
expressão AKT
diretamente pela segmentação sua 3UTR
Para detectar os mecanismos moleculares pelos quais miRNA- 302a exerce suas funções de regulação pós-transcricional, usamos bioinformática algoritmos (https://www.targetscan.org) para procurar possíveis genes-alvo, e descobriu que a 3UTR de
AKT
mRNA abriga um sítio de ligação conservado para miRNA-302a. Em seguida, examinámos a expressão de
AKT
no ARNm e o nível de proteína no PC-3-302a e células DU145-302a e controlos. Como mostrado nas Figuras 5A e 6, em comparação com os controles,
AKT
expressões diminuiu significativamente em células DU145-302a PC-3-302a e, tanto a nível da proteína mRNA e. Além disso,
expressão
AKT em tumores PC-3-302a foi significativamente menor do que em PC-3-Scr tumores, como determinado por PCR em tempo real e coloração IHC (Fig 5B e 5C). Estes resultados sugerem que
AKT
expressão é regulada negativamente por miRNA-302a em CaP.
AKT
expressão de mRNA foi notavelmente suprimida em (A) PC-3-302a e DU145 células -302a, e (B) tumores PC-3-302a (cinco tumores independentes foram detectadas). (C) Imunohistoquímica coloração indicou menor expressão de
AKT
em tumores PC-3-302a. (D) a actividade da luciferase relativa foi notavelmente suprimida em tipo selvagem
AKT
-3 região não traduzida (UTR) células transfectadas. (E) Representação esquemática do repórter de luciferase, o qual realizado a de tipo selvagem ou mutante
AKT
-3 ‘UTR. (* P 0,05).
análises de Western blot mostrou AKT reprimidos, AKT fosforilada (pAKT) e ciclina D1 níveis, e regulada GSK3β, pGSK3β e p27
níveis KIP1 em miRNA-302a superexpressão células APC. níveis de PI3K não foram afetados.
Para testar se regula miRNA-302A
AKT
Por diretamente ligação ao seu 3UTR, um vector repórter luciferase contendo o humano
AKT
3UTR que carregava o tipo selvagem sequência de ligação ao miRNA-302a foi subclonado. Um vector transportando luciferase mutante da região de 7 pb complementar à região 5 sementes de miARN-302a foi gerado como o repórter de controlo (Fig 5E). Em comparação com o controlo, a actividade de luciferase relativa foi suprimido em 36% (
P
0,05) no tipo selvagem
AKT
3UTR células transfectadas (Fig 5D). Portanto, miRNA-302a inibe as células PCA através de segmentação diretamente
AKT
.
miRNA-302A induzida alterações do ciclo celular em células CaP inibindo a
AKT-GSK3β-ciclina D1
e
AKT-p27
KIP1
vias
Para melhor avaliar o efeito de miRNA-302a no
AKT
via de sinalização, detectamos a expressão de montante (
PI3K
) ea jusante (
GSK3β
,
ciclina D1
e
p27
KIP1
)
AKT
efetores por western blot. Além disso, os níveis de AKT fosforilado (pAKT) e pGSK3β também foram examinados. Em comparação com as células de controlo correspondentes, tanto GSK3β e pGSK3
β
níveis, bem como p27
níveis KIP1, foram notavelmente elevada, enquanto pAKT e ciclina D1 foram notavelmente reduzida em miARN-302a PC-3 transfectadas e células DU145. No entanto, a expressão de
PI3K
não foi influenciada por miRNA-302a transfecção (Figura 6). Para confirmar ainda mais esses achados, restaurado
expressão AKT
por transfecção transitória de um
AKT
vetor de expressão transportando
AKT
CDS em células DU145-302a PC-3-302a e (PC-3-AKT-CDS nomeados e DU145-AKT-CDS, respectivamente). Como indicado na figura 7, após a restauração da expressão de AKT, tanto GSK3β e p27
níveis KIP1 foram reduzidos, enquanto expressão da ciclina D1 não foi resgatado em ambos os PC-3-AKT-CDS e células DU145-AKT-CDS. Dados os papéis críticos do
AKT-GSK3β-ciclina D1 e AKT-p27
KIP1
vias em transição do ciclo celular de sinalização, nossos resultados sugerem que miRNA-302a pode induzir G1 /paragem do ciclo celular em células S CaP inibindo simultaneamente a D1
AKT-GSK3β-ciclina e
AKT-p27
KIP1
caminho, suprimindo assim células CaP As análises proliferação.
Western blot mostraram expressão resgatado de AKT, e expressão inibida de GSK3β e p27
níveis KIP1 por restauração AKT. No entanto, ciclina D1 níveis não foram resgatados.
Discussão
Neste estudo, observou-se que miRNA-302a foi regulada negativamente em tecidos APC. Outras análises revelaram menor expressão em tecidos APC com o GS ≥8 do que aqueles com GS 8. A sobre-expressão de miARN-302a induzido a paragem em G1 /S em células APC, e proliferação de células CaP notavelmente suprimida in vitro e in vivo. Além disso,
AKT
foi revelado como um gene alvo direto e funcional do miRNA-302a.
Durante a última década, a maioria das pesquisas envolvendo miRNA-302 tem incidido sobre o seu papel na hESCs, que são caracteriza-se por auto-renovação e pluripotência. Estudos que analisam miRNA-302 função na carcinogênese são limitados e inconsistentes. Lin et ai. descobriram que miARN-302 poderia inibir a tumorigenicidade e induzir a apoptose em células MCF-7 de cancro da mama humano, células Tera-2 teratocarcinoma embrionário, células HepG2 e de carcinoma hepatocelular [13]. Da mesma forma, a proliferação celular foi suprimida em células de cancro do colo do útero HeLa e SiHa, bem como carcinoma hepatocelular células SMMC-7721, através da regulação do ciclo celular [10,14]. No entanto, Zhu et ai. observou-se um fenómeno inverso em células cancerígenas do cólon: a sobre-expressão de miARN-302b levou à capacidade de formação de colónias melhorada in vitro [11]. A capacidade formação de colónias aumentada também foi validado em células-tronco do câncer de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [15]. Pela primeira vez, revelámos suprimida a expressão de miARN-302a em tecidos de CaP em comparação com os tecidos normais da próstata, e uma menor expressão em tecidos APC com GS mais elevados. Assim, especula-se que miARN-302a pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão de CaP.
Neste estudo, foi observado um efeito inibidor de miARN-302a sobre a proliferação celular em células PC-3 e DU145 APC, através dificultando a transição G1 para a fase S, que é considerada como um evento chave durante a proliferação celular. De acordo com estudos anteriores [8,10,14], também encontramos notável regulação baixa de
ciclina D1
em miRNA-302a superexpressão células APC. Curiosamente, miARN-302 está previsto para segmentar muitos reguladores do ciclo celular. Por exemplo, Lin et ai. demonstraram que miRNA-302 simultaneamente suprimida ambos
ciclina E-CDK2
e
ciclina D-CDK4 /6
vias de sinalização [13], e este bloqueio alvo foi regulada por vários fatores de transcrição, tais como
Oct4
e
Sox2
[8]. No entanto, Card et ai. informou que miRNA-302a promoveu um aumento na fase S e uma diminuição na fase G1 em hESCs, embora
ciclina D1
também foi reprimida [8]. Claramente, novas pesquisas elucidar os mecanismos exactos de miARN-302 é necessária função.
As nossas observações de que a sobre-expressão de miARN-302a em células CaP induziu a inibição do crescimento celular in vitro e in vivo sugerem que a miARN-302a pode pós- transcricionalmente regular um gene essencial que está envolvida na proliferação celular. Como um oncogene importante,
AKT
influencia uma grande variedade de funções fisiológicas, incluindo o metabolismo, proliferação, sobrevivência, angiogénese, migração e invasão [16]. Da mesma forma,
AKT
foi provada para conduzir a formação de CaP in vivo [17]. Nossos resultados indicam que o miRNA-302a suprimiu a proliferação e tumorigenicidade de células CaP através do
AKT-GSK3β-ciclina D1
e
AKT-p27
KIP1
caminho, e por directamente vinculativa a 3UTR de
AKT
. Além disso, a expressão de
PI3K, que é o principal efetor a montante do
AKT Comprar e também tem provado importante no desenvolvimento da APC, não foram afetadas pelos miRNA-302. O papel regulador do miRNA-302 em
AKT
também foi demonstrada por Cai et al: depois de miRNA-302s transfecção em células cancerosas do colo do útero, eles observaram expressão elevada de inibidores da quinase dependente da ciclina
p27
KIP1
e
p21
Cip1
, juntamente com subregulado
níveis AKT
. Além disso, eles também demonstraram que o
ciclina D1
é outro gene alvo de miRNA-302s, que responderam por nossa observação de que a expressão da ciclina D1 não foi resgatado após a restauração AKT [10]. Assim, como um alvo de miRNA-302,
AKT
foi notavelmente suprimida e evocou alterações em muitas vias de sinalização a jusante.
Nossos resultados também dar certas pistas que diz respeito ao tratamento de câncer miRNAs-alvo. Estudos anteriores revelaram que alguns miARNs específicos foram frequentemente sobre-expressa em tumores, ao passo que a maioria dos miARNs foram reprimidos [18,19]. supressão global miARN foi encontrado para aumentar a carcinogénese em ambos in vitro e modelos in vivo [20], com destaque para os efeitos protumorigenic seguinte miARN perda de função. Liang et ai. observado um papel sensibilizador de terapia de substituição de miARN-302 em células de cancro da mama à radiação ionizante [21]. Outro estudo recente relatou que a entrega viral de deixar-7 miARN pode inibir o crescimento do tumor em um modelo de rato de adenocarcinoma pulmonar [22]. Da mesma forma, os nossos resultados validado o efeito inibidor da substituição de miARN-302a em células APC. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que a superexpressão de até mesmo um único miRNA em células cancerosas pode conferir benefício terapêutico substancial.
Em resumo, nosso estudo demonstra que miRNA-302a é fundamental para o crescimento celular CaP regulando G1-S fase transição. expressão miRNA-302a é suprimida em tecidos APC, e é ainda menor em tecidos APC com a GS mais elevados. Além disso, através de ligação directa aos seus inibe 3UTR, miRNA-302A
AKT
expressão, resultando em alterações posteriores em
AKT-GSK3β-ciclina D1
e
AKT-p27
KIP1
vias. Embora seja claro que miRNA-302a participa APC, mais estudos são necessários para explicar os mecanismos precisos subjacentes ao seu papel na progressão da APC, e, assim, determinar o seu valor potencial como um biomarcador e /ou alvo de intervenção terapêutica.
Informações de Apoio
Tabela S1. As características demográficas e clínico-patológicos de 44 pacientes com câncer de próstata (PCA)
doi: 10.1371. /journal.pone.0124410.s001
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Agradecimentos
Os autores agradecem nossos membros institucionais, especialmente Dr. Sheng-Lin Huang para assistência técnica.