Abstract

Os membros da resposta de crescimento precoce (EGR) família de fatores de transcrição desempenhar diversas funções em resposta a muitos estímulos celulares, incluindo crescimento, o stress, e a inflamação. Egr3 foi relativamente pouco estudado, mas aqui através do uso das especificações (Strategic Partners para a Avaliação de Predictive assinaturas de câncer de próstata) toda Affymetrix base de dados do genoma expressão do gene que relatam que Egr3 mRNA é significativamente sobre-expressos em câncer de próstata em comparação com o tecido normal da próstata (5 vezes). A proteína de humano de ‘Atlas (https://www.proteinatlas.org), uma base de dados de microarrays de tecido marcados com anticorpos contra proteínas humanas mais de 11.000, foi utilizada para quantificar a expressão de proteína em pacientes Egr3 da próstata e cancro da próstata normais. De acordo com os dados de especificações, verificou-se que a proteína Egr3 é significativamente aumentada no cancro da próstata. O banco de dados SPECS tem a vantagem de extensa acompanhamento clínico para os pacientes com câncer de próstata. Análise da expressão de ARNm de Egr3 em relação ao estado recaída revela que a expressão de ARNm de Egr3 é aumentada em células tumorais de amostras não recidiva (n = 63) em comparação com células da próstata normais, mas é significativamente inferior em amostras de recidiva (n = 38) comparado a não-recaída. As observações foram confirmadas utilizando um conjunto de dados independente. foi determinada uma lista de genes que correlacionam com este padrão de expressão única. Estes genes Egr3-correlacionados foram enriquecidas com os sites em seus promotores de ligação Egr. A lista gene contém genes inflamatórios, como IL-6, IL-8, IL1β e COX-2, que têm muitas ligações para o câncer de próstata

Citation:. Pio R, Jia Z, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECS consórcio dos parceiros estratégicos para a Avaliação de Câncer Assinaturas, o cancro da próstata Response (2013) Crescimento precoce 3 (Egr3) é altamente sobre-expressos em Não-Recorrente câncer de próstata, mas não em recidivante do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10.1371 /journal.pone.0054096

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de dezembro de 2011; Aceito: 10 de dezembro de 2012; Publicação: 14 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Pio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo USPHS concede U01 CA1148102 (NIH /NCI SPECS consórcio) e U01 CA152738 (NIH /NCI EDRN) e pela Universidade da Califórnia de Carreira de Desenvolvimento Award Faculdade Irvine (o Dr. Z. Jia). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. D. Mercola é um acionista da Proveri Inc. de San Diego, um começo de biotecnologia testes relacionados empresa -up desenvolver câncer de próstata. Dr. Baron é um consultor para PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., uma empresa start-up desenvolvimento de uma terapia de combinação para o câncer de próstata. Não existem produtos comercializados a declarar. Um pedido de patente pendente é: Michael McClelland, Yipeng Wang, Daniel Mercola: Materiais e métodos para determinar o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata. Setembro de 2011: US 20110236903. Proveri é desenvolver um teste de diagnóstico do cancro da próstata imunohistoquímica multiplex com base no material de patente pendente. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Todos os dados de matriz de tecido humano citados neste manuscrito está disponível ao público como é referido no texto.

Introdução

A resposta de crescimento precoce (EGR) fatores de transcrição têm sido implicados em múltiplos processos celulares importantes para o cancro, incluindo a apoptose, diferenciação, proliferação, inibição de crescimento, e a inflamação [1] – [5]. factores EGR de transcrição são induzidas rapidamente e de forma transiente em resposta a diversos estímulos, tais como factores de crescimento, citocinas, teres de forbol (TPA) e a radiação ionizante, e regular um conjunto diverso de genes em resposta a estes estímulos [1], [6] – [ ,,,0],8]. A família EGR é composta de EGR1, EGR2, Egr3, e Egr4 [9] e todos os membros da família ligam-se ao elemento de ADN mesma resposta EGR (ERE), GCGG /TGGGCG, através de três domínios de ligação de ADN de dedo de zinco conservadas [10].

EGR1 é o melhor membro estudados da família fator de transcrição. Numerosos estudos têm detalhou suas funções supressoras do tumor e, consequentemente, a sua infra-regulação na mama, pulmão e cânceres gliais [11] – [13]. Curiosamente, EGR1 tem sido mostrado que actua como um oncogene no cancro da próstata. Vários investigadores relataram a sobre-expressão de ARNm e proteína de EGR1 no cancro da próstata [14] – [15]. Os modelos de ratinho TRAMP e RC2-T-Ag de cancro da próstata foram utilizados para examinar ainda mais o papel funcional de EGR1 na iniciação e progressão da doença. camundongos EGR1-nula de que foi cruzado com qualquer modelo de câncer apresentavam defasagem progressão de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) para carcinoma invasivo [16].

Apesar de as funções bem caracterizados de EGR1, muito menos se sabe sobre o outro transcrição fatores na família EGR como Egr3. Vários estudos detalhe a função de Egr3 no desenvolvimento neural, especificamente o desenvolvimento fuso muscular, diferenciação dos neurónios Simpático, ea resposta ao estresse ambiental (som, manuseio e situações novas) [17] – [20]. camundongos Egr3 deficientes exibem disautonomia simpático e ataxia sensorial grave [17], [20], ao passo que os ratos EGR1 deficientes apresentam nenhum problema comportamental ou de desenvolvimento aparente [21]. ratinhos knockout Egr3 ainda não foram utilizados para estudar o papel do factor de transcrição no cancro, no entanto, relatórios recentes utilizaram modelos de cultura celular e os dados de expressão de genes para estudar a função Egr3 em várias áreas importantes para o cancro. Assim, Egr3 é sobre-regulada por factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) [22], [23], e knockdown de Egr3 em destas células resulta numa redução da proliferação induzida por VEGF, migração , e tubulogenesis [23]. Além de seu papel na angiogênese, vários relatos têm investigado o papel de Egr3 no cancro da mama, onde foi encontrado para ser um gene de resposta ao estrogénio cuja imunoreactividade está positivamente associada com o status α do receptor de estrogênio (ERa), estado de linfonodos e metástases à distância [24], [25].

Ainda há muito trabalho a ser feito, no entanto, desvendar o papel da Egr3 em outros tipos de câncer. Com base no nosso conhecimento de EGR1 e as características de ligação de ADN comum de todos os factores de transcrição EGR, os autores sugerem que Egr3, de facto, desempenhar um papel quer na formação ou na progressão do cancro da próstata. Aqui relatamos a sobre-expressão de ARNm e proteína de Egr3 no cancro da próstata em relação ao tecido normal da próstata. Além de estudar a sobre-expressão de Egr3, também usamos os extensos conjuntos de dados de expressão de genes de próstata da Universidade de programa California-Irvine SPECS para examinar o padrão de expressão de Egr3 em pacientes com câncer de próstata com o estatuto de recaída conhecida, e descobriram que a expressão Egr3 em células de tumores é mais baixa em tumores que a recaída em comparação com os tumores que não recaída. Este padrão de expressão: ARNm baixo Egr3 em próstata normal versus de expressão elevada no cancro, e a distinção entre a recidiva e não-recaída, foi confirmada com o cancro da próstata conjunto de dados de expressão de gene independente da Universidade de Pittsburg [26] – [28]

Usando a proteína humana Atlas, nós também detalhar um método exclusivo in silico para investigar a expressão excessiva de proteína Egr3 no câncer de próstata. Os resultados combinados indicam que é Egr3 um biomarcador de cancro da próstata resultado pobre. Além disso, um grupo de genes altamente correlacionadas exibe um padrão de expressão semelhante, e os membros deste grupo são candidatos Egr3 regulado genes.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido da próstata

amostras da próstata foram adquiridos por consentimento informado de acordo com a Universidade da Califórnia, protocolos -aprovado e HIPAA-compliant Irvine Institutional Review Board (IRB). aquisição de tecidos era parte do programa NCI-SPECS na Universidade da Califórnia, em Irvine. tecidos de cancro da próstata foram coletadas no momento da prostatectomia, revisado por um patologista, e congeladas em nitrogênio líquido. folhas de acompanhamento de tecidos foram mantidos para registrar o tempo decorrido desde a cirurgia para congelamento (média de 2,8 horas). amostras de próstata normais ou foram congelados instantaneamente em azoto líquido a partir de núcleos de biópsia frescos ou congelados instantaneamente após a coleta a partir do programa autópsia rápida do Instituto de Pesquisa de Saúde Sun (Sun City, AZ), um membro do consórcio SPECS. Os dados consistem em 19 amostras normais da próstata de 13 indivíduos (12 de biópsia normal e 7 de autópsia rápida) e 108 amostras de câncer de próstata de 84 indivíduos (Tabela 1). parâmetros de resultados e dados clínicos relevantes, incluindo uma extensa história foram acumulados ao longo de um período de 11 anos e mantido nas especificações base de dados relacionais com um dicionário de dados de mais de 250 itens. O parâmetro resultado “recaída” refere-se a recidiva bioquímica, o aumento dos níveis de PSA superior a 0,2 ng /ml, após uma prévia PSA pós-operatório que foi abaixo do limite para o teste. Não recaída significa que nenhuma recidiva bioquímica foi observada no paciente durante o quadro clínico de seguimento de tempo. Note-se que todas as amostras de tumor foram recolhidas no momento da prostatectomia, portanto o status de recaídas foi determinada depois de as amostras já foram recolhidos. Os valores clínicos e demográficas relevantes encontram-se resumidos na Tabela 1.

Gene Affymetrix matrizes Expressão e Análise Estatística

ARN a partir de amostras de tecido da próstata foi analisada usando Affymetrix matrizes de expressão de genes. O ARN foi preparado a partir de tecido fresco congelado por seccionamento blocos de tecido com um criostato e purificação de RNA total directamente a partir das secções congeladas acumulados. RNA purificado foi hibridizada para qualquer Affymetrix U133 Plus2.0 ou matrizes de expressão gênica U133A, e as matrizes foram processados ​​de acordo com o protocolo de Affymetrix. Os dados de intensidade utilizados aqui está disponível a partir de fontes públicas (GEO GSE17951 e Geo GSE8218, respectivamente).

valores de intensidade normalizada Affymetrix foram usados ​​para comparar Egr3 (Affymetrix sonda ID 206115_at) expressão em amostras inteiras de próstata normal e de próstata tecido canceroso. valores normalizados para os dois tipos de amostras foram comparadas pelo teste t de um estudante. análise limma (Modelos Lineares para Microarray de Dados) de Bioconductor foi implementado no ambiente R para detectar genes diferencialmente expressos [29].

A fim de analisar o tipo de célula especificidade da expressão de genes Egr3 e correlacionando, usamos uma regressão linear múltipla (MLR) modelo para descrever a relação entre o nível de expressão do gene e tipo de célula composição Affymetrix observada para quatro tipos de células, em casos recidiva e não-recidiva: (1), onde é a ordenada, é a percentagem do tipo de célula j tal como determinado por um painel de patologistas, é o coeficiente de participação do tipo de célula, é o desvio ou mudança de tipo de célula quando as recidivas da doença. é a variável indicador para o estado de recaída. se sujeito sofre recaídas e, de outra forma. é o erro aleatório com distribuição assumida. Este modelo MLR foi usada para ajustar os dados para calcular os coeficientes de expressão, e, quando é o coeficiente de expressão específico do tipo de célula e γ é a diferença na expressão específica do tipo celular entre os casos de recaída e não-recaída. Assim,

β

j mede a expressão de um gene por tipo de célula j de casos não-recaída e

γ

j é a mudança no

β

j dos casos recidivantes. Por MLR, β

0 é a média de expressão de todos os genes para todos os tipos de células e estado de resultado (RS). Portanto β

j coeficientes 0 indicam que a expressão do gene J de um determinado tipo de célula é menor do que a média β

0, enquanto β

j coeficientes 0 indicam expressão aumentada em comparação com p

0. Da mesma forma, γ

J 0 indica que a expressão do gene J é reduzida no cancro da próstata recaída em comparação com cancro não-recidiva da próstata enquanto que γ

j 0 indica que a expressão do gene J é aumentada no cancro da próstata em recidiva doença em comparação com não-recaída. O significado de γ

J foi determinada pelo teste t de, com base no erro σ

j de γ

j. A precisão dos coeficientes de contribuição expressão específica de tipo de célula, β, foi validado [30].

Protein Human Atlas

imagens Imuno-histoquímica foram baixados da proteína humana publicamente disponível Atlas (HPA) ( https://www.proteinatlas.org). HPA versão 8.0 é um banco de dados de microarrays de tecido imagens (TMA) marcadas com anticorpos contra 11.250 proteínas humanas [31]. Os microarrays de tecido consistem em seções de 46 tecidos humanos normais e 20 tipos diferentes de câncer humano. Existem um máximo de 24 imagens de cancro da próstata (a partir de 12 pacientes) e 3 imagens de próstata normal (a partir de 3 dadores) por anticorpo, embora a imagem número pode variar dependendo do anticorpo analisados. As imagens HPA analisados ​​foram seções próstata marcada ou com anticorpos, Egr3 (HPA006206) PSMA (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha), ou PRLH (HPA014768).

Intensidade de marcação

As imagens HPA foram analisados ​​e foi quantificada com o software Aperio ImageScope (Vista, CA) (Figuras S1 e S2). O pixel positiva Contagem Algoritmo versão 9.1 foi utilizado para quantificar a quantidade de ligação de anticorpos e para obter imagens pseudocolored TMA. A fim de quantificar a rotulagem de estruturas específicas, tais como o estroma tumoral ou ácinos, foram utilizados os valores de limiar de intensidade definidos pelo software Aperio, de acordo com as sugestões do fabricante.

de intensidade de pixel é definido como uma medida do brilho da o pixel, ou a quantidade de luz transmitida através da corrediça. Quanto menor o valor de intensidade é, mais escura a coloração é devido à absorção aumentada A = -log I

obs /I

intensidade da luz ref, onde I

obs indica transmitidos e I

ref é a incidente de intensidade de luz. limiares de intensidade foram fixados em 220, 175, 100 e -1 para os fracos, médios e fortes e pixels, “negativas”, respectivamente. Pseudocolors de azul, amarelo, laranja e vermelho foram aplicados para o negativo, fraco, médio e tecido pixels fortes, respectivamente.

próstata normal e câncer de próstata foram analisados ​​com o algoritmo de contagem de pixels positiva. Para comparar a densidade de coloração nos tecidos normais e de cancro da próstata, foi utilizado o NSR (número de forte proporção de pixels positivos). O número de pixels positivos fortemente marcado é dividido pelo número total de pixels positivos para normalizar cada amostra para a área sob consideração, proporcionando assim intensidade de marcação de um tipo de célula seleccionado por unidade de área de tecido.

O pixel positiva contagem algoritmo também foi utilizado para comparar a expressão de proteínas em componentes do estroma e epiteliais da próstata tecido. A caneta ferramenta guiada por mouse foi utilizado para delinear 10 estroma e 10 áreas da glândula por seção TMA. As 10 áreas de amostragem foram escolhidos aleatoriamente, sempre que possível, dentro das limitações de tamanho e composição do tecido

Restrições de tamanho de tecido:. Área tecidual total foi de apenas 1 mm de diâmetro, e as bordas de cada secção de tecido foram evitadas porque coloração nestas áreas tendem a ser afectados pelo tratamento do TMA. Além disso, utilizou-se áreas de amostragem que não se tocam

Restrições na composição do tecido:. Algumas secções de tecido continha muitas glândulas, e quando este era o caso das áreas de amostragem foram escolhidos aleatoriamente. Outras seções continha muito menos áreas de glândulas, reduzindo a nossa escolha para as glândulas que estavam presentes. As secções do estroma, por outro lado, foram todos escolhidos ao acaso uma vez que as secções de tecido tinham numerosas áreas do estroma.

Um instantâneo foi feita de cada uma das amostras escolhidas ao acaso e usada para verificar que as amostras utilizadas para a análise foram representante de toda a seção.

os resultados foram calculados e usados ​​para a determinação de diferenças significativas em comparação com o tecido da próstata normal.

Genes Egr3-correlacionados

de Pearson coeficiente de correlação (R ) e a probabilidade associada e declive foram calculados no ambiente de P para a correlação da expressão de cada gene na plataforma Affymetrix matriz com a expressão de Egr3. Os genes com

p

valoriza ≤0.001 com base na análise de correlação de Pearson e um coeficiente de correlação de Pearson ≥0.45 foram seleccionados como a definição de genes Egr3-correlacionados. genes correlacionados-Egr3 para o conjunto de dados principal SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 (127 amostras de próstata) usado neste estudo, e os genes para um conjunto de dados de expressão de genes SPECS adicional (136 amostras de próstata) com base na plataforma Affymetrix U133A Egr3-correlacionados, foram calculados . A sobreposição de genes entre os conjuntos de dados que preencheram os valores de corte de significância foram tomadas como a lista final dos genes Egr3-correlacionados. O declive da linha de regressão também foi utilizado para caracterizar a adesão de cada correlação para expressão Egr3 e é reportado na Tabela S1.

Simulação estatística

várias simulações foram realizadas a fim de avaliar aleatório ocorrência. Em geral, a frequência de ocorrência de conjuntos de sondas candidato em uma classe foi comparada com a frequência de ocorrência por seleção aleatória de um número igual de conjuntos de sondas do resto da matriz, ou seja, de todos os conjuntos de sondas excluindo os conjuntos de sondas candidatos usando o R programa. A selecção aleatória foi repetido 10.000 vezes e a frequência aleatória média de ocorrência, em comparação com a frequência observada dos conjuntos de sondas candidatos foi usado para estabelecer a probabilidade de ocorrência aleatória.

Fator de Transcrição local de ligação e análise de rede Gene

software MatInspector

Genomatix (Munique, Alemanha) foi usada para determinar factor de transcrição locais para regiões promotoras a montante de 1500 a 1000 bases de bases a jusante do local de início da transcrição (TSS) de ligação. O fator de transcrição locais (matrizes de peso) biblioteca e elementos promotores do núcleo geral vertebrados vinculativo (0,75 /Optimized) grupo de matrizes foram utilizados para calcular sítios de ligação para cada promotor. Com base no modelo de fundo MatInspector para ocorrências de V $ EGRF (anotação TRANSFAC que o vertebrado Os membros da família de Egr EGR1, EGR2, Egr3, CKROX, e WT) locais de ligação, uma simulação 10000 × foi realizado no ambiente de R para comparar a percentagem de fundo (62,7%) dos sítios de ligação de V $ EGRF como determinado por MatInspector para a percentagem observada (99%).

p

-valor = o número de vezes que o esperado era maior do que o /10.000 observado usando Genomatix. A simulação

p

-valor fornece uma estimativa de falsa descoberta.

MetaCore (Thomson Reuters, New York, NY) software de análise de caminho foi utilizado para analisar as ligações entre genes Egr3-correlacionados. Análise de Enriquecimento de factor de transcrição e análise de enriquecimento a função da proteína foram calculadas por MetaCore usando uma taxa de falsos descoberta (FDR) de 0,05 e um modelo de interacções proteína-proteína ou proteína-ADN relatados fundo. Todos

p

-Valores relatados para a análise MetaCore vêm diretamente de cálculos de MetaCore baseado em uma distribuição hipergeométrica. O programa ontologia gene baseado na web DAVID [32], [33] (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) também foi utilizado para analisar as ligações funcionais entre os genes Egr3-correlacionados.

validação dataset externo

o conjunto de dados GEO publicamente disponível GDS2545 foi usado como uma validação externa de Egr3 e genes Egr3-correlacionados identificados no conjunto de dados especificações. GDS2545 é composto por 18 amostras de próstata normais de doadores, 63 amostras de próstata normal adjacente ao tumor, 65 amostras de câncer de próstata primário, e 25 amostras de câncer de próstata metastático. Todas as amostras foram hibridadas em matrizes U95A Affymetrix. Chandran et al. [27] e Yu et ai. [26] relatório de valores de expressão Affymetrix Egr3 em informações suplementares e em tabelas de valores de expressão gênica. Análise do gene correlacionada-Egr3 foi levada a cabo usando este conjunto de dados. O top 150 conjuntos de sondas Egr3-correlacionados a julgar pela correlação de Pearson

p

-valor consiste de 121 genes únicos, que foram comparados com os 80 genes correlacionados-Egr3 únicos identificados nas especificações conjunto de dados produzindo uma sobreposição de 43 exclusivo genes. Uma simulação 10.000 × foi realizada no ambiente R para determinar a probabilidade de esta sobreposição ocorrer por acaso (

p

= 0,0001).

Cultura de Células

cancro da próstata humana

M12 As células foram mantidas em meio RPMI isento de soro suplementado com L-glutamina, 10 ng /de factor de crescimento epidérmico ml, 0,1 uM dexametasona, 5 ug /ml de insulina, 5 ug /ml de transferrina, 5 ng /ml de selénio, 0,05 mg /gentamicina ml e 2,5 ug /ml de anfotericina B, como descrito em [34].

knockdown Estável de Egr3 expressão em células M12

M12 células foram plaqueadas no dia antes da transfecção a uma densidade de 750.000 células /poço em placas de 6 poços, em meio de crescimento isento de antibiótico contendo 2% de soro Fetal bovino. As células foram transfectadas com 3 ug de plasmídeo shRNA precipitação (shSCR) ou plasmídeo shEgr3 (SA Biosciences, Valencia CA) com 6 ul de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) de acordo com as instruções do fabricante. Puromicina (1 jag /ml) foi adicionado três dias mais tarde, a selecção de células transfectadas. clones de células individuais foram isoladas utilizando métodos padrão. As células transfectadas de forma estável (shSCR-M12 e M12-shEgr3) foram então mantidas em meio de crescimento de M12 suplementado com puromicina.

Análise Western Blot

As células foram lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato e lisadas em RIPA tampão na presença de inibidores de protease. O lisado foi sonicada brevemente e clarificados por centrifugação a 13200 rpm a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada utilizando o BioRad Protein Assay. As proteínas foram submetidas a electroforese em SDS-PAGE seguida por transferência para uma membrana de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite 5% (w /v) em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 a 0,5% (TBST), durante 2 horas. anticorpo Egr3 (SC-191 de Santa Cruz-Tecnologia, Santa Cruz, CA) foi incubada durante a noite a 4 ° C, seguido por 3 lavagens em TBST. As membranas foram incubadas com anticorpos conjugados com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente (TA). Após 3 lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com HyGlo-HRP kit quimioluminescente (Denville Scientific, Metuchen NJ). As membranas foram despojado e sondado com anticorpos anti-actina (Santa-Cruz).

RT-PCR quantitativo

O RNA total foi extraído de células shSCR-M12 (controle de corrida) ou shEgr3-M12 usando o kit RNeasy Plus (Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções, e ressuspensas em água. a integridade de ARN foi avaliada por electroforese em gel de agarose formaldeído. Um ARN ug foi convertido em ADNc utilizando o ADNc qScript Quanta super-mistura (5 minutos a 25 ° C; 30 min a 42 ° C; 5 minutos a 85 ° C) num termociclador. -QPCR em tempo real foi realizada no ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) utilizando parâmetros convencionais. Cada amostra foi executado em quatro repetições, com análise de curva de dissociação. As diferenças nos níveis de mRNA foram analisados ​​utilizando o método -ΔΔCT 2

. GAPDH foi utilizada para normalizar as amostras. As sequências dos iniciadores são fornecidos na Figura S4.

Reporter Assay

O promotor de IL8 humano (bases -262 a -55) clonado no plasmídeo de luciferase pGL3 e o controlo de pRL-SV40 luciferase Renilla foram plasmídeo uma simpática oferta do Dr. Carlotta Glackin (City of Hope, Los Angeles, CA) e foram descritos em Li et al. [35]. O plasmídeo pGL3-IL6 luciferase contendo o promotor de IL-6 foi uma oferta do Dr. Steve Cole (UCLA, CA) e tem sido descrita em Eickelberg et ai. [36]. As células shSCR-M12 e M12-shEgr3 células foram plaqueadas a uma densidade de 20.000 células /poço numa placa de 96 poços de branco no dia antes da transfecção, e cultivados em, meio de crescimento antibiótico livre de fenol-vermelho livre. As células foram transfectadas com plasmídeos de IL8-pGL3-IL6 ou pGL3 e o plasmídeo de luciferase de Renilla (para normalizar para a eficácia de transfecção e números de células). FuGene reagente de transfecção (Promega, Madison, WI) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante com 160 ng de plasmídeo pGL3, 40 ng de plasmídeo pRL e 0,6 ul FuGene. Dois dias mais tarde, Dual-Glo Luciferase Reagent (Promega) foi adicionado ao meio de crescimento (1:01 vol /vol) e incubadas durante 10 min temperatura ambiente. As placas foram lidas usando um luminómetro Dynatech ML-3000. A reacção foi extinta por adição de Dual-Glo Stop Glo reagente, que também inicia a reacção de luciferase de Renilla, durante 10 minutos à temperatura ambiente antes da leitura. A proporção de Firefly para Renilla luminescência foi calculado para cada poço.

Resultados

celular específico do tipo de expressão RNA de Egr3 é aumentada em Câncer de Próstata

Foram analisados ​​Affymetrix todo genoma dados de expressão a partir de tecido normal e canceroso da próstata para determinar se Egr3 é expresso diferencialmente. Os dados de expressão de genes Affymetrix U133 Plus2.0 é composto por 19 amostras normais da próstata (obtidos a partir de 13 dadores) e 108 amostras de tumor de próstata (obtidos a partir de pacientes com cancro da próstata 84, várias amostras dos mesmos doentes estavam presentes no conjunto de dados a expressão do gene). dados demográficos do paciente para os 84 doentes com cancro e os 13 doadores normais de tecidos está resumida na Tabela 1. A análise dos dados de expressão normalizados a partir das amostras de próstata 127 revelou que Egr3 (sonda conjunto 206115_at) é significativamente sobre-expresso no cancro da próstata em comparação com o normal tecido da próstata. A média da expressão no câncer de próstata é 5,35 vezes maior do que no tecido da próstata normal e t-teste de um aluno (

p

= 2 × 10

-15) confirmou que essa diferença é altamente significativa. A análise dos valores medianos de expressão também revela uma diferença significativa na expressão Egr3 entre amostras normais e de cancro da próstata próstata (dados não mostrados). Um histograma de expressão Egr3 em todos os pacientes está apresentada na Figura 1. Os valores de expressão Egr3 são apresentados como valores de intensidade de Affymetrix, em vez de representados graficamente numa escala log2 para melhor apresentar o seu alcance. Desde as idades médias dos casos portadores de tumor difere daquela dos casos normais (Tabela 1), a diferença de expressão Affymetrix para Egr3 foi comparado com a lista de mudanças relacionadas à idade previamente determinados de Jia et al. [37] com base na comparação de dados de expressão para 15 amostras normais de biópsia de próstata com uma idade média de 54 anos para os de 13 amostras de autópsias rápidas com uma idade média de 84 anos. Dos 3.400 conjuntos de sondas produzindo diferenças significativas identificadas nesta comparação, conjuntos de sondas para Egr3 não foram incluídos. Estes resultados indicam que a expressão aumentada de Egr3 não está relacionado com a diferença de idade entre dadores normais e pacientes com cancro da próstata e está associada com uma ou mais propriedades específicas para o tecido da próstata portador de tumor.

Affymetrix expressão é traçada sobre uma escala linear, onde o anti-log

2 de valor da expressão Egr3 de cada paciente é plotado no eixo y. A linha pontilhada em 1292 denota a Egr3 valor de intensidade média para todas as amostras.

A validação ao nível da proteína com um conjunto de dados externos

Embora Egr3 é sobre-regulada em nível mRNA , pode ser o nível de proteína Egr3 que é importante para a função de Egr3 no cancro da próstata. Para complementar os dados de expressão gênica que utilizou um

in silico

abordagem para analisar os níveis de proteína Egr3 no tecido da próstata. A proteína humana Atlas (HPA) é uma coleção de dados de microarrays de tecido para 20 tipos diferentes de câncer e 46 tecidos normais (https://www.proteinatlas.org). padrões morfologia do tecido e expressão de proteínas para as amostras dos pacientes HPA foram verificados por um patologista credenciado. HPA fornece uma indicação de expressão de proteína em cancro, em comparação aos homólogos dos tecidos normais. As imagens HPA foram transferidos para análise quantitativa. As imagens de imunohistoquímica dos tecidos da próstata disponíveis para coloração Egr3 consistem em amostras de câncer de próstata 20 de 11 pacientes e 3 amostras de próstata normais a partir de 3 doadores.

Foi utilizado o algoritmo de contagem positiva de pixel Aperio ImageScope para quantificar a intensidade de coloração Egr3 ( HPA006206). Pseudocolors foram aplicados como descrito em Métodos e são mostrados na Figura 2. Embora tenham sido utilizadas apenas quatro níveis limiares, as imagens pseudocolored ilustram claramente que a intensidade da coloração Egr3 separou a estruturas glandulares de outras características, tais como o estroma contendo epitelial (Figura 2), indicando que o método de limiar simples separados adequadamente elementos glandulares de tudo o mais. O estroma foi principalmente desprovida de coloração Egr3. Para amostras normais e tumorais, o padrão de coloração anti-Egr3 predominante era uniformemente epitelial. Dentro das células epiteliais, Egr3 coloração foi observada nos compartimentos membranares cytosol- e fracamente no núcleo

A-B:. HPA próstata normal, os doentes de 2098 e 2472, respectivamente. C-D: amostras de câncer de próstata HPA, pacientes 3303 e 3744, respectivamente. Todos os casos adicionais HPA disponíveis são mostrados nas informações suplemento. E:. Histograma de uma forte relação positiva pixel (NSR) para pacientes normais e câncer de próstata

Apesar de fatores de transcrição pode ser esperado para localizar principalmente para o núcleo, este padrão de coloração não é exclusivo para Egr3 na Proteína humano de ‘Atlas. Como um exemplo, nós olhamos para a coloração de um bem estudados fatores de transcrição, c-fos. A coloração para c-fos (HPA018531) é na maior parte nuclear, mas também aparece em uma localização citoplasmática-membrana em quatro de dez tecidos de cancro da próstata que coraram positivas para c-fos.

É também possível que localização Egr3 é alterada em estados patológicos, como é o caso para o factor de transcrição e um supressor de tumor p53, por exemplo. De facto, do tipo selvagem de p53 acumula-se no citoplasma das células de tumor no cancro da mama inflamatório ou neuroblastoma, levando a sua inactivação funcional [38] – [40]. Poderia ser interessante, no futuro, para confirmar a localização /membrana citoplasmática de Egr3 e sua relevância.

Para quantificar coloração Egr3 selecionamos uma média de 10 regiões da glândula e 10 do estroma em cada amostra. Cada uma das 10 regiões foi delineado usando um ponteiro guiada por mouse para que foram incluídas apenas as regiões de características histológicas de pura como glândulas e formações tumor da glândula-like. O software reconhecido lúmen da glândula e pseudolumen excluídos fiel e pixels destas regiões, desde que houve o cuidado de excluir lúmen com detritos. Os valores de intensidade de coloração Egr3 resultantes de todos os 10 domínios de tumor e de estroma foram normalizados separadamente. Para esta etapa, o número de fraco, médio e pixels fortemente coradas foram ponderada (1 = fraco, médio = 2, 3 = forte).