Abstract

Com a conclusão da sequência do genoma humano, ciências biomédicas ter entrado em o “omics” era, principalmente devido às técnicas de genômica de alto rendimento ea recente aplicação de espectrometria de massa para a proteômica analisa. No entanto, ainda existe um desfasamento entre estes avanços tecnológicos e a sua aplicação na prática clínica. O nosso trabalho é projetado para construir pontes entre proteômica de alta performance e rotina clínica. Os extractos proteicos foram obtidos a partir de pulmão normal congelado fresco e amostras não-pequenas do pulmão de células cancerosas. Aplicou-se um enriquecimento fosfopéptido seguido por LC-MS /MS. Subsequentes quantificação e bioinformática livre-label análises foram realizadas. Foram avaliados os padrões de proteína nestas amostras, mostrando dezenas de marcadores diferenciais entre tecido normal e tumor. ontologia gene e interactoma analisa as vias de sinalização identificados alterados no tecido do tumor. Foram identificadas duas proteínas, PTRF /cavin-1 e de MIF, que são expressos diferencialmente entre pulmão normal e cancro do pulmão de células não-pequenas. Estes biomarcadores potenciais foram validados utilizando western blot e imunohistoquímica. A aplicação da proteômica baseada em descoberta de análises em amostras clínicas nos permitiu identificar novos biomarcadores potenciais e alvos terapêuticos no câncer de pulmão de células não pequenas

Citation:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Calvo E, Agulló-Ortuño MT, López-Vacas R, Díaz E, et al. (2012) PTRF /Cavin-1 e MIF As proteínas são identificados como não-pequenas células Lung Cancer Biomarkers por Proteomics Etiqueta-free. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10.1371 /journal.pone.0033752

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 01 de dezembro de 2011; Aceito: 16 de fevereiro de 2012; Publicado: 26 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Gámez-Pozo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por doações FIS CP05 /00248, PS09 /01597, Red Temática de investigação Cooperativa en Câncer (RTICC, RD06-0020-1022) a partir de Carlos III Institute of Health (Ministério da Ciência espanhol e Inovação, Espanha) e bolsas de investigação por parte da Fundação Mutua Madrileña. ISN é apoiado pela Fundação para a Pesquisa Biomédica de La Paz Hospital Universitário. ED é apoiado por subsídio CA10 /01447 de Carlos III Institute of Health. Espanhol Centro Nacional de Pesquisa Cardiovascular é apoiada pelo Ministério espanhol da Ciência e Inovação e da Fundação ProCNIC. O IdiPAZ Biobank é apoiado por Carlos III Instituto de Saúde, Ministério da Saúde Espanhol (RETIC RD09 /0076/00073) e Farmaindustria, através do Programa de Cooperação na Clinical and Translational Research da Comunidade de Madrid. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer no mundo. A taxa de sobrevida global em 5 anos é de 15% e não foi melhorada por décadas. Dois terços dos pacientes são diagnosticados com doença avançada, onde as opções terapêuticas são paliativos, e até 55% dos pacientes com doença limitada, eventualmente recaída após a cirurgia radical [1].

A expressão gênica profiling levou à identificação de grupos dos pacientes com resultado diferente, reflectindo assim a heterogeneidade desta doença [2]. No entanto, o gene de nível de análises não detectar alterações subtis causadas por modificações pós-tradução de proteínas [3]. Uma profunda compreensão dos processos de carcinogênese, a progressão de tumores e metástases requer a análise tanto do genoma e proteoma [4]. proteomic tecnologias com base em espectrometria de massa (MS) têm emergido como componentes preferidos de uma estratégia para descobrir biomarcadores de proteína de diagnóstico, prognóstico e terapêutico [5]. Continuando os avanços neste campo dar esta estratégia um enorme potencial para tais investigações [6], [7].

Ensaios clínicos recentes demonstram boa resposta a novas drogas em subgrupos específicos de pacientes sublinham a necessidade de testes moleculares que complementam procedimentos histopatológicos clássicos [8]. Neste contexto, a caracterização proteómica pode proporcionar ferramentas valiosas para a estratificação de biomarcadores do paciente e eficiente selecção terapêutica.

Embora seja possível analisar proteínas a partir de tecidos, utilizando espectrometria de massa [3], [9], a complexidade do clínico amostra e a quantidade de proteína disponível são fatores limitantes. Portanto, o enriquecimento da amostra em analitos biologicamente relevantes é necessário [5]. A maioria dos processos celulares eucarióticos são regulados por fosforilação de proteína, e a desregulação deste modificação pós-translacional chave é comum no cancro e outras doenças. Isso explica por que proteínas quinases surgiram como a principal classe de novos alvos de medicamentos em oncologia e outras áreas [10]. Neste trabalho, temos aplicado enriquecimento fosfopeptídeo juntamente com técnicas de MS isento de rótulo para identificar já conhecidos e novos biomarcadores potenciais em tecidos não-pequenas de câncer de pulmão de células clínicas e validá-los usando western blot e imunohistoquímica.

Materiais e Métodos

Ética declaração

aprovação Institucional da nossa comissão de ética foi obtido para a realização do estudo (comité ético de Investigação Clínica, Hospital Universitário La Paz). Os dados foram analisados ​​de forma anónima. Pacientes forneceram consentimento por escrito para que suas amostras e dados clínicos poderiam ser usados ​​para fins de investigação.

A selecção de amostras

As amostras congeladas de pacientes com diagnóstico de câncer de pulmão foram obtidos a partir do Departamento de Patologia do Hospital Universitário La Paz (Madrid, Espanha): adenocarcinoma de pulmão 5 (AC), carcinoma 5 de pulmão de células escamosas (SC) e 5 pulmonares amostras normais (NL). O exame histopatológico de cada amostra foram analisadas por um patologista pulmonar experiente para confirmar o diagnóstico e o conteúdo do tumor. Pelo menos 50% de uma amostra tinha que ser feito de células tumorais para serem elegíveis. As amostras de pacientes foram gentilmente cedidas pela IdiPAZ Biobank (RD09 /0076/00073) integrado no Hospital Biobanks Rede Espanhola (RetBioH; www.redbiobancos.es). As amostras foram registradas e processadas de acordo com procedimentos atuais e fixo /congelados imediatamente após a sua recepção.

extração de proteína total, solubilização e digestão

As amostras foram cortadas num criostato Leica CM3050 S, obtendo 10 seções de 10 mícrons de espessura cada uma. O tecido foi processado com o reagente TRIzol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Para as análises de MS, peletes de proteína foram ressuspensas em cloridrato de guanidina 6 M e aquecida a 10 minutos a 95 ° C com agitação. Subsequentemente, foram adicionados 950 ul de bicarbonato de amónio 50 mM (pH 7-9) por amostra. concentração da amostra de proteína foi medida pelo kit de ensaio de proteína MicroBCA (Pierce-Thermo Scientific). Tripsina MS teor em ouro (Promega) foi adicionado a cada amostra para uma relação de 01:50. A digestão foi realizada durante a noite a 37 ° C. A amostra digerida foi dividida em duas alíquotas.

paralela IMAC (PIMAC)

enriquecimento fosfopéptido foi realizada tal como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, Fe (III) à base de IMAC foi realizada em uma aliquota de proteína digerida usando a PHOS-Select Ferro Gel de Afinidade (Sigma-Aldrich), seguindo as instruções do fabricante. Ga (III) à base de IMAC foi realizada numa outra aliquota de proteína digerida utilizando o Kit de isolamento de fosfopéptido (Pierce-Thermo Scientific) seguindo as instruções do fabricante. Os eluatos foram misturados, e armazenadas a -20 ° C para posterior análise MS seco sob vácuo.

análises de LC-MS /MS

misturas de péptidos foram submetidos a cromatografia em nano-líquido acoplado com o MS para a identificação das proteínas. Os péptidos foram injectadas num C-18 de fase reversa (RP) nano-coluna (100 mm ID e 12 cm, Mar Mediterrâneo, Teknokroma) e analisados ​​num gradiente de acetonitrilo contínua consistindo de 0-40% de B em 90 min, 50-90 % de B em 20 min (B = 95% acetonitrilo, 0,5% ácido acético). No final do gradiente, a coluna foi lavada com 90% de B e equilibrada com 5% de B durante 20 min. Uma taxa de fluxo de 300 nl /min foi usado para eluir os péptidos a partir da nano-coluna RP com uma agulha de nanospray emissor de ionização em tempo real e fragmentação de péptido num espectrómetro de massa LTQ-Orbitrap XL (Thermo-Fisher). Um espectro de FT-resolução avançada (resolução = 60000) seguido pelo MS /MS espectros dos cinco iões parentais mais intensos foram analisados ​​ao longo da corrida cromatográfica (130 min). exclusão dinâmico foi fixado em 1 min. Para a proteína espectros de identificação fragmentação foram pesquisadas no banco de dados MSDB (versão 091.509) usando o programa da mascote 2,1 (Matrixscience). Dois clivagens perdidas foram autorizados, e um erro de 10 ppm ou 0,8 Da foi definido para o pleno MS ou pesquisas espectros MS /MS, respectivamente. Todas as identificações foram realizadas por software 1.0 Discoverer proteoma (Thermo-Fisher). Pesquisa de banco de dados para análise Decoy taxa de detecção falsa foi de 0,05, aplicando filtros correspondentes. arquivos de dados brutos foram processados ​​e comparados com peneira versão 1.2 (Thermo-Fisher). identificações de proteína foram validados utilizando a ferramenta BLAST a partir do conjunto BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Para obter definições detalhadas de impressão digital em massa de péptidos e de identificação de proteína, ver Tabela S4.

Inmunoblotting ensaios

Para inmunoblotting ensaios, pelotas de proteína foram novamente suspensas em 2% SDS e aquecida 10 minutos a 95 ° C com agitação . concentração da amostra de proteína foi medida pelo kit de ensaio de proteína MicroBCA (Pierce-Thermo Scientific) .western blots foram realizados utilizando o sistema de WesternDot (Invitrogen) numa SNAP d.i. dispositivo (Millipore). foram utilizados e diluição do anticorpo 1:125 PTRF (BD Biosciences); MIF anticorpo 1: 250 de diluição (D Systems R D Systems) ou anti-PTRF 1:100 (BD Biosciences). As imagens foram obtidas em um microscópio Leyca com ampliação de × 40. A percentagem de tecido manchado e a intensidade da mancha (0, +, ++, ou +++) foi obtido para cada amostra e marcador avaliado. coloração IHC foi considerado positivo quando pelo menos 50% do tecido (normal ou tumoral) foi corado com pelo menos ++.

Análises Estatísticas

Os valores de expressão entre os grupos de amostra foram comparados usando um Kruskal -Wallis teste (aproximação de Gauss). Para avaliar as diferenças entre os pares de grupos foi utilizado o teste de comparações múltiplas de Dunn. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo. valores peneira e densitometria foram comparados por meio do coeficiente de correlação de Pearson

Bioinformatics

listas de proteína foram processadas utilizando o banco de dados de anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) versão 2.0 (http: //. david. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. Para identificar categorias funcionais sub e sobre-representados usamos análise de proteínas através de relações evolucionárias (Panther) do banco de dados v 6.1 (www.pantherdb.org) [14]. Lista de proteínas do tumor foram comparados à lista pulmonar normal utilizando o teste binomial [15] para cada função molecular, processo biológico ou termo percurso em Panther. interações proteína-proteína foram obtidos a partir da ferramenta de pesquisa para a recuperação de interagir Genes /interações proteína-proteína físicas e funcionais Proteínas (STRING) v9.0 banco de dados contendo conhecidos e previstos [16]. foi usada STRING no modo de proteínas, e apenas interações com base na interação proteína-proteína experimental e curadoria databases- com níveis de confiança mais de 0,5 foram mantidas.

Resultados

Neste estudo, foram avaliadas as diferenças ao nível da proteína entre o cancro do pulmão não pequenas (NSCLC) e tecido normal do pulmão utilizando uma estratégia de enriquecimento fosfopéptido e uma abordagem isenta de etiqueta. As amostras foram analisadas num LTQ-Orbitrap XL depois de ter sido submetido a cromatografia em líquido. Uma vez que é conhecido que diferentes técnicas isolar segmentos distintos e sobrepostas da phosphoproteome [17], incluindo a Fe (III) e Ga (III) IMAC [18], misturou-se o Fe (III) e Ga (III) fracções IMAC de cada amostra e analisou-los juntos.

Foram avaliados o número de péptidos únicos e as suas proteínas correspondentes, bem como os f osf opéptidos e os seus correspondentes fosfoproteínas, identificados no adenocarcinoma de pulmão (AC), o carcinoma de células escamosas do pulmão (SC) e normal pulmonar (NL) amostras aplicando uma pesquisa de banco de dados chamariz na taxa de detecção falsa 0,05. A análise extensa realizada em amostras de NSCLC e NL utilizando LC-MS /MS nos permitiu identificar uma média de 381 péptidos diferentes por amostra, dos quais uma média de 56 foram fosfopéptidos. Estes péptidos correspondeu a uma média de 138 proteínas específicas identificadas por amostra, dos quais uma média de 39 foram fosforilados. A fração de fosfopeptídeos identificados (número de peptídeos fosforilados * 100 /Número de peptídeos identificados) foi de 19,9%.

Gene análises ontologia foram realizadas utilizando todas as proteínas identificadas. A lista de proteínas do tumor foi comparado com a lista normal de proteína pulmonar para cada função molecular (Figura S1), processo biológico (Figura S2), ou via (Figura 1) termos usando PANTHER. Esta abordagem mostrou diferenças significativas entre amostras de pulmão e tumores normais (análises completas são fornecidos na Tabela S1). As diferenças nas funções moleculares estão principalmente relacionados com a interacção com ácidos nucleicos e regulação da síntese de proteínas e atividade. Processos que controlam a exocitose, resposta imune, resposta ao estímulo, a resposta ao estresse e transporte foram significativamente sub-representadas em tumores, enquanto que as categorias relacionadas com a adesão célula-matriz ou a resposta à toxina foram sobre-representados. Por outro lado, as categorias homeostase estavam sub-representados, enquanto categorias relacionadas com a produção de energia e proliferação celular foram sobre-representados em tumores. diferenças notáveis ​​em análise de caminho apareceu em categorias relacionadas com o controle de transdução de sinal. Embora a regulamentação do citoesqueleto por Rho GTPase, inflamação mediada por quimiocinas e citocinas via de sinalização, integrina via de sinalização e Wnt via de sinalização foram sub-representadas nas amostras de tumor, receptor EGF via de sinalização, glicólise, via p53 e via de PI3 quinase foram sobre-representados.

Comparação de número de proteínas designadas para cada categoria GO percurso. Normais categorias amostra de tecido são representados como vezes de alteração em relação a esta categoria. A significância estatística é testada utilizando o teste binomial. Apenas as categorias significativa (p 0,05) são mostradas

análise de expressão diferencial entre NSCLC vs pulmão normal foi realizada usando software de peneira 1,2.. Um total de 296 picos m /z expressos diferencialmente foram encontrados, 115 dos quais tinha disponível espectros MS2, que conduz à identificação de proteínas diferencialmente expressos entre pulmão normal e amostras de NSCLC (Tabela 1). Todos os dados obtidos a partir de análises de peneira, incluindo os valores de expressão relativa, são fornecidos na Tabela S2.

PTRF /cavin-1 e MIF destacam entre os biomarcadores diferencialmente expressos entre NSCLC e amostras de pulmão normais no livre-label analisa como o mais regulada para baixo e sobre-regulada, respectivamente (Figura 2). PTRF /cavin-1 mostrou perda de expressão, tanto adenocarcinoma e amostras de carcinoma de células escamosas. Por outro lado, a MIF mostrou uma expressão aumentada nestas amostras. A fim de evitar identificações falsas positivas, mais do que vinte MS2 espectros para cada MIF e péptidos PTRF /cavin-1 foram avaliados manualmente (Figuras S3 e S4 e S3 Tabela). Mudanças na PTRF /cavin-1 e expressão MIF em amostras de NSCLC foram validados utilizando imuno-histoquímica (IHQ) e análises de Western blot. As mesmas amostras utilizadas para MS /MS analisa e nove amostras adicionais de adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e pulmonar normal foram avaliadas quanto à MIF e PTRF usando western blot. Cinco amostras adicionais de adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e pulmonar normal foram avaliadas quanto à MIF e PTRF usando IHC. Todos os tumores mostram coloração positiva para MIF e coloração negativa para PTRF, enquanto que todos os tecidos normais foram negativos para MIF e positivo para a coloração PTRF. MIF a sobre-expressão em tecidos de tumor foi confirmada tanto por IHC e Western blot (Figuras 3 e 4). Por outro lado, as amostras de tumor confirmou a perda de PTRF /expressão cavin-1 quando comparado com o pulmão normal (Figuras 3 e 4) utilizando duas técnicas. correlação de Pearson entre os valores de expressão livre de rótulo peneira e quantificação western blot foi de r = 0,723 er = 0,754 (p 0,005) para a MIF e PTRF /cavin-1, respectivamente

Boxplots representam a média e 25a-75a percentil. ; bigodes representam minima e maximun. As medições foram obtidas a partir de cinco amostras diferentes em cada estado. p-valores de teste de Kruskall-Wallis são mostrados. AC: Adenocarcinoma; SC: carcinoma de células escamosas; NL:. Pulmão normal

a) Western blot da proteína total extraído de amostras indicados, utilizando anti-MIF e /Cavin-1 anticorpos primários anti-PTRF. b) densitom�rica análise de western blot. software 1.38e ImageJ foi utilizado para medir a intensidade de bandas. Todos os valores em unidades arbitrárias. c) A imuno-histoquímica de amostras indicados, utilizando anti-MIF e /Cavin-1 anticorpos primários anti-PTRF. AC: Adenocarcinoma; SC: carcinoma de células escamosas; NL:. Pulmão normal

gráficos box-plot mostrando PTRF e MIF quantificação western blot usando software ImageJ 1.38e. Todos os valores em unidades arbitrárias. Cada caixa inclui valores de nove amostras diferentes. As diferenças entre as amostras normais e tumorais foram p . 0.005 em ambos os casos (teste de Kruskall-Wallis)

Foram pesquisados ​​no banco de dados STRING para conexões interactomic de MIF e PTRF. A fim de minimizar a taxa de falsos positivos, eliminamos parceiros utilizando critérios rigorosos e interações proteína-proteína única experimentais e caminhos de bancos de dados curadoria foram tidos em conta. PTRF está incluído na via de transcrição de ARN, e fisicamente interage com TTF1. Outras interacções PTRF compreendem proteínas envolvidas na regulação da transcrição e EGFR (Figura 5). MIF está relacionada com a via do metabolismo de fenilalanina, e interage com o p53 e proteínas do complexo signalosome COP 9, um complexo envolvido em vários processos celulares e desenvolvimento, incluindo a degradação de p53 mediada por fosforilação [19]. Outras interações compreendem proteínas relacionadas com a regulação da morte celular e processo inflamatório (Figura 6).

Um gráfico de rede PTRF construído usando STRING v9.0 é mostrado. Diferentes cores de linha representam os tipos de evidências da associação:. Rosa para experimentos e azul para bancos de dados

Um gráfico de rede MIF construído usando STRING v9.0 é mostrado. Diferentes cores de linha representam os tipos de evidências da associação:. Rosa para experimentos e azul para bancos de dados

Discussão

Proteomics em geral e phosphoproteomics em particular estão se tornando os métodos preferidos de proteína análises baseadas discovery. O uso de abordagens baseadas em descoberta sem rótulo pode ajudar a descobrir conexões biológicas inesperadas devido à ausência de viés do conhecimento anterior. ferramentas de bioinformática, como ontologia do gene e interactome analisa, aplicados em amostras clínicas têm grande potencial para identificar as vias e moléculas com implicação a nível terapêutico e pode oferecer pistas para a gênese das doenças e suas alterações moleculares subjacentes. No entanto, tanto a própria tecnologia e ferramentas de análise de dados devem ser aperfeiçoadas antes da sua entrada para a clínica.

enriquecimento fosfopeptídeo de amostras antes da análise MS usando PIMAC funcionou razoavelmente bem, como 20% dos péptidos medidos foram fosforilada. Estudos anteriores demonstraram um enriquecimento de fosfopéptidos de cerca de 50%, utilizando um protocolo semelhante ao nosso IMAC na digestão tríptica de uma mistura de várias proteínas de referência [20]. Considerando que as nossas amostras eram muito complexas e que nós não utilizar qualquer passo de fraccionamento, o enriquecimento fosfopeptídeo foi bem-sucedida e comparável com o obtido em trabalhos anteriores [21], [22]. No entanto, a maioria dos espectros, mostrando uma perda de fosfato apresentada uma pobre fragmentação, e nenhuma identificação péptido foi gerado. A utilização de novas técnicas de fragmentação, como a dissociação colisão maior energia, melhorar a qualidade de fragmentação espectros [23], permitindo realizar análises phosphoproteome em grande escala.

Gene ontologia análises dos processos biológicos e as vias mostrou um aumento na Categorias relacionadas com a produção de energia nas células, tais como a glicólise e a geração de metabólitos precursores e energia. Estas diferenças no metabolismo da energia entre as células normais e tumorais são conhecidos como efeito Warburg [24]. Desde as vias de sinalização sub-representadas nos tecidos NSCLC, inflamação chemokine- e mediada por citocina tem sido mostrado previamente para ser sub-representadas no NSCLC [25]. É notável a sobre-representação de proteínas pertencentes a via de sinalização EGFR, num contexto em que o uso clínico de inibidores de EGFR tornou-se o paradigma da terapia personalizada para NSCLC [26], [27], [28].

Mais de 10% dos péptidos detectados mostrou uma expressão diferencial entre as amostras normais e tumorais. A percentagem de peptídeos diferenciais foi inferior a 2% na comparação entre amostras de carcinoma de adenocarcinoma e de células escamosas do pulmão, mas ainda havia diferenças substanciais entre estes dois subtipos histológicos NSCLC, como já demonstrado anteriormente [11].

Estávamos capaz de validar NSCLC potenciais biomarcadores identificados em proteômica espingarda análises usando IHC e abordagens western blot. MIF (fator inibidor da migração de macrófagos) discriminação entre pulmonar normal e amostras de NSCLC. Este factor conhecido é uma citocina pró-inflamatória capaz de actuar como factor de crescimento solúvel, expressa e segregada em resposta a mitogénios e sinais mediada por integrina. proteína MIF está envolvido em muitas doenças malignas, uma vez que promove a transformação celular, inibe a resposta imunitária citolítica contra células de tumor e promove a neovascularização [29]. análises interactome revelou uma estreita relação entre a regulação da morte celular e MIF, e não é surpreendente que a MIF sobre-expressão foi descrita em muitos tipos de cancro, incluindo o colorretal, mama, próstata, pele e câncer de pulmão [30], [31], tendo um papel importante no desenvolvimento de tumores no sistema nervoso central [32]. Tumores que co-expressam MIF e o seu receptor de membrana (proteína CD74) aumentaram vascularização [33]. Embora existam várias moléculas que inibem a atividade enzimática da MIF, a sua alta IC50 tem limitado o seu uso clínico até agora [34], mas novas moléculas estão em desenvolvimento em curso [35]. Nossos resultados mostram um aumento da expressão de MIF em amostras de NSCLC pela proteómica sem rótulo, confirmado por ambos western blot e imunohistoquímica.

PTRF (Polimerase I e Transcrição Fator Release), também conhecido como cavin-1, é um proteína essencial para a transcrição de ARN [36] e a formação de caveolae [37]. Estes invaginações da superfície da célula estão associados com processos de transporte vesicular, homeostase do colesterol, a transdução de sinal [38] e a lipólise controlo [39]. Portanto, não é surpreendente que PTRF /cavin-1 mutações estão associados a lipodistrofia congênita generalizada, tipo 4 em seres humanos [40]. PTRF /cavin-1 colocaliza com caveolin 1 (CAV1) dentro cavéolas [41], e modula positivamente a sua expressão [42]. interactome análises sugerem que abriga PTRF funções desconhecidas para além de alguns recentemente descrito [43], [44], [45]. Perda de PTRF /cavin-1 expressão em cancro da próstata tem sido relacionada com a progressão [46], e tem sido demonstrado que a expressão diminui a migração de células de cancro da próstata PTRF /Cavin-1 deficiente em [47]. A perda de PTRF /expressão cavin-1 em células tumorigénicas HBE, em comparação com células epiteliais brônquicas humanas normais foi provado recentemente [48]. Bai e colegas relataram recentemente que a proteína PTRF foi regulada para baixo em linhas celulares de cancro da mama e tecidos de tumor da mama, e de que a infra-regulação de PTRF em células de cancro da mama foi associada com a metilação do promotor [49]. PTRF /cavin-1 espécies fosforiladas foram descritos em células que sobre-expressam o EGFR, o que sugere uma função nesta via de sinalização [50]. Nossos proteômica sem rótulo resultados indicam que a expressão PTRF está perdido em amostras de NSCLC. Estes resultados foram confirmados utilizando tanto western blot e coloração imuno-histoquímica. Este é o primeiro estudo que mostra PTRF /cavin-1 perda de expressão em tecido de tumor de NSCLC ao nível da proteína. Esta perda de expressão, juntamente com a interação PTRF-EGFR e EGFR via desregulamentação em amostras de NSCLC, sugere um papel de PTRF no desenvolvimento NSCLC.

Nosso trabalho demonstra que é possível identificar potenciais biomarcadores usando um livre-label estratégia proteômica diferencial em amostras clínicas reais. Foram identificados vários marcadores diferenciais, dois dos quais foram validados por métodos de proteômica clássicos alternativos. Além disso, mostramos que a ontologia gene e interação analisa pode identificar caminhos e processos alterados no tecido tumoral, o que pode fornecer pistas para a gênese da doença e suas alterações moleculares subjacentes, e poderia ser suscetível a intervenção terapêutica. Neste sentido, este trabalho indica que o papel PTRF em NSCLC e sua relação com percurso EGFR merece maior exploração.

Informações de Apoio

Figura S1.

Análise das diferenças na função GO Molecular entre NSCLC e pulmão normal. Comparação do número de proteínas designadas para cada categoria GO percurso. Normais categorias amostra de tecido são representados como vezes de alteração em relação a esta categoria. A significância estatística é testada utilizando o teste binomial. Apenas as categorias significativas (p 0,05) são mostrados

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s001

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Figura S2..

análise das diferenças no processo GO biológica entre NSCLC e pulmão normal. Comparação do número de proteínas designadas para cada categoria GO percurso. Normais categorias amostra de tecido são representados como vezes de alteração em relação a esta categoria. A significância estatística é testada utilizando o teste binomial. Apenas as categorias significativas (p 0,05) são mostrados

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s002

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Figura S3..

espectros de fragmentação PTRF SLKESEALPEK péptido tríptico. O diagrama mostra íons fragmento correspondente a série principal fragmentação (b-amino e Y-carboxi). * Indica perda de água; 2+, duplamente fragmento cobrado. ion Parental é marcado com uma seta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s003

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Figura S4.

Fragmentação espectros de MIF PMFIVNTNVPR péptido tríptico. O diagrama mostra íons fragmento correspondente a série principal fragmentação (b-amino e Y-carboxi). * Indica perda de água. ion Parental é marcado com uma seta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s004

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Tabela S1. As análises

Gene Ontology realizada com PANTHER. lista proteína pulmonar normal foi utilizado como lista de referência

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s005

(PDF)

Tabela S2.

PENEIRA quantificação sem rótulo. Os dados obtidos a partir PENEIRA análises, incluindo os valores de expressão relativa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s006

(PDF)

Tabela S3.

PTRF e MIF MS2 espectros.

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s007

(PDF)

Tabela S4.

Peptide Mass impressão digital e as configurações de identificação de proteínas.

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s008

(DOC)

Reconhecimentos

Queremos reconhecer particularmente os pacientes neste estudo para a sua participação ea IdiPAZ Biobank integrado no Hospital Biobanks Rede Espanhola (RetBioH; www.redbiobancos.es), para os generosos presentes de amostras clínicas utilizados neste trabalho

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