Abstract

O objetivo do presente estudo foi determinar o significado clínico da molécula de adesão juncional A (JAM-A ) em pacientes com cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) e a função biológica de JAM-a em linhas celulares de NSCLC. Mostrámos que JAM-A é predominantemente expresso em membranas celulares e alta expressão de JAM-A ocorreu em 37% dos espécimes de tumor de pulmão em comparação com os tecidos normais correspondentes. Alta expressão de JAM-A foi significativamente correlacionada com o estádio TNM (P = 0,021), metástase linfática (P = 0,007) e diminuição da sobrevida global (P = 0,02), Além disso, observou-se que o silenciamento JAM-A por pequenas interferindo proliferação de células de tumor de ARN inibida e a paragem do ciclo celular induzida pelo G1 /S limite. análise de transferência de Western revelou que knockdown de JAM-A reduziu os níveis de proteína de ciclina D1, CDK4, 6, e P-Rb. Assim, JAM-A desempenha um papel importante na progressão NSCLC

Citation:. Zhang M, Luo W, Huang B, Liu Z, Sun L, Zhang Q, et al. (2013) sobre-expressão de JAM-A em não-pequenas células do cancro do pulmão se correlaciona com a progressão do tumor. PLoS ONE 8 (11): e79173. doi: 10.1371 /journal.pone.0079173

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de maio de 2013; Aceito: 23 de setembro de 2013; Publicação: 12 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30.972.967) e Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (No. 20092104110018). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

uma molécula de adesão juncional (JAM-a) é uma glicoproteína transmembranar de tipo I, que pertence à superfamília das imunoglobulinas. JAM-A está amplamente distribuído em tecidos, incluindo a placenta, pulmões, fígado, rins, pâncreas, coração, cérebro, intestinos, e nódulos linfáticos [1], [2], [3], [4]. JAM-A é expresso predominantemente nas junções intercelulares de células epiteliais e endoteliais, JAM-A também é encontrado na superfície de leucócitos, linfócitos, plaquetas, eritrócitos e [5], [6], [7], [8]. JAM-A está implicada em diversos processos celulares, tais como a adesão célula-célula, migração de leucócitos, activação de plaquetas, angiogese, e reovírus de ligação [5], [9], [10], [11]. A JAM-A proteína é composta por um domínio extracelular com duas voltas semelhantes a Ig, uma única região que atravessa a membrana e uma cauda citoplasmática curta terminando num motivo de ligação PDZ. JAM-A pode formar homodímeros através deste circuito Ig N-terminal. interacções homofílicas são importantes para a JAM-A acima mencionada função em células [12]. O motivo de ligação PDZ C-terminal pode facilitar interacções com várias proteínas de andaime, tais como ZO-1, FA-6, e PAR-3 [13], [14], [15]. motivos de ligação a JAM-A dimerização e PDZ são críticos para a cascata de sinalização [16], [17]. Recentemente, JAM-A tem sido implicada na progressão do tumor, mas o papel de JAM-A no crescimento e disseminação tumoral permanece um assunto controverso. Naik et al. [18] inicialmente informou que JAM-A pode reduzir a invasão e motilidade de linhas celulares de cancro da mama

in vitro Comprar e JAM-A expressão em pacientes com câncer de mama foi negativamente associado com a agressividade do tumor e metástases. clínico-similar ou

in vitro

dados -generated foram relatados por outros envolvendo carcinoma endometrial [19] e câncer pancreático [20]. Pelo contrário, Mc Sherry et ai. [21], usando um conjunto maior de dados clínicos, relatou uma correlação positiva entre JAM-A expressão e prognóstico do câncer de mama invasivo. Da mesma forma, maior clínico-,

in vitro Restaurant -, e

in vivo

conjuntos de dados -generated Recentemente, foram relatados no câncer de mama e carcinoma epidermóide [22], [23], [24], [25], [26]. A expressão de JAM-A proteína no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC tecidos) ea relação com vários fatores clínico-patológicas ainda não foi completamente investigado. Além disso, o papel exacto do JAM-A na progressão do câncer de pulmão não é clara. Portanto, determinou-se JAM-A expressão em tecidos NSCLC por imuno-histoquímica. Além disso, determinou-se a associação entre JAM-A expressão e proliferação de várias linhas celulares de NSCLC. Mostrámos que JAM-A é expresso em quantidades relativamente elevadas tecidos NSCLC e alguns tipos de linhas celulares de NSCLC, e que os níveis de uma célula JAM-membrana-associados estão correlacionados com a agressividade do tumor.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado com a aprovação do Conselho de revisão Institucional da Universidade Medical China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes com NSCLC e todas as investigações clínicas foram realizadas de acordo com os princípios promulgados na Declaração de Helsinki.

Pacientes e espécimes

Oitenta e duas amostras de NSCLC foram obtidos a partir da primeiro Hospital Afiliado da China Medical University, entre 2002 e 2009; 42 amostras foram submetidos a estudos de acompanhamento. Nenhum dos pacientes receberam radioterapia ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica. O diagnóstico histológico e grau de diferenciação dos tumores foram definidos pela avaliação de hematoxilina e secções de tecido manchado de eosina de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde de classificação. Todos os 82 espécimes foram reavaliados em relação ao subtipo histológico, estado de diferenciação, e estágio do tumor. carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma foram identificados em 36 e 46 dos 82 casos, respectivamente. Metástases linfonodais foram observadas em 31 pacientes. Os tumores foram classificados em estágios I (n = 45), II (n = 30) e III (n = 17) de acordo com o sistema de estadiamento p-TNM da União Internacional Contra o Câncer (7ª edição). A sobrevida global foi definido como o período de tempo entre o diagnóstico inicial até a morte ou a data do último follow-up.

linhas celulares e celular Condições Cultura

HBE, A549, H1299, H157, e linhas de células H460 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). linhas celulares SPC e LK2 foram adquiridos a partir do celular Shanghai Bank da Academia Chinesa de Ciências. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo soro fetal de vitelo a 10% (FBS; Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma). As células foram cultivadas em placas de cultura de tecidos estéreis e passadas a cada 2 dias utilizando tripsina a 0,25% (Invitrogen).

Análise Imunohistoquímica

espécimes de tumor cirurgicamente-excisados ​​foram fixadas com 10% de formalina neutra, embebidos em foram preparados de parafina, e de 4-mm de espessura. A imunocoloração foi realizada utilizando o ElivisionTM mais polyer HRP (mouse /coelho) Kit IHC (Maixin, Fuzhou, China). Os cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas em série álcool graduado, e fervidas em tampão de 0,01 M de EDTA (pH 9,0) durante 20 minutos em banho-maria. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peróxido de hidrogénio (0,3%), que foi seguido de incubação com soro de cabra normal para reduzir a ligação não específica. As secções de tecido foram incubadas com anticorpo monoclonal JAM-A de coelho (diluição 1:100; Abcam, Cambridge, MA, EUA). Imunoglobulina de coelho, com a mesma concentração que o anticorpo específico para o antigénio (Maixin) foi utilizado como um controlo negativo. Coloração para todos os anticorpos primários foi realizada a 4 ° C durante a noite. ElivisionTM mais polyer HRP foi usado como o anticorpo secundário. Após a lavagem, as secções foram incubadas com 3, tetracloridrato 3′-diaminobenzidina para desenvolvimento de reacção de peroxidase. A contracoloração das secções foi feito com hematoxilina, que foram, então, desidratados em etanol antes da montagem. Dois investigadores independentes examinaram todos os slides tumorais aleatoriamente. Cinco pontos de vista foram examinados por lâmina, e 100 células foram observadas per view em aumento de 400X. Imunocoramento JAM-A foi marcado seguindo uma escala semi-quantitativa, avaliando áreas tumorais representativas; a intensidade e a percentagem de membranas celulares tinham imunocoloração mais elevada do que as células de controlo. coloração da membrana das células tumorais foi considerado imunocoloração positiva. A intensidade de JAM-A membranas de coloração foi também pontuada como 0 (sem coloração), 1 (fraca), 2 (moderada), e três (alto). contagens percentuais foram atribuídos como se segue: 1, 1% -10%; 2, 11% -50%; 3, 51% -80%; e 4, 81% -100% [20]. Os escores de cada amostra de tumor foram multiplicados para dar uma pontuação final de 0-12 e a expressão total de JAM-A foi determinado um preço tão baixo (≤4) ou expressão elevada ( 4).

quantitativa real -tempo de PCR (Método SYBR Green)

quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, EUA) num volume total de 20 ul de uma 7900HT rápido em tempo real PCR System (Applied Biosystems) como se segue: 95 ° C durante 30 segundos; 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos; e 60 ° C durante 30 segundos. Um passo de dissociação foi realizada para gerar uma curva de fusão para confirmar a especificidade da amplificação. β-actina foi utilizado como o gene de referência. Os níveis relativos de expressão gênica foram representados como referência ΔCt = Ct gene-Ct ea mudança vezes da expressão do gene foram calculados pelo método de 2

-ΔΔCt, onde ΔΔCt = (Ct

gene-Ct

referência )

sample- (Ct

gene-Ct

referência)

calibrador. As sequências dos iniciadores de JAM-A foram 5′-GTG AAG TTG TCC TGT GCC TAC TC-3 ‘(para a frente) e 5′-ACC AGT TGG CAA GAA GGT CAC C-3′ (reverso). As sequências dos iniciadores de β-actina foram 5’- TGC CTA GAT CAA GAA GCA G-3 ‘(para a frente) e 5′- TGC CTA GAT CAA GAA GCA G-3’ (reverso). Três experimentos independentes foram realizadas em triplicado em condições idênticas.

pequeno RNA de interferência Tratamento

pequeno RNA de interferência (siRNA) para JAM-A foi sintetizado por Genepharma (Xangai, China). As sequências de siRNA foram como se segue: 5′-GAA AAG GUG GAG UCA AAU ATT-3 ‘(com sentido); e 5’-UUG AAU UCU CCU CUU UCA CTT-3 ‘(anti-sentido). As sequências de direccionamento não-siARN (controlo negativo), utilizado como um controlo negativo foram como se segue: 5’-GAA UUC UCC CGU GUC UTT ACG-3 ‘(com sentido); e 5’-ACG CAC GUU UGA CGG AGA ATT-3 ‘(anti-sentido). As células foram semeadas numa placa de 6 poços 24 h antes de experiências de transfecção. As células foram transfectadas com 100 pmol JAM-A siRNA ou ARNsi de controlo negativo utilizando Lipofectamine2000 (5 ul /poço; Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à transfecção, a proteína e os níveis de ARNm de JAM-A foram avaliadas 48 horas mais tarde. Três experiências independentes foram realizados em condições idênticas.

Western Blot Análise

A proteína total de células foi extraída em tampão de lise (50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], NaCl 150 mM, 0,5% Nonidet P40, 0,5% de desoxicolato de sódio e fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF]; Beyotime, Haimen, China) e quantificada utilizando o método do ácido bicincon�ico (BCA) (Beyotime). Sessenta mg de proteína foi separada por SDS-PAGE (10%) e transferida para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EUA), Após o bloqueio com BSA a 5% em Tris-tamponada salina-Tween 20 (TBST; Tris-HCl 20, NaCl a 500 mM e 0,05% de Tween-20), as membranas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com os anticorpos primários seguintes: JAM-a (1:1000; Abcam); e anti-P-Rb, anti-P27 e anti-P21, anti-ciclina A, anti-ciclina B, anti-ciclina D1, anti-CDK4, anti-CDC6, anti-AKT1 /2, e o anti-P-AKT Thr 308 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Após incubação com acoplado com peroxidase anti-rato ou IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) a 37 ° C durante 2 h, as proteínas ligadas foram visualizadas utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e detectados utilizando sistemas bioimaging (UVP Inc., Upland, CA, EUA). Os níveis relativos de proteína foram calculados a partir de GAPDH como controlo de carregamento. Três experiências independentes foram realizados em condições idênticas.

Citometria de Fluxo Ensaio

As células foram tratadas com tripsina e 1 × 10

6 as células foram lavadas duas vezes com tampão de incubação arrefecido (2% de BSA em PBS) e centrifugou-se, em seguida, as células foram ressuspensas em 100 ul de tampão de incubação e incubados com ou sem rato conjugado com FITC-JAM Um anticorpo humano anti-(1:100; BioLegend, San Diego, CA, EUA) ou IgG1 de ratinho conjugado com FITC , anticorpo de controlo de isotipo κ (1:100; BioLegend) em gelo durante 30 min no escuro. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de incubação e processadas para análise por citometria de fluxo. Os dados foram analisados ​​usando FlowJo 7.6.1 software. Três experiências independentes foram realizados em triplicado, em condições idênticas.

Teste de Proliferação Celular

Um ensaio de proliferação celular foi realizado utilizando MTT (Sigma) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células H1299 e A549 foram transitoriamente seccionado com JAM-A siRNA ou controle negativo siRNA. Após 24 h, as células foram tripsinizadas e semeadas a uma concentração de 3 x 10

3 placas de cultura de células /100 ul /cavidade em 96 cavidades durante a noite. Cada dia seguinte, as células foram tratadas com 20 ul (5 mg /ml) /poço de solução de MTT durante os últimos 4 h de cultura. O meio de cultura foi substituído com DMSO (150 ul /poço). A densidade óptica dos poços foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. Três experimentos independentes com 5 repetições internas por experimento foram realizadas em condições idênticas.

Formação de Colónias Ensaio

Para ensaios de formação de colónia, as células foram transfectadas com JAM-A ou controle negativo siRNA por 48 h, em seguida plaqueadas em placas de cultura de 6 poços (1000 por poço) e incubou-se durante 12 dias. As placas foram lavadas com PBS e coradas com Giemsa. O número de colónias com 50 células foi contado. As colónias foram contadas manualmente utilizando um microscópio. Três experiências independentes foram realizados em triplicado, em condições idênticas.

Análise do Ciclo Celular

se as células (100000) foram semeadas em placas de cultura de 6 poços, sincronizadas após privação de soro durante 24 h, em seguida, transfectadas com as quantidades indicadas de siRNA. As células foram colhidas, fixadas em etanol a 75% 48 h após a transfecção, lavou-se com PBS, e coradas em 5 mg /ml de iodeto de propidio em PBS suplementado com ARNase A (Roche, Indianapolis, IN, EUA) durante 30 min à temperatura ambiente. Os dados foram coletados por meio de sistemas de BD. Três experimentos independentes foram realizadas em condições idênticas

Análise Estatística

SPSS (versão 16.0 para Windows; SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Foi utilizado para todas as análises. O teste do qui-quadrado foi utilizado para determinar a correlação entre a JAM-A expressão e características clínico-patológicas. As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para análise de sobrevivência, e log-rank foi determinada com base nas diferenças. teste t de Student foi utilizado para comparar outros dados. Os valores de p foram baseadas em análise estatística dos dois lados, e uma p . 0,05 foi considerado para indicar significância estatística

Resultados

Expressão e distribuição da JAM-A em NSCLC tecidos

Analisamos a expressão e distribuição de JAM-a em 82 amostras de NSCLC e os tecidos normais correspondentes utilizando imuno-histoquímica. JAM-A foi predominantemente expresso em membranas celulares; elevada expressão de JAM-A foi encontrada em 37% dos espécimes de tumor de pulmão (Tabela 1), que foi muito mais elevada do epitélio brônquico e pneumócitos no correspondente tecidos pulmonares não-tumorais (Fig. 1). Foi investigada a relação entre a expressão de membrana JAM-A e parâmetros clinicopatológicas. Com base na análise univariada, alta expressão de membrana JAM-A foi significativamente correlacionada com o estádio TNM (P = 0,021) e metástases em linfonodos (p = 0,007), mas não com a idade (P = 0,818), sexo (P = 0,96), diferenciação (P = 0,174), o estado do tumor (P = 0,105), e a histologia do tumor (P = 0,818; Tabela 1). Foi avaliada a relação entre a expressão de membrana JAM-A e a sobrevivência geral, em 49 doentes com NSCLC. Após análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, descobrimos que os pacientes com alta expressão de membrana JAM-A tiveram uma sobrevida significativamente menor (sobrevivência mediana = 50 ± 8,92 meses; 95% intervalo de confiança [IC], 32.56-67.48 meses) do que pacientes com baixa expressão de membrana JAM-a (sobrevivência mediana = 61 ± 4,31 meses; 95% CI, 52.56-69.45 meses, P = 0,02; Fig. 2).

(a) Strong JAM-a expressão em adenocarcinoma de pulmão (400X). (B) fraco JAM-A expressão em adenocarcinoma de pulmão (400X). (C) Strong JAM-A expressão em carcinoma de células escamosas do pulmão (400X). (D) fraco JAM-A expressão em carcinoma de células escamosas do pulmão (400X). (E) coloração fraca no epitélio brônquico normal no tecido pulmonar não-cancerosos (400X). (F) Os controlos negativos para JAM-A coloração com anticorpo IgG de coelho não imune (400X).

Os pacientes com baixa expressão de JAM-A tiveram melhor sobrevida global do que os pacientes com alta expressão de JAM -A, tal como definido pelo teste de log-rank (P = 0,02).

JAM-a proliferação celular de depleção Inibe Lung Cancer

Detectamos JAM-a expressão em células normais epiteliais brônquicas (HBE) e linhas celulares de cancro de pulmão de seis por transferência de Western e análise de PCR em tempo real. células H1299 e A549 exibiram altos níveis de expressão de JAM-A, as células HBE apresentaram níveis moderados de expressão de JAM-A, e H157, H460, SPC e LK2 apresentaram baixos níveis de expressão de JAM-A (Fig. 3A, B ). Porque JAM-A é um tipo I glicoproteína transmembranar, que, em seguida, analisaram os níveis de células associadas à membrana JAM-A usando uma citometria de fluxo de ensaio em linhas-A JAM celulares relativamente elevadas endógenos (H1299 e A549) e linhas-A JAM celulares endógenos relativamente baixas (H460 e H157). Como mostrado na Fig. 3C, a expressão de superfície JAM-A em células H1299 e A549 foi muito mais elevada do que H157 e H460 células. Assim, utilizou-H1299 e células A549 em estudos de perda de função.

JAM-A expressão de um painel de linhas celulares derivadas de vias respiratórias humanas analisadas por Western blot, Os dados são apresentados como representativos experiências Western blots. As experiências foram repetidas 3 vezes, independentemente, com resultados semelhantes. (B) A expressão relativa de ARNm de JAM-A de um painel de linhas celulares derivadas de vias respiratórias humanas avaliadas por PCR em tempo real. A quantidade relativa de ARNm de JAM-A, normalizado para p-actina, foram comparados com H157 células com base na equação de RQ = 2

-ΔΔCt. Colunas, com média de RQ de valores triplicados de uma experiência representativa; bares, max /min RQ. As experiências foram repetidas 3 vezes independentemente, e conduzida em triplicado, com resultados semelhantes. A expressão na superfície (C) de JAM-A de um painel de linhas celulares derivadas de vias respiratórias humanas avaliadas por um ensaio de citometria de fluxo. As células confluentes foram tripsinizadas e as análises de citometria de fluxo de ensaio foram realizados como descrito na secção de Métodos. Os dados são mostrados como histogramas representativos (painel superior), intensidade de fluorescência média de valores triplicados de uma experiência representativa, as colunas, quer dizer; Barras, DP. (Painel inferior). Experimentos foram repetidos de forma independente 3 vezes em triplicado com resultados semelhantes.

Para determinar se ou não JAM-A participa de modular o crescimento de células de câncer de pulmão, foi utilizado siRNA para knockdown JAM-A expressão em H1299 e linhas de células A549. Em comparação com as linhas de controlo negativo transfectadas com ARNsi de células, JAM-específica-A siRNA níveis JAM-A proteína total efectivamente suprimido (Fig. 4A), JAM-A mRNA níveis (Fig. 4B), e os níveis de expressão de superfície (Fig. 4C) nas duas linhas de células testadas. A velocidade de crescimento celular foi determinado pelo ensaio de MTT. células H1299 e A549 transfectadas com específico-JAM-A siRNA tinha reduzido as taxas de crescimento em relação ao controle negativo siRNA (Fig. 5A). Em seguida, realizado um método independente (ensaio de formação de colónia) para validar o efeito anti-proliferativo de JAM-A inibição em células de cancro de pulmão. De acordo com os resultados do MTT, JAM-um knockdown eficazmente reduzida a capacidade de formação de colónias das 2 linhas celulares de cancro de pulmão testadas (controlo negativo contra JAM-A siRNA, H1229:231 ± 19 vs 55 ± 7, p 0,01 ; A549:420 ± 31 vs. 273 ± 21, p 0,01;. a Fig. 5B)

(a) análises de Western blot de JAM-a eficiência esgotamento em células cancerosas. Os dados são mostrados como Western blots representativos (painel esquerdo). análise de valor densitometria de 3 experimentos de Western blot independentes, os dados foram normalizados contra a GAPDH, Colunas, média; Barras, DP, ** p 0,01 (painel da direita). (B) em tempo real análises de PCR de JAM-A eficiência depleção em células de cancro, a quantidade relativa de JAM-A mRNA, normalizado para p-actina, foram comparados com o grupo transfectadas com ARNsi de controlo negativo com base na equação RQ = 2

-ΔΔCt. Colunas, com média de RQ em um experimento representativo; bares, max /min RQ. As experiências foram repetidas 3 vezes, independentemente, em triplicado, com resultados semelhantes. (C) A citometria de fluxo ensaio de análise de JAM-A eficiência esgotamento expressão de superfície. células H1299 e A549 foram transitoriamente seccionado com controle negativo siRNA ou JAM-A siRNA; após 48 h, as células foram tripsinizadas e as análises de citometria de fluxo de ensaio foram realizados como descrito na secção de Métodos. Os dados são mostrados como histogramas representativos (painel superior), intensidade de fluorescência média de valores triplicados de uma experiência representativa, as colunas, quer dizer; Barras, DP. ** P 0,01 (painel inferior). As experiências foram repetidas 3 vezes, independentemente, em triplicado, com resultados semelhantes.

de ensaio (A) de MTT foi realizado depois de JAM-tratamento Um siARN. Observou-se a absorvância a 490 nm a diferentes pontos de tempo. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de experiências representativas, * p 0,05; ** P 0,01. 3 experiências independentes com 5 repetições internas por experimentação foram realizadas com resultados similares. (B) Avaliação de potenciais clonogénicas das células cancerosas JAM-A-empobrecido. campos completos por placa foram fotografados e apresentados. Os dados são mostrados como ensaio colónia representativa formação (painel esquerdo), o número de colônias de valores em triplicado numa experiência representativa foi contado, Colunas, média; Barras, DP. ** P 0,01 (painel direito). 3 experiências independentes em triplicado foram realizados com resultados semelhantes.

Resultados de knockdown no Detenção G1 e Crescimento inibição de células de câncer de pulmão JAM-

A seguir, procurou investigar possíveis mecanismos pelos quais JAM -A knockdown pode diminuir a proliferação celular. Analisou-se o ciclo celular por células activadas por fluorescência (FACS), e mostrou que a percentagem de células na fase G1 foi aumentada (H1299, de controlo negativo contra a JAM-A siRNA, 57,8 ± 2,8 vs. 68,1 ± 2,5, p 0,01; controle negativo A549 vs. JAM-a siRNA, 57,12 ± 2,77 vs. 65.96.1 ± 2,52, p 0,05; a Fig. 6), enquanto que as células na fase S foram diminuídos em células tratadas com JAM-a knockdown em comparação para controlar células (H1299, controle negativo vs. JAM-a siRNA, 30,49 ± 2,8 vs 24,1 ± 2,74, p 0,05; controle negativo A549 vs. JAM-a siRNA, 29,33 ± 2,61 vs. 23.49.1 ± 2,49, p 0,05; Fig. 6). Estes resultados sugerem que a progressão do ciclo celular-A JAM prisões de exclusão no G1 /S limite. Para elucidar o mecanismo subjacente a JAM-A depleção em paragem do ciclo celular, testou-se ainda mais o efeito de JAM-um knockdown sobre o nível de expressão de factores vários celulares relacionadas com o ciclo, que incluem ciclina A, ciclina B, ciclina D1, CDK4, CDK6, P27, P21 e P-Rb. A análise por Western blot revelou que o knockdown de JAM-A reduziu os níveis de proteína de ciclina D1, CDK4, CDK6, e P-RB (Fig. 7). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a inibição da expressão JAM-A induz a paragem do ciclo celular na fase G1 e suprime o crescimento de células de cancro de pulmão.

Eficácia de JAM-um knockdown na progressão do ciclo celular foi analisado através de fluorescência-activada separação de células. Os dados são apresentados como uma experiência representativa (painel da esquerda), a percentagem de células em fase diferente do ciclo celular é mostrada como a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes, * p 0,05; ** P . 0,01 (painel direito)

(A) Análise de Western blot de um painel de proteínas foi realizado em siNC- ou linhas siJAM-transf-A H1299 celulares (painel esquerdo) e A549 linhas celulares (painel direito). Os dados são mostrados como Western blots representativos. Três experiências independentes foram realizados com resultados semelhantes. (B) análise de densitometria de 3 experimentos de Western blot independentes, os dados foram normalizados contra a GAPDH, Colunas, média; Barras, DP, * p 0,05; ** P . 0,01

PI3K-Akt-β-catenina Signal Cascade não é inibida por níveis elevados de expressão de superfície JAM-A em células de câncer de pulmão

Os estudos publicados indicam que JAM-A restringe a proliferação epitelial intestinal célula (IEC) por inibição da activação de PI3K-Akt-β-catenina cascata de sinal [27]. Para explorar se ou não esta via de sinalização também é eficaz em linhas celulares de cancro do pulmão, também testamos os níveis totais e fosforiladas de Akt em-um congestionamento de estudos de perda de função. A análise por Western blot revelou que o knockdown de JAM-A não alterou os níveis de actividade de Akt, o que sugere que níveis elevados de JAM-A em H1299 e células A549 não afectam a activação de PI3K-Akt-β-catenina cascata (Fig. 7).

Discussão

JAM-a é expressa em vários tipos de tumores e está implicada na progressão tumoral. A expressão de JAM-A proteína em tecidos NSCLC ea relação com vários fatores clínico-patológicas não foi totalmente examinado. Além disso, o papel exacto do JAM-A na progressão do câncer de pulmão não é clara. Neste estudo examinaram o padrão de expressão e a função biológica de JAM-A em NSCLC. Nós mostramos que JAM-A é predominantemente localizadas nas membranas celulares, ea expressão de JAM-A em tecidos de câncer de pulmão é maior do que correspondente tecidos pulmonares normais. O alto nível de expressão de membrana JAM-A foi significativamente associada com o estágio pTNM avançada, metástases em linfonodos, e reduziu a sobrevida global em pacientes com câncer de pulmão. Tomados em conjunto, os nossos resultados revelaram que JAM-A é um potencial de proteína oncogénica em NSCLC e poderá servir como um preditor negativo de sobrevida em pacientes com NSCLC.

Para explorar ainda mais a função potencial da JAM-A em células de câncer de pulmão , foi utilizado siRNA para knockdown JAM-a expressão em linhas de células H1299 e A549, que expressam níveis relativamente elevados de superfície JAM-a. A proliferação e a formação de colónias em duas linhas de células foi suprimida de forma significativa após o silenciamento JAM-A. A maioria dos factores de crescimento de células proliferativas influenciar por acção sobre a progressão do ciclo celular, analisou-se, assim, o ciclo celular e demonstraram que as células knockdown JAM-A tinham níveis mais elevados de fase G1 e inferior fase S do que as células de controlo. Assim, JAM-A silenciamento inibiu a transição G1 para S no ciclo celular, o que pode explicar o mecanismo de JAM-A sobre a proliferação de células de cancro de pulmão. Para determinar o potencial mecanismo de JAM-A na regulação do ciclo celular, que examinou o efeito de JAM-A knockdown em moléculas relacionadas com o ciclo celular. Analisou-se a expressão da ciclina A, ciclina B, ciclina D1, CDK4, CDK6, P21, P27, e P-RB, e descobriram que os níveis de expressão de ciclina D1, CDK4, CDK6, e P-RB foram diminuiu após JAM knockdown -A. Foi previamente demonstrado que a P-RB é responsável por um importante ponto de controlo G1, bloqueando a entrada na fase S e crescimento de células, ao associar fisicamente com factores de E2F e bloquear a activação da expressão do gene que codifica os produtos necessários para a progressão da fase S. O complexo de proteína composto por ciclina D1, CDK4, CDK6 e vai fosforilar P-RB e promover a inactivação P-RB. Continua na fosforilação de P-RB por vários CDKs conduz à libertação de E2F, facilitando, assim, a activação de genes críticos para a progressão da fase S [28], [29], [30]. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a JAM-A controla a proliferação de células NSCLC positivamente pela regulação da expressão das moléculas relacionadas com o ciclo celular, tais como ciclina D1, CDK4, CDK6, e P-RB.

Estudos publicados indicam que JAM-A restringe a proliferação IEC por inibição da activação de PI3K-Akt-β-catenina [27]. Para explorar se os níveis elevados de superfície JAM-A das duas linhas de células testadas ou não afeta negativamente a proliferação de células da mesma maneira como IEC, também testaram os níveis de ativos (fosforilação) de Akt em-um congestionamento de estudos de perda de função . A análise por Western blot revelou que o knockdown de JAM-A em H1299 e células A549 não alterou os níveis de actividade de Akt, o que indica que os níveis elevados de JAM-A em H1299 e células A549 não afectam a cascata de sinal de PI3K-Akt-β-catenina ativação.

O papel da JAM-A no crescimento do tumor e disseminação continua a ser um assunto controverso. Naik et al. [18] relataram que inicialmente JAM-A expressão é negativamente associados com a agressividade do cancro da mama e de metástases em 12 tumores e o correspondente tecido não neoplásico, bem como 50 maligna e as correspondentes amostras de linfonodos metastáticos. No entanto, Mc Sherry et ai. [21], usando maiores conjuntos de dados clínicos (um paciente microarray 270 tecido de cancro da mama invasivo [TMA] e um conjunto de informações a expressão do gene de 295 doentes com cancro da mama primário dados independentes), mostrou uma correlação positiva entre JAM-A expressão e invasiva prognóstico do câncer de mama, o que foi confirmado pelo seu outro relatório publicado utilizando um conjunto de dados maior [24]. Recentemente, Murakami et al. [22], usando TMA de 444 pacientes com câncer de mama invasivo, também relataram uma correlação similar. No contexto do cancro da mama invasivo, tendo em conta o conjunto de dados maior, a associação entre os dados e os dados de sobrevivência clinicopatológicas analisados ​​por McSherry et ai. [21], [24] e Murakami et al. [22], de alta JAM-A expressão deve ser um fator prognóstico negativo da evolução de pacientes. O mecanismo através do qual as células tumorais manter a alta JAM-A durante a progressão do tumor permanece para ser definido. Gotte et ai. [25] mostrou que o miR-145, que alvos e regula negativamente a JAM-A, é regulada negativamente em células de cancro da mama. Estes dados podem explicar os altos níveis de JAM-A neste tipo específico de tumor [22]. No entanto, se deve ou não miR-145 desempenha o mesmo papel em NSCLC no cancro da mama precisam de mais investigação. Deve notar-se que os efeitos positivos negativo, mas não de JAM-A sobre a progressão do tumor também foram apresentados com base em conjuntos de dados clínicos envolvendo carcinoma do endométrio [19] e cancro pancreático [20], o que sugere que o papel de JAM-A em progressão tumoral pode ser dependente do tipo de célula. Dados publicados com ênfase nos mecanismos de progressão do tumor JAM-A regulação, apesar de controversa, seria melhor esclarecer esta questão. Positivo [21], [22], [23], [24], [25], [26] e negativos [18], [19] efeitos da JAM-A na progressão tumoral foram relatados

In vivo

,

in vitro,

ou utilizando um modelo de tumor mamário genética.