Abstract

Fundo

O gene filhote e sushi vários domínios 1 (CSMD1), localizado no braço curto do cromossomo 8, codifica para um tipo I proteína transmembranar cuja função é actualmente desconhecida . expressão CSMD1 é frequentemente perdida em muitos cancros epiteliais. Nosso objetivo foi o de caracterizar as relações entre mutações somáticas CSMD1, desequilíbrio alelo, a metilação do DNA, e as características clínicas em pacientes com câncer colorretal.

Métodos

Nós sequenciaram o CSMD1 regiões de codificação em 54 tumores colorretais usando a plataforma 454FLX pyrosequencing para interrogar 72 amplicões que abrangem toda a sequência codificadora. Usamos rácios heterozigotos alelo SNP em múltiplos loci CSMD1 para determinar o equilíbrio alélicas e inferir perda de heterozigosidade. Finalmente, foi realizada metilação específicas de PCR em 76 tumores colorretais para determinar o estado de metilação do DNA para CSMD1 e conhecido alvos de metilação ALX4, RUNX3, NEUROG1 e CDKN2A.

Resultados

Usando 454FLX sequenciação e confirmar com Sanger de sequenciação, 16 CSMD1 mutações somáticas foram identificadas em seis dos 54 tumores colo-rectais (11%). A razão para nonsynonymous mutação sinónimo dos 16 mutações somáticas era 15:01, uma proporção significativamente mais elevada do que a relação de 2:01 esperada (p = 0,014). Esta relação indica a existência de uma selecção positiva para mutações na sequência da proteína CSMD1. CSMD1 desequilíbrio alélico esteve presente em 19 dos 37 casos informativos (56%). Os pacientes com desequilíbrio alélicas e mutações CSMD1 eram significativamente mais jovens (idade média de 41 anos) do que aqueles sem mutações somáticas (idade média de 68 anos). A maioria dos tumores foram metilados em um ou mais loci de CpG dentro da sequência de codificação CSMD1, e CSMD1 metilação significativamente correlacionado com dois alvos de metilação conhecidos ALX4 e RUNX3. C: G T:. Substituições A foram significativamente sobre-representados (47%), sugerindo extensa metilação da citosina predispondo a mutações somáticas

Conclusões

Deep sequenciamento amplicon e metilação específicas de PCR revelam que alterações CSMD1 pode correlacionar com a apresentação clínica mais cedo em tumores colorretais, portanto, implicando ainda CSMD1 como um gene supressor de tumor

Citation:. Shull AY, Clendenning ML, Ghoshal-Gupta S, Farrell CL, Vangapandu HV, Dudas L, et al . (2013) somáticas Mutações, perda do alelo, e metilação de DNA de o Cub e sushi vários domínios 1 (CSMD1) Gene Revela Associação com a idade precoce de diagnóstico em colorretais pacientes com câncer. PLoS ONE 8 (3): e58731. doi: 10.1371 /journal.pone.0058731

editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de novembro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 07 de março de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O suporte para este projeto foi fornecido pelo National Institutes of Health conceder 7R21CA127683. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum com aproximadamente 1 milhão de casos anuais em todo o mundo [1]. Este distúrbio é normalmente complexo caracterizado por uma abundância de mutações somáticas [2]. No entanto, cada tumor tem a sua própria paisagem mutacional única [3], e os mecanismos subjacentes que dão origem a essa paisagem diversificada são mal compreendidos. As mutações de activação da polipose adenomatosa coli (APC), Kirsten ras (KRAS), e fosfatidilinositol 3-quinase (PIK3CA) genes são muito comuns em cancros colo-rectais [4]. É provável que a combinação certa de mutações poderia dar um clone particular de células uma vantagem proliferativa. As mutações que causam ou contribuem para a progressão do tumor são comumente referidos como condutores, enquanto que mutações que não oferecem vantagem selectiva são comumente referidos como passageiros [5], [6], [7]. A maioria das mutações somáticas que se acumulam em tumores são silenciosas passageiros [8], [9], enquanto que pequenos subconjuntos de mutações são motores reais [10], [11]. Ao assumir que todos (sinônimos) mutações silenciosas são passageiros, a taxa de fundo de mutações somáticas no cancro colorectal foi aproximada a ser uma mutação per megabase [12]. Os genes que são mais frequentemente mutados que a taxa de fundo previu pode ser motores do desenvolvimento neoplásico. Ao assumir que todas as mutações silenciosas são passageiros e que não silenciosas (nonsynonymous) mutações podem ser tanto condutores ou passageiros, a proporção global de nonsynonymous a mutações sinônimas (NS /S) em um determinado gene pode fornecer evidências adicionais quanto ao facto de que o gene está sob selecção positiva ou negativa para alterações na sequência de aminoácidos. Genes que se acumulam mutações, ainda estão sob nenhuma pressão seletiva, têm uma esperada nonsynonymous para sinónimo (NS /S) proporção de aproximadamente 02:01. Esta proporção esperada baseia-se as duas primeiras posições de nucleótido no codão que ditam o aminoácido codificado e a terceira posição de “oscilação”, permitindo que a redundância de codões. Esta configuração mecânica do código genético cria duas vezes tantas oportunidades para uma determinada substituição de nucleótidos simples para alterar a sequência de aminoácidos que existem oportunidades para substituir um nucleótido ainda conservam a sequência de aminoácidos. Os genes com uma sobre-representação de mutações não sinónimas têm uma relação de NS /S que é estatisticamente significativamente mais elevada do que o esperado e 02:01 podem confiantemente ser assumida para estar sob pressão selectiva positiva para alterar a sequência de aminoácidos durante o processo de evolução do tumor [ ,,,0],13]. Portanto, uma alta taxa de NS /S de mutações somáticas pode fornecer dados estatísticos sobre se um gene mutante é um driver da progressão do tumor [3], [5].

O filhote e sushi vários domínios 1 (CSMD1) gene é um gene supressor de tumor candidato novo localizado no braço P do cromossoma 8 (2792875 4852328 …). CSMD1 é frequentemente mostrado para ser suprimido [14], [15], [16], mutado [2], [10], [17], ou metilado [14], [18], em muitos cancros. Na verdade, a expressão CSMD1 é frequentemente perdido no câncer de mama [19], ao passo que CSMD1 perde o equilíbrio alélicas em carcinomas de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) e cancros do pulmão [20]. . CSMD1 também tem se mostrado ser metilado em linhas celulares HNSCC [21]

O primeiro exão do CSMD1 abriga um metilado ilha CpG (cromossoma 8: 4.848.969-4.852.635) [21], uma sequência rica em C: G pares de bases contida dentro de CpG ou CpHpG contextos [22]. A ilha CpG Methylator Fenótipo (CIMP) [23] descreve um subconjunto de tumores colo-rectais que mostram elevada frequência de metilação de ilhas CpG específicos. Estes tumores CIMP têm assinaturas clínicos, patológicos e moleculares distintos, como localização proximal do tumor, pobre diferenciação e instabilidade de microssatélites. correlações clínicas importantes com CIMP também têm sido observadas em tumores da mama e do cérebro [24] que indicam que o fenómeno não é apenas tecido específico. Ainda não está claro se o estado CIMP faz ou está apenas associada a esses fenótipos. A metilação de genes específicos CIMP que apenas está aproximadamente correlacionada com a repressão da expressão do gene; portanto, outros mecanismos influenciam o comportamento clínico de tumores CIMP pode ser importante. substituições de nucleótidos da linha germinativa que envolvem de C: G T: A transições são pensados ​​para ser catalisada por metilação da citosina [25]. Estas substituições levar a uma sub-representação de todo o genoma de dinucleótidos CpG em comparação com o que é esperado por acaso. Genoma metilação tem, assim, influenciado evolução sequência do genoma e da paisagem polimorfismo da maioria dos vertebrados. Por um raciocínio semelhante, é possível que o status CIMP de células tumorais ou seus precursores pré-cancerosas (células-tronco) pode predispor genes para acumular C metilado: G T:. A mutações somáticas

mutações somáticas em tumores podem fornecer evidência histórica para CSMD1 silenciamento por metilação em células progenitoras câncer. As células-tronco do cólon localizados na base das criptas podem ser os principais alvos para a transformação maligna [26], [27]. As mutações que originam em células-tronco [28], [29], [30], [31] tem uma oportunidade para persistir o tempo suficiente para a acumulação de cooperar mutações oncogênicas. Embora o silenciamento epigenético de CSMD1 pode contribuir para o fenótipo transformado maligna, [32], [33], [34], [35], [36], [37], as mutações somáticas que se acumulam como resultado de metilação pode também contribuir para malignidade por mecanismos desconhecidos. Ao examinar vários métodos de alterações CSMD1 (mutação, metilação, e perda de alelo), observou-se correlações significativas de CSMD1 perda de função com a idade precoce do diagnóstico em pacientes com câncer colorretal. A correlação entre CSMD1 perda de função e apresentação clínica pode ajudar a fornecer uma visão sobre o desenvolvimento neoplásico do câncer colorretal.

Materiais e Métodos

Seleção de Tumor e DNA Isolation

De- espécimes cirúrgicos identificados foram obtidos a partir da Carolina biorrepositório Sistema Sul (Palmetto Saúde, Richland; Palmetto Saúde, Batista e Lexington Regional Medical Center, Lexington, Carolina do Sul). Este estudo foi realizado com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Palmetto Saúde, Lexington Medical Center, da Universidade da Carolina do Sul e Georgia Health Sciences University, e todos os consentimentos por escrito dos pacientes foram obtidas antes de estudar. dados clínicos de-identificados foi obtido a partir do tumor-registro, ea curadoria manual de registros de patologia foi realizado por pessoal dos bancos de tecidos.

Nós escolhemos 54 tumores colorretais microssatélites estável para este estudo. Todos os espécimes cirúrgicos foram fresco congelado, incorporado no composto corte temperatura ideal (Sakura Finetek, Torrence, CA), e seccionados. As amostras foram cortadas em fatias de espessura de 10 um e fixadas sobre lâminas de um silano Sigma-prep. As lâminas foram fixadas com 75%, 95%, e 100% de etanol e xileno. As fatias de início e fim de cada amostra de tecido foram coradas com soluções especificamente para obter os limites de tecidos tumorais de Hematoxilina de Mayer (Sigma, St. Louis, MO) e Eosina (Harleco, Lawrence, KS). Todos os dados da amostra do paciente são fornecidos na Tabela 1.

Extracções de tumor e células epiteliais normais de as fatias de tecido foram realizadas utilizando a técnica de micro-dissecção desenvolvido no nosso laboratório. As células tumorais e normais foram identificados por micro-dissecção com o uso de duas H E lâminas. Um patologista estava envolvido no processo de identificação de tecidos tumorais e normais. Tumor epitélio foi microdissecado a partir de secções de obter cerca de 100 ug de ADN. O ADN genómico foi depois isolado usando DNAdvance kit (Agencourt, Beverly, MA).

A quantificação de ADN genómico

A quantificação do DNA genómico isolado foi realizada com uma curva padrão de uma concentração conhecida de ADN humano e iniciadores de reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) para longo Intercaladas elemento nuclear sequências (LINHA) [58]. Os primers consistiu de uma linha (F) para a frente – AAAGCCGCTCAACTACATGG e uma linha (R) Reverso – CTCTATTTCCTTCAGTTCTGCTC (Tecnologias de ADN integradas, Coralville, IA). A quantificação do ADN foi preparado empregando-se 6,25 ul de iTaq SYBR SuperMix verde (Bio-Rad, Hercules, CA), 1,25 ul de 2 uM a linha F, 1,25 ul de 2 uM linha r, 2,5 ul de água de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), e 1,25 ul de molde de ADN. A amplificação do ADN foi realizada por meio de ciclos térmicos com o iCycler Thermal MyIQ (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando o seguinte protocolo: desnaturação a 95 ° C durante 1 min; 60 ciclos a 94 ° C durante 10 seg, 62 ° C durante 45 seg, e 62 ° C durante 5 min. As concentrações de modelos finais de tumor e DNA normal, foram 3 ng /mL.

Triagem de microssatélites Instabilidade em tumores

A detecção de tumores deficientes em reparação incompatibilidade foi realizada através da amplificação de micro satélite local, de modo que os tumores mostrando fenótipo hypermutator poderia ser excluída. Todos os tumores foram inicialmente pré-rastreados para a instabilidade microssatélite (MSI), utilizando iniciadores BAT26, e aqueles com instabilidade foram excluídos. Posteriormente, os tumores com mutações somáticas para CSMD1 foram analisados ​​com três loci adicionais NCI MSI: BAT25, D2S123 e D17S250 primers. Os iniciadores utilizados estão listados na Tabela S1 no arquivo S1 (Tecnologias de ADN integradas, Coralville, IA). Nenhum dos tumores mostrou instabilidade no locus BAT26, e apenas uma amostra (ID Tumor 587) apresentaram instabilidade de microssatélites moderada a BAT25 lócus. Os amplicons de PCR foram gerados com o seguinte protocolo: PCR Master Mix foi preparado utilizando 5 ul de tampão KAPA 5x HiFi (KAPA Biosystems Woburn, MA), 0,75 ul de dNTPs 10 mM, 3,00 ul de iniciadores (concentração final 2,5 uM), 0,50 ul de KAPA HiFi HotStart polimerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,00 ul de 10X de SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8,75 ul de água de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1 ul de molde de ADN a 3 ng /ul. ciclagem térmica foi realizada num iCycler Thermal MyIQ (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando o protocolo seguinte: 1 ciclo de 95 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 63 ° C durante 15 seg e 72 ° C durante 15 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 15 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 20 seg, 57 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 15 seg; 49 ciclos de 98 ° C durante 20 seg, 56 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 15 seg; 1 ciclo de 55 ° C durante 30 seg; 80 ciclos de 55 ° C durante 30 seg. Os produtos de PCR foram corridos em géis de TBE-ureia a 10% (Bio-Rad, Califórnia, EUA) de acordo com as directrizes do fabricante e fotografadas utilizando um software de ™ Alpha Imager e Quantity One (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Preparação de amplicons para Sequencing

os exons para genes CSMD1 e KRAS foram identificados com o Visualizador Sequence no site NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer) . Os iniciadores de PCR foram concebidos para os 71 exons de CSMD1 e por 2 mutações hotspot comuns em KRAS (exão 2, códon 12 e 13), utilizando o software de fonte aberta Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input .htm;. (Tabela S1 no arquivo S1) KRAS foi sequenciado apenas nos hotspots de mutação devido a provar restrições para a frente e sequências de marcação, 454a e 454.oB, respectivamente, foram adicionados aos iniciadores, conforme descrito no Guia para Amplicon Sequencing reversa (454. Ciências Biológicas, Branford CT). amplicons de PCR para 454 sequenciamento foram gerados usando 7,5 mL de tampão KAPA 5x HiFi (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,125 mL de 10 mM de dNTPs, 2,25 l de iniciadores (concentração final de 2,5 mM), 0,75 mL de KAPA HiFi HotStart polimerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), e 1 ul de molde de ADN a 5 ng /ul ciclagem térmica foi realizada utilizando um MyIQ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA) e o seguinte protocolo de touchdown:. um ciclo, 95 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 94 ° C durante 10 seg, 64 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 s; 3 ciclos de 94 ° C durante 10 seg, 61 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 3 ciclos de 94 ° C durante 10 seg, 58 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 50 ciclos de 94 ° C durante 10 seg, 57 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 3% e fotografados utilizando um gerador de imagens Alfa e software Quantity One ™ (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Amplicons foram purificados usando esferas SPRI Ampure (Agencourt, Beverly, MA) seguindo o protocolo do fabricante.

Sequencing com Platform 454FLX

Os talão purificado produtos de PCR SPRI-Ampure (CSMD1 e KRAS) foram quantificados usando o Quanti-iT PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) e Fluoroskan Ascent FL

(

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Os amplicons foram amplificados por emulsão de PCR utilizando o emPCR Kite II e III (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) e bi-direcional sequenciado na GS FLX sequenciador 454 genoma (University of South Carolina Ambiental Genomics Núcleo Facility, Columbia, SC). Os amplicons de cada um dos 54 tumores, bem como 2 amostras normais emparelhadas, foram sequenciados para uma profundidade média de 1.800 vezes com mais de 90% dos amplicões representados pela sequência superior a 300 leituras por amostra. Mais de 500.000 sequenciamento indivíduo lê foram obtidos a partir dos fragmentos amplificados.

Variant Analysis Detecção

O sequenciamento 454FLX lê foram alinhados com a sequência de referência a partir do NCBI (hg19 Construir 37) e analisados ​​utilizando o Genomics CLC software Workbench 4 (CLC Bio, Aarhus, Dinamarca). Foram analisados ​​os dados de sequenciamento derivadas de tumores colorretais e amostras normais pareados usando a ferramenta de detecção Variant probabilística fornecido pela Genomics Workbench. As mutações observadas no tecido complementar o normal, a base de dados dbSNP, ou o Projecto Genoma 1,000 foram considerados mutações da linha germinativa. As mutações restantes foram considerados como susceptíveis mutações somáticas. Nossas chamadas mutações foram feitas sob critérios de sequenciação robustos e rigorosos estabelecidos pela CLC Genomics Workbench com uma chamada de probabilidade de 100, a fim de excluir quaisquer observações de mutação falsos. Quaisquer extensões de homopolímeros também foram excluídos da nossa análise de dados. Também foram excluídos descoberto inserção /deleção (INDEL) variantes do nosso estudo, uma vez que 454FLX sequenciação não é sensível na detecção de INDEL de.

Somatic Mutation Validação através Sanger Sequencing

seqüenciamento Sanger da alta concentração variantes foi realizada a fim de confirmar as mutações somáticas identificados pela análise de detecção de variante. Beckman Coulter /Agencourt Serviços Genomic (Beverly, MA) e os genômica principais instalações na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia realizou o sequenciamento Sanger, utilizando os mesmos 454a e B marcas descritas anteriormente com o sequenciamento 454FLX. Os amplicons de PCR foram gerados com o protocolo seguinte: PCR Master Mix foi preparada usando 7 ul de água de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ul de 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 ul de mistura de iniciadores ( concentração final 2,5 uM), e 1 ul de molde de ADN a 3 ng /uL. ciclagem térmica foi realizada com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 98 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 63 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 57 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 49 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 56 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 1 ciclo de 55 ° C durante 30 seg; 80 ciclos de 55 ° C durante 80 ciclos. cromatogramas Sanger foram analisados ​​utilizando CLC Genomics Workbench 4. Depois de ser validada pelo seqüenciamento Sanger, as mutações somáticas CSMD1 foram registrados e depositados na Leiden Abrir Variação banco de dados (Lovd) (Universidade de Leiden Medical Center, Holanda).

Allelic Saldo Teste de 454FLX CSMD1 Sequências

Foi utilizado o Probabilidade sequencial de teste da taxa (SPRT) para detectar desequilíbrios alélicas estatisticamente significativas nas amostras de tumor [39], [40]. O SPRT foi projetado para testar duas hipóteses concorrentes usando observações sequencialmente acumulados ao longo do tempo contra limites pré-especificados superior e inferior dos dados [59]. Hipótese 1 é que os alelos estão equilibrados, então as proporções alélicas esperados em loci informativo deve ser de 50%. 2 hipótese é que um dos dois alelos presentes na amostra normal está completamente ausente no tumor, de modo que a proporção de alelos em loci dominante esperado informativo deve ser de 100% para as amostras tumorais não contaminados com DNA normal. Em casos submetidos à LOH em que o ADN do tumor está contaminado com DNA normal, até 50%, a proporção dominante alélica esperado é de 66,7%. Confiança intervalo curvas foram construídas para identificar correctamente os alelos equilibradas e desequilibradas em toda a gama de contagens totais de alelos observados nos dados 454FLX, permitindo até 50% de contaminação de tumor com ADN normal. A curva superior estabelecer o limite de desequilíbrio alélico, ao passo que a curva inferior estabelecer o limite de equilíbrio alélico. Se proporção alelo de um tumor exceder o limite superior do tumor foi classificada como desequilibrado. Em contraste, se a proporção alelo é menor do que a curva limite inferior, o tumor foi classificado como equilibrada. Se a proporção de alelos observados ocorreram entre as duas curvas, as amostras foram classificadas como indeterminado. Em todos os casos, dois ou mais alelos informativos foram obrigados a estar fora de equilíbrio para chamar um tumor desequilibrado.

Análise da expressão de mRNA CSMD1 em HCT116 WT e HCT116 DNMT1 /DNMT3B DKO

A expressão de CSMD1 ARNm foi determinado efectuando quantitativa PCR em tempo real em HCT116 e WT ADNc NSO HCT116 DNMT1 /3B. HCT116 wt e cDNA de NSO DNMT1 /3B foi gerado pelo primeiro isolar o ARNm de cada utilizando Dynabeads estojo de isolamento de ARNm (Invitrogen, Carlsbad, CA) e em seguida foi convertido em cDNA usando Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os amplicons de PCR foram gerados com o protocolo seguinte: PCR Master Mix foi preparado usando 3 ul de água de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ul de 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 ul de mistura de iniciadores (Final concentração de 2,5 ^ M), e 5 ul de molde de ADNc. ciclagem térmica foi realizada com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 98 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 64 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 61 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 3 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 58 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 57 ° C durante 10 seg, 70 ° C durante 30 seg; 1 ciclo de 95 ° C durante 30 seg; 80 ciclos de aterragem gradiente a partir de 95 ° C e a diminuir em -5 ° C cada ciclo.

análise de metilação usando PCR específica de metilação /alta resolução Melt análise da curva

ADN purificado a partir de tumores e linhas de células de controlo por parte do Agencourt DNAdvance kit (Beckman Coulter Genomics, Beverly, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Duzentas nanogramas de DNA genómico foi modificado por bissulfito o EZ Metilação de DNA – Kit de ouro (Zymo Research), seguindo o protocolo do fabricante. HCT116 e o ​​duplo knockout HCT116-DNMT1 /3B (NSO) de ADN [43], foram utilizados como controlos positivos e negativos para o estado de metilação de todos os genes examinados. CSMD1 é metilado e não expressa nas células do tipo selvagem HCT-116. Em contraste, CSMD1 é não metilado e expresso em células NSO [60]. CSMD1 gene de metilação foi consultado em 3 posições e foram nomeados CSMD1-1 (CHR8: 4.852.196-4.852.032), CSMD1-3 (4.851.450-4.851.301) e CSMD1-5 (4.851.422-4.851.291). A metilação específica iniciadores de PCR utilizados são mostrados na Tabela S2 em S1 Ficheiro. Cada tumor gerado um produto autêntico, quer com iniciadores metilados ou com os iniciadores não metilados, mas nunca ambos. Casos em que não foi observado com qualquer par de primers foram consideradas pouco informativo. Os resultados metilação dos tumores são mostrados na Tabela S3 em S1 Ficheiro.

A metilação de PCR específica /elevada resolução derreter análise da curva foi executado de acordo com protocolos anteriormente descritos [61]. A reacção de PCR foi realizada utilizando 3-6 ng de ADN modificado com bissulfito num volume total de 20 uL, contendo 12,5 ul de 2X KAPA SYBR RÁPIDO qPCR Mistura Principal (KAPA Biosystems Woburn, MA), (para a análise genómica posição 3265577 KAPA GRH rápido kit de PCR foi usado); e 2.5pmol de iniciadores [62]. As condições dos ciclos de reacção foram de 94 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 30 seg a 94 ° C, temperatura de recombinação específico do gene durante 30 seg, extensão a 72 ° C durante 30 seg, e uma janela de recolha de dados em 76- 77 ° C durante 30 seg. Associação curvas foram geradas para todos os produtos, e a presença ou ausência de produtos autênticos foi determinada por comparação com os controlos positivos e negativos. Todas as reacções foram realizadas utilizando um MyIQ cor única Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad).

Análise Estatística

probabilidade binomial foi usado para comparar a significância entre nonsynonymous a mutações somáticas sinônimo de CSMD1 em pacientes colorectais. Comparação da idade média de diagnóstico ou o quadro clínico para pacientes geneticamente equilibrado e desequilibrado com mutações somáticas foram feitas pelo teste de Mann-Whitney. Spearman foi utilizado para comparar as relações entre loci metilado.

Resultados

Frequências e caráter de Somatic Mutações

O gene CSMD1 se estende por 2,05 MB de DNA genômico no p braço do cromossoma 8. a porção da sequência codificante do gene é 11.740 nucleótidos (0,0234 MB por genoma diplóide). Nós sequenciados um total de 54 tumores colorretais igualando a 1,26 MB de DNA CSMD1 CDS. Foram identificados e Sanger verificados 16 mutações somáticas em 6 dos 54 tumores colorretais (11%) (Tabela 2). A seguir, calculou uma taxa de mutação somática de 11,90 mutações /MB, uma taxa que é visivelmente maior do que as taxas de mutação de fundo de todo o genoma de cânceres microssatélites estável colorretal [3], [38].

as mutações somáticas foram significativamente enriquecida para modificações nonsynonymous em comparação com alterações sinónimas. Para o Sanger confirmou variantes, foram identificadas 15 mutações nonsynonymous (NS) e 1 sinónimo (S) mutação, para uma proporção NS /S de 15:01. A probabilidade de isso muitas (ou mais) nonsynonymous mutações que ocorrem apenas por acaso é 0,014, argumentando contra a hipótese de que CSMD1 é um gene passageiro afectado por um fenótipo mutante. A explicação mais provável é que as mutações nonsynonymous são selecionados para durante o desenvolvimento do cancro colo-rectal. É importante notar que o tumor tinha 10 517 mutações somáticas para CSMD1, dos quais nove eram nonsynonymous. A probabilidade de isso muitas mutações nonsynonymous que ocorrem por acaso é de 0,1. A hipótese alternativa é que a pressão selectiva conduziu a acumulação de múltiplas variantes nonsynonymous CSMD1 dentro do mesmo tumor, possivelmente, residente em subclones separados. Os subconjuntos de variação de frequências de mutação em CSMD1 aludir a esta crença de que as múltiplas mutações CSMD1 surgiu a partir dos subclones separados na mesma população de tumor (Figura 1).

Dez CSMD1 mutação somática foram encontradas no tumor 517. No entanto, estes determinadas mutações ocorrem em diferentes subconjuntos de concentrações, o que indica que cada subconjunto pode ter surgido a partir de um clone independente dentro da população de tumor.

uma vez que a progressão do adenocarcinoma pode ser impulsionado por mutações do oncogene KRAS, analisamos os hotspots de mutação nos codões 12 e 13 do exão 2 utilizando sequenciamento Sanger de produtos de PCR. KRAS hotspot mutações somáticas foram observadas em 21 dos 54 tumores colorretais (~39%). Três tumores continham mutações somáticas em ambos CSMD1 e KRAS, com dois dos três tumores que mostram uma maior frequência CSMD1 alelo mutante do alelo mutante KRAS (Tabela 1). Este resultado pode indicar que as mutações somáticas CSMD1 anteriores mutações somáticas KRAS, que se pensa ocorrer precocemente durante a progressão do tumor colorrectal. Um tumor tinha concentrações de alelos mutação CSMD1 que foram menos do que a concentração alelo mutante KRAS, talvez indicando que as mutações em CSMD1 este tumor ocorreu após as mutações KRAS. Ainda assim, o clone albergando o alelo mutante CSMD1 expandido suficientemente para permitir que o alelo mutante CSMD1 a ser detectado, demonstrando que esta expansão não foi impulsionado pelo alelo mutante KRAS. A fim de determinar adequadamente os prazos para mutações CSMD1 e KRAS, será necessária a análise da sequência carful de lesões precoces, como adenomas. No entanto, as nossas observações indicam que CSMD1 mutações nonsynonymous fornecer células tumorais com uma vantagem selectiva, que opera independentemente da vantagem proporcionada por mutações KRAS.

Colorectal Tumores com CSMD1 LOH e Somatic Mutações início show Apresentação Clínica

Fora dos 54 tumores sequenciados, Trinta e sete tiveram dois ou mais loci que foram heterozigotos para variantes da linha germinativa e poderia, portanto, ser avaliado para CSMD1 desequilíbrio alélico pelo Teste seqüencial da Razão de Probabilidade [39], [40]. Cinquenta e um por cento (19/37) dos tumores colo-rectais foram desequilibrado em dois ou mais loci CSMD1 contígua (Figura 2, Tabela 1), indicando que a perda de heterozigotia CSMD1 poderia ter ocorrido nestes tumores. Embora a diferença não foi estatisticamente significativa, a idade média do diagnóstico em pacientes com desequilíbrio CSMD1 alélicas era mais jovem do que aqueles com alelos equilibrados (60 anos vs. 69 anos, Mann-Whitney p = 0,052). A média de idade no momento do diagnóstico para pacientes com CSMD1 mutações somáticas também era mais jovem do que para aqueles sem mutações somáticas (58 anos versus 66 anos), embora essa diferença também não foi estatisticamente significativa. A perda de heterozigosidade é um mecanismo que coopera com mutação somática para inactivar genes supressores de tumores. Observou-se que pacientes com ambos os alelos CSMD1 desequilibradas e mutantes eram significativamente mais jovens na idade do diagnóstico (41 anos) do que pacientes com tipo CSMD1 equilibrada e selvagem (68 anos, Mann-Whitney p = 0,0077). Em contraste com os nossos estudos anteriores [17], não se observou uma relação significativa entre CSMD1 estado de mutação somática e estágio do tumor nesta série de amostras. No entanto, a evidência estatística relativa apresentação clínica coincide com estudos recentes realizados pelo The Cancer Genome Atlas (TCGA). Com base em uma análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, os dados de sequenciamento TCGA revelou que pacientes com câncer colorretal com alterações CSMD1 têm uma probabilidade significativamente menor de sobrevivência do que os pacientes sem alterações CSMD1 (teste log-rank p = 0,000565) [41]. Com tais dados, a identificação de alterações CSMD1 tem o potencial para ser utilizados como marcadores de prognóstico do cancro colo-rectal.

A curva limite superior mostrado no gráfico demonstra o limiar de IC 95% de CSMD1 loci sendo classificados como desequilibrada, enquanto a curva limite inferior demonstra o limite IC 95% dos CSMD1 loci ser classificado como equilibrado. Tumores com dois ou mais loci contígua que foram desequilibrados foram classificados como tendo perda sofrida de heterozigose. Loci que caiu entre os dois limiares foram consideradas indeterminadas para a caracterização de alelos. Certain loci em CSMD1 demonstrou equilíbrio alélicas, se residissem em tumores que estavam desequilibrados para CSMD1. Este resultado faz alusão a cromossômicas quebras que ocorrem dentro da sequência do gene CSMD1, a jusante do loci examinados

Excesso de CG . TA mutações e CSMD1 metilação

exome sequenciação do cancro colorectal tem revelou que vários tumores têm excesso global de GC de TA mutações somáticas [2], [3]. Observou-se 7 dos 15 (46,7%) CSMD1 mutações somáticas foram GC transições TA (Tabela 2). Esta classe de mutação surge a partir de desaminação não-enzimática de 5′-metilcitosina para produzir timidina.

Tabela S1. Tabela S2. Tabela S3.