Abstract

Fundo

O cancro do pulmão é a neoplasia maligna mais comum em humanos e sua alta letalidade significa que nenhum tratamento eficaz está disponível. Desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o cancro do pulmão é urgentemente necessário. A malária tem sido relatado para estimular a resposta imune do hospedeiro, que se acredita ser eficaz para combater alguns tipos de câncer clínicos. Este estudo tem como objetivo fornecer evidências de que a infecção parasita da malária é terapêutico para o câncer de pulmão.

Metodologia /Principais Achados

efeito antitumoral de infecção por malária foi examinada tanto por via subcutânea e murino por via intravenosa implantado câncer de pulmão Lewis modelo (LLC). Os resultados mostraram que a infecção por malária inibiu o crescimento e a metástase LLC e prolongou a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor. A análise histológica de tumores provenientes de murganhos infectados com malária revelou que a angiogénese foi inibida, o que se correlacionou com um aumento de desoxinucleotidilo terminal de mediadas-transferase (TUNEL) e coloração diminuiu Ki-67 em tumores. Através natural killer (NK) actividade de citotoxicidade celular, ensaios de citocinas, ensaio enzyme-linked immunospot, a proliferação de linfócitos, e citometria de fluxo, que demonstrou que a infecção de malária fornecida efeitos anti-tumorais através da indução de tanto um anti-tumor resposta imune inata potente, incluindo o a secreção de IFN-γ e TNF-α e a activação de células NK, bem como a imunidade anti-tumoral adaptativa com o aumento da proliferação de células T específicas do tumor e a actividade citolítica de células CD8

+ células T. Notavelmente, os ratinhos portadores de tumor infectadas com o parasita desenvolvido de longa duração e uma imunidade eficaz específico para o tumor. Consequentemente, verificou-se que a infecção parasita da malária pode aumentar a resposta imune da vacina DNA câncer de pulmão pcDNA3.1-hMUC1 ea combinação produziu um efeito antitumoral sinérgica.

Conclusões /Significado

infecção da malária de forma significativa suprime o crescimento LLC via indução de respostas antitumorais inata e adaptativa em um modelo de rato. Estes dados sugerem que o parasita da malária pode proporcionar uma nova estratégia terapêutica ou vector de vacina para a terapia de base imunitária anti-cancro do pulmão

citação:. Chen L, Ele Z, Qin G, Li Q, Shi X, Zhao S, et al. (2011) antitumoral Efeito do Parasita da malária Infecção em um modelo de cancro do pulmão murino Lewis através da indução de inata e imunidade adaptativa. PLoS ONE 6 (9): e24407. doi: 10.1371 /journal.pone.0024407

editor: Hong Wei Chu, National Jewish Saúde, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de maio de 2011; Aceito: 08 de agosto de 2011; Publicação: 09 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chen et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio das ciências naturais Fundação Nacional da China (No. 81.001.022 de ZH), uma concessão do Laboratório Principal Estado de Doenças respiratórias de XC, e uma concessão do CAS-FS Biotech Pharmaceutical e Centro de XC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Embora os métodos de tratamento em cirurgia, radiação e quimioterapia foram melhorados, o prognóstico continua a ser insatisfatória, e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas ainda é uma demanda urgente. A imunoterapia pode representar uma das novas estratégias terapêuticas para o cancro do pulmão foi recentemente desenvolvido [2] – [5]. O objectivo da imunoterapia do cancro do pulmão é a aumentar a resposta imune do hospedeiro contra tumores enfraquecida usando estimulantes imunes específicos e /ou não específicos [4] – [6]. agentes imunoestimulantes não específicos e intervenções com citocinas têm limitado benefícios clínicos. A imunoterapia dirigida ao alvo com antigénios tumorais definidas, tais como antigénio associado ao melanoma e 3 1 de mucina (MUC-1), são necessários agentes adjuvantes são sub-óptimos e fortes [6], [7]. Além disso, é agora claro que o câncer de pulmão, muitas vezes apresentam um microambiente tolerogênico que dificulta a imunidade anti-tumoral eficaz. Portanto, a nova imunoterapia potente e eficaz, ambos são necessários aumentar a imunidade anti-tumoral e combater a imunossupressão mediada por tumor de câncer de pulmão.

A malária, que é causada por um parasita intracelular do

Plasmodium

género, é a infecção parasitária mais comum nos seres humanos. infecção pelo parasita da malária humana pode produzir febres periódicas elevados na fase aguda. A hipertermia tem sido usado clinicamente para o tratamento de certos tipos de cancro [8] – [11]. Além disso, a malária tem sido relatado para estimular as respostas imunitárias do hospedeiro, tais como a promoção da produção de IFN-γ, activação de células assassinas naturais (NK), γδ células T e as células NKT, induzindo a maturação das células dendríticas (DC), e estimulando-células T proliferação [12], [13], que se acredita ser eficaz para combater alguns tipos de câncer clínicos [14] – [16].

neste estudo, propomos que a infecção pelo parasita da malária é terapêutico para o câncer de pulmão. O efeito anti-tumoral e mecanismos imunológicos da infecção por malária, foi estudada num modelo de cancro de pulmão de murino. Descobrimos que

Plasmodium yoelii

17XNL (

P. Yoelii

17XNL) infecção inibiu significativamente o crescimento e metástase de câncer de pulmão de Lewis (LLC). Além disso, foi demonstrado que a infecção por malária fornecida efeito antitumoral através da indução de imunidade antitumoral potente inata e adaptativa.

Resultados

Supressão do crescimento LLC e desenvolvimento de metástases em camundongos por infecção parasita da malária

Para determinar o efeito da infecção da malária sobre o crescimento de células LLC, que infectados ratinhos portadores de tumor semeada com uma injecção subcutânea (sc) de células LLC com

P. yoelii

17XNL parasitados eritrócitos (LLC + Py) ou com um número equivalente de eritrócitos não infectados (LLC). Durante o período infeccioso da malária (Fig. S1), o crescimento de células tumorais foi claramente reprimida no grupo Py LLC + em comparação com o grupo de LLC (Fig 1A . B). Os volumes dos tumores (

P = 0,0006

, Fig. 1A) e os pesos dos tumores (

P

. 0,0001, figura 1B) foram significativamente menores no grupo Py ratinhos LLC + em comparação com os ratos do grupo LLC. Em seguida, determinaram o efeito de infecção por parasita da malária em metástases de cancro do pulmão através da análise da ocorrência de metástases distantes do pulmão e do fígado no dia 35 pós-inoculação das células de tumor. Descobrimos que enquanto o grupo controle LLC exibiu uma alta frequência de metástase (10 de 10 ratos, 100%), metástase no grupo Py LLC + só foi observada em 1 de 10 animais (

P Art 0,0001 , a Fig. 1C e A Fig. S2). Esta experiência foi depois realizada utilizando um modelo metastático mais agressivo produzido por via intravenosa (i.v.) a injecção de células tumorais em ratinhos [17]. Semelhante ao anterior s.c. modelo de tumor, infecção parasita da malária reduziu significativamente o número de metástases que se desenvolveram no pulmão (

P

= 0,0057, Fig 1D . E). Além disso, os ratinhos portadores de tumor infectadas pelo parasita da malária sobreviveram muito mais tempo do que as suas contrapartes não infectadas (

P = 0,0002

, fig. 1F). metástases à distância são uma das principais razões para a morte relacionada ao câncer em pacientes com tumores sólidos [18]. Portanto, o tratamento combinado ea malária infecção cirúrgica para verificar suas atividades antimetastáticos. O tumor primário removido cirurgicamente foi depois da formação do tumor. Cinco dias mais tarde, metade dos ratinhos foram infectados com

P. yoelii

e os outros foram não infectados (Fig. 2A). Os resultados mostraram que os ratinhos portadores de tumor infectadas com parasitas sobreviveram muito mais tempo do que as suas contrapartes não infectadas após a cirurgia (

P = 0,0246

, Fig. 2B). Esta observação sugere para efeitos da infecção por parasita da malária contra medidas no final do processo metastático depois da invasão de vasos sanguíneos por células tumorais metastáticas.

A, o crescimento tumoral foi medido ao longo do tempo (n = 12). O gráfico mostra a média com SD. B, a massa tumoral 17 dias após a inoculação de células de tumor (n = 10). C, o desenvolvimento de metástase de 35 dias após a inoculação do tumor. O gráfico mostra o número de tumores de pulmão e fígado nos ratos LLC e LLC + Py (n = 10). D, número de nódulos de tumor de pulmão em ratinhos 18 dias após a inoculação do tumor intravenosa (n = 21). E, exemplos dos nódulos metastáticos nos pulmões de ratinhos em D. F, A curva de sobrevivência dos ratos do grupo de LLC e LLC + Py (n = 11). Todas as experiências foram realizadas três vezes com resultados semelhantes. As diferenças estatísticas entre os grupos são indicados pelos

P valores

.

A, 5 × 10

5 células LLC foram injectados s.c. no flanco direito de ratinhos C57BL /6. Após 15 dias de crescimento tumoral, tumores primários foram removidos cirurgicamente. Os ratinhos foram seguidos por um período adicional de 5 dias para a recuperação, em seguida, metade dos ratinhos foram infectados com

P. yoelii

17XNL e os outros foram injetados com um número equivalente de eritrócitos não infectados. B, os dados mostram as curvas de sobrevivência de ratos após a remoção do tumor primário.

P. yoelii camundongos infectados

17XNL sobreviveram muito mais tempo do que suas contrapartes não infectados (n = 11).

Efeito da infecção pelo parasita da malária sobre a proliferação de células tumorais, a apoptose e angiogênese

Como mostrado na Figura 3, a coloração para o marcador de proliferação Ki67 mostra supressão significativa de proliferação em ratinhos do grupo Py LLC +, em comparação com os ratinhos do grupo LLC (

P

= 0,0022, a Fig. 3a). Enquanto isso, as células de apoptose foram marcadamente aumentada nos tumores do grupo de ratinhos LLC + Py versus os ratinhos do grupo LLC (

P = 0,0079

, Fig. 3B), como evidenciado pela desoxinucleotidil-transferase terminal de mediada (TUNEL) coloração de tumores no dia 17. em seguida, os vasos sanguíneos do tumor foram examinadas para determinar se a diminuição observada da proliferação e aumento da apoptose foram afectados pela poda vascular [19]. A coloração das células endoteliais nos vasos sanguíneos com CD31 mostrou extensa vasculatura tumoral entre ninhos de tumor em ratinhos LLC grupo marcado contra supressão angiogénico nos ratinhos LLC grupo Py + (

P = 0,0022

, Fig. 3C e Fig. S3 ).

a-C, coloração imuno-histoquímica (à esquerda) e quantificação do ensaio (direita, n = 5-6) para Ki-67 (a), TUNEL (B), e CD31 (C) as análises do amostras de tumor na Fig. 1B. Cada símbolo corresponde a um animal individual. A linha representa o valor médio. Barras: 25 uM em A, 50 um de B e C.

A indução de citocinas de tipo Th1 e aumento de actividade de citotoxicidade de células NK e infiltração

O anti-tumoral potente atividade da infecção por malária nos estimulou muito a explorar ainda mais a sua profunda mecanismo. O sistema imune inato que é acreditado para produzir citocinas de protecção e activar linfócitos inatas fornece o caminho para resistir rapidamente do tumor [20]. Descobrimos que a infecção pelo parasita da malária levou a um rápido aumento na IFN-γ e os níveis de TNF-α, atingindo um máximo de 3 dias após a infecção (Figura 4A . B), e a actividade lítica de células NK aumentou significativamente durante as fases iniciais da infecção ( A Fig. 4C). Embora a percentagem de células NK em-drenagem tumorais gânglios linfáticos (TdLNs) não foi significativamente diferente entre os grupos (FIG. 4D), infecção parasitária aumentou o número de células NK granzima B secretoras em TdLNs (Fig. 4E). Um aumento tanto no número de células NK e células NK granzima secretoras B foi observada em tecido de tumor na LLC + grupo Py (Figura 4F . L), sugerindo que depois da infecção parasitária, células NK-se infiltram no tumor exibem maior

in situ

atividade citotóxica. Estes resultados confirmaram que a infecção da malária tem uma função na activação da resposta imune inata, que actua para controlar o crescimento de células LLC inoculados.

A e B, os níveis de IFN-γ (A) e TNF-α (B) nos sobrenadantes da cultura de esplenócitos como medido por ELISA (n = 4). C, A citotoxicidade de células NK enriquecidas a partir de esplenócitos em vários pontos de tempo foi avaliado contra as células YAC-1 nas proporções indicadas efector-para-alvo (E:T) (n = 4). D e E, cinco dias após a inoculação do tumor, a percentagem (D) e a granzima B-secreção de (E) das células NK foram determinados em TdLN e TNLN de ratinhos por citometria de fluxo (n = 6). F e G, os números absolutos de células que se infiltram no tumor NK (F) e células NK produtoras de granzima B espontânea (G) foram quantificadas por citometria de fluxo e normalizada para o peso da biópsia (n = 6) 17 dias após a inoculação do tumor. Estes experimentos foram realizados de forma independente três vezes com resultados idênticos, e os gráficos de dispersão representativos são mostrados. Todos os gráficos mostram a média com SD. *,

P

0,05

A indução de respostas imunitárias anti-tumor específica do

Devido à fraca imunogenicidade de células LLC, estudar o antigénio (. Ag) resposta imune espec�ico para as células LLC é um desafio [21]. Portanto, foi gerada uma linha celular de LLC recombinante (LLC-MUC1) que expressa MUC1 (Fig. S4) para examinar o tumor respostas imunes específicas de Ag-induzidas pela infecção pelo parasita da malária. De modo a confirmar ainda mais a resposta imune para ser tumoral Ag-específico, não-rato específico auto-Ag, utilizou-se um MUC-1 exógena (MUC1 humana) para gerar a linha de células LLC-MUC1. MUC-1 humano é altamente imunogénica em murganhos e a sua epitopo é muito claro de modo que seja conveniente para nós para examinar o tumor respostas imunes específicas de Ag-. células LLC-MUC1 e as células LLC parentais não mostraram qualquer diferença significativa no crescimento e características morfológicas in vitro, e também mostrou uma taxa de crescimento in vivo semelhantes (dados não mostrados).

Dado o papel central de DCs em iniciar e manter as respostas imunes específicas-Ag [20], [22] – [24], foi analisada a porcentagem e a maturação de CD11c

+ DCs no linfonodo (LN) em ratos portadores de tumores infectados com

P. yoelii

17XNL parasitados eritrócitos (LLC + Py) ou eritrócitos não infectados (LLC). Descobrimos que a infecção por malária na fase inicial aumentou o percentual de CD11c

+ DCs (Fig. 5A e Fig. S5) e up-regulada a expressão de CD80 e CD86 por CD11c

+ DCs no tumor de drenagem nó de linfa (TdLN ), em comparação com os ratinhos do grupo LLC (Fig 5B . C). Este aumento na percentagem e a maturação de DC não foi observado em tumores não-drenagem nó de linfa (TNLN) de ambos os grupos de ratinhos (Fig. 5 e Fig. S5).

Dois dias após a inoculação do tumor, DC perfil de maturação e os números foram determinados em células de nódulos linfáticos. A. Quantificação da percentagem DC nos gânglios linfáticos através de citometria de fluxo. percentagem em DC e TdLNs TNLN de ratinhos portadores de tumor são mostradas. A linha no gráfico indica o valor médio. B e C, a intensidade de fluorescência média geométrica de CD80 (B) e CD86 (C), em DCs, os dados são reunidos a partir de três experiências independentes. O gráfico mostra a média com SD. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P

. 0,001

Em seguida, avaliou se a malária realce DCs infectadas pelo associado traduzido na melhoria do cross-priming e intra-tumor recrutamento de células T específicas ou não [25], [26]. Utilizando o nosso modelo de ratinho de tumor com células LLC-MUC1, avaliou-se o específico do tumor (MUC1 irrelevante contra OVA) a produção de IFN-γ e granzima B em células TdLN por enzyme-linked immunospot ensaio (ELISPOT). Observou-se um aumento significativo nos números de células efectoras secretoras B /granzima de IFN-y em resposta a MUC-1 (específico de Ag), mas não com OVA, na LLC + grupo Py (Fig 6A . B). Isto sugere que os murganhos do Grupo TdLN DCs em LLC + Py são competentes para células T específicas de tumor periférico cruz-prime, induzir respostas imunitárias específicas para MUC1 com potência mais elevada. Para verificar que o CC activado células TdLN realmente migraram para o tecido do tumor, foi examinada a densidade de leucócitos infiltrantes tumorais. Nós descobrimos que em ratinhos LLC + Py, houve um aumento dramático na densidade de CD45-se infiltram no tumor

+ células, e quando foram analisados ​​os subconjuntos de linfócitos que se infiltram no tumor, tanto CD4

+ e CD8

+ populações de células T CD8 foram aumentados com

+ células T representando o tipo celular dominante (Fig. 6C). Entre as células CD8 +

T, a densidade de células que expressam granzima B foi também significativamente aumentada nos tumores do grupo Py (Fig. 6C) + LLC. Estes dados sugerem que a infecção por malária promoveu a acumulação de ambos

+ células T CD4 e células T +

CD8, eo CD8

células T + tinha aumentado a função efetora dentro do tumor.

A e B, IFN-γ- (A) e granzima B (B), a produção de células derivadas de TdLNs 17 dias após a inoculação do tumor foram avaliadas por ensaio ELISPOT (n = 6). C, os números absolutos de CD45-infiltração tumoral

+ células, + células T CD4

+ e CD8

, e granzima espontânea-B produzir CD8

+ células T foram quantificados por citometria de fluxo e normalizada se fazer a biópsia de peso (n = 6) 17 dias após a inoculação do tumor. D a F, os esplenócitos foram colhidas 30 dias após a inoculação do tumor. D, a produção de IFN-γ foi medida utilizando um ensaio ELISPOT (n = 6). E, CD8

+ células T foram enriquecidas a partir de esplenócitos e submetido a ensaio ELISPOT para medir a produção de granzima B (n = 6). F, a proliferação de esplenócitos foi medida por incorporação de BrdU (n = 6). Os dados são apresentados como o Índice de estimulação (SI), que foi calculada pela determinação da razão entre os péptidos de MUC1 específicos para péptidos OVA não-específicos. Todos os gráficos mostram a média com SD. Estes experimentos foram realizados de forma independente três vezes com resultados idênticos, e os gráficos de dispersão representativos são mostrados. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P

. 0,001

A seguir, examinou a resposta imune anti-tumoral sistémica e observou que o número de células IFN-produzindo-gama específicas do MUC1 na o baço foi muito mais elevado nos ratinhos LLC Py + em comparação com os ratinhos LLC (fig. 6D). Entre as células produtoras de granzima B no baço, o número de células CD8 específicas de MUC-1

+ células T foi significativamente maior no grupo Py LLC + em relação ao grupo LLC (Fig. 6E). Nós proliferação de células T específica de tumores ainda mais medido e descobriu que a capacidade proliferativa de Ag-específica dos esplenócitos de ratinhos do LLC + Py grupo foi significativamente mais elevada do que os ratinhos do grupo de LLC (Fig. 6F). Estes dados sugerem que a infecção por malária induzida a resposta imune anti-tumoral sistémica.

A estimulação do efetivo, de longa duração anti-tumor imunidade

infecção pelo parasita da malária resultou em sobrevivência prolongada e regressão completa do tumor em 5-10% (1-2 ratinhos por 20) dos ratinhos portadores de tumor infectadas. Os animais sobreviventes rejeitado subsequentes injecções subcutâneas de células tumorais pai no dia 50 após a inoculação do tumor inicial, sugerindo que tinham adquirido imunidade sistémica contra as células LLC. Para avaliar se a infecção pelo parasita da malária conduziu à geração de imunidade a longo prazo, 50 dias após a inoculação do tumor, os esplenócitos dos ratinhos exibindo regressão do tumor foram analisadas para a secreção de proliferação específico Ag-e IFN-γ. Os esplenócitos dos murganhos exibindo regressão do tumor proliferado consideravelmente em resposta aos péptidos de MUC1 (Fig. 7A) e produziu níveis elevados de Ag-específico de IFN-γ (Fig. 7B), indicando que a infecção pelo parasita da malária aumentada não só

In situ

imunidade, mas também de longa duração, a imunidade específica de tumores sistémica, contribuindo para a inibição de tumorigénese e a rejeição de infiltração de tumores em locais distantes.

a e B,

P. yoelii

17XNL infecção resultou na regressão completa do tumor em 5-10% (1-2 por 20 ratos) dos ratinhos portadores de tumor infectadas. Cinquenta dias após a infecção, os esplenócitos dos ratinhos exibindo regressão do tumor foram analisadas para a proliferação específicos de MUC-1 (A) e a secreção de IFN-γ (B) (n = 4). A linha em um indica o valor médio. Bares em B representam SD. ***

P

. 0,001

efeito antitumoral da combinação de infecção pelo parasita da malária e tratamento vacina de DNA

adjuvantes bem sucedidas ajudar antígenos protetores para estimular potente e de longa duração respostas imunes. No caso da malária, existem várias moléculas candidatas em parasitas da malária que possam actuar como adjuvantes componentes [27], [28]. Para avaliar se a infecção pelo parasita pode aumentar a resposta imunitária de vacina de DNA do cancro do pulmão pcDNA3.1-hMUC1 [29], os ratinhos portadores de tumor foram imunizados com monoterapia (LLC + ADN) ou a terapia de combinação (LLC + aa + DNA), e animais infectados com eritrócitos parasitados (LLC + Py) ou eritrócitos não infectados (LLC) serviu como grupos de controlo. Os resultados demonstraram que a combinação de infecção pelo parasita da malária e o tratamento de vacina de ADN exerceu efeitos sinérgicos sobre a inibição do crescimento do tumor (Fig. 8A) e o prolongamento da sobrevivência do ratinho (Fig. 8B). Estes dados sugerem que parasita da malária é um adjuvante romance que pode facilitar a imunidade anti-tumoral específico.

A e B, 5 × 10

5 células LLC-MUC1 foram injectados s.c. na região do flanco de ratos. Quatro grupos (LLC, LLC + DNA, LLC + Py, e LLC + aa + DNA) de ratos foram imunizados com vacina de ADN ou infectados com parasitas, como descrito em Materiais e Métodos e subsequentemente monitorizados para o desenvolvimento do tumor durante 40 dias (A) e determinado o ponto final da sobrevivência durante 80 dias (B). O gráfico de (A) mostra a média com SD. As diferenças estatísticas entre os grupos são indicados pelos

valores P

.

Discussão

Os tumores frequentemente interferir com o desenvolvimento e função da resposta imune [30]. A capacidade de várias infecções para suprimir o crescimento do cancro tem sido bem documentada [31] – [34]. No presente estudo, examinamos antitumoral e atividades antimetastáticos de infecção por malária, tanto por via subcutânea e via intravenosa implantado modelo murino LLC. infecção por parasita da malária LLC inibiu o crescimento e a metástase e prolongou a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor. Posterior análise histológica de tumores provenientes de murganhos infectados com malária revelou que a angiogénese foi inibida e a proporção de células proliferativas foi diminuída, enquanto que as células apoptóticas foram aumentadas. infecção da malária em ratinhos LLC de rolamento, também aumentou significativamente a secreção de IFN-γ e TNF-α, a activação de células NK, a proliferação de células T específicas do tumor e a actividade citolítica de células CD8

+ células T. Estes resultados indicam que a infecção pelo parasita da malária induz respostas antitumorais inata e adaptativa em ratinhos LLC de rolamento, o que leva à indução de actividades antitumorais e antimetastáticos.

O cancro do pulmão é a causa principal de mortes associadas a cancro. A sua elevada letalidade significa que nenhum tratamento eficaz está disponível [1]. A imunoterapia pode representar uma das novas estratégias terapêuticas para o cancro do pulmão foi recentemente desenvolvido. O objectivo da imunoterapia do cancro do pulmão é a aumentar a resposta imune do hospedeiro contra tumores enfraquecida usando estimulantes imunes específicos e /ou não específicos. imunoadjuvantes biológicos tradicionais, tais como o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) e a toxina da difteria, e intervenções imunoestimulantes não específicos com citocinas, tais como IL-2, IFN-α, e TNF-α, induzir um fluxo massivo de células inflamatórias e a produção de um perfil de citocinas Th1 que leva a eficácia afirmativa no tratamento de alguns tipos de cancro [5]. No entanto, a indução das respostas imunitárias desejadas é fraco, as respostas são de curta duração, e a formação da memória é defeituoso. Assim, a simulação imunológico não específico não demonstrou um claro benefício para o cancro do pulmão em ambos os esforços pré-clínicos ou clínicos. Como a maioria dos patógenos [31] – [34], parasita da malária induz um influxo massivo de células inflamatórias e a produção de um perfil de citocinas Th1, que leva a uma resposta imune contra células de tumor. Notavelmente, a infecção por parasita da malária induz imunidade antitumoral não só não específica como também a imunidade específica do tumor. Além disso, a infecção por malária gera eficaz e de longa duração da imunidade antitumoral local e sistémica.

antitumoral actual imunoterapia específica, tais como vacinas terapêuticas ainda é sub-óptima. O componente imunoadjuvante é necessária para criar um ambiente pró-inflamatória, aumentando assim a co-estimulação e activação de linfócitos T [35]. Além disso, o microambiente do tumor é potente imunossupressor como resultado da inactivação rápida funcional dos linfócitos efectores induzida por imunoterapia específica que conseguem casa para o microambiente do tumor [6]. No entanto, a infecção por parasita da malária aumenta a percentagem de DCs, regula-se a CD80 e CD86 expressão de DCs em TdLN, promove a maturação de DC, e proporciona sinais co-estimula�o que resultam na geração de células T com um fenótipo activado. Activado CD4

+ células T produzem uma variedade de citocinas que levam à expansão clonal de geração e específico do tumor CD8

+ células T com actividade citolítica que reconhecem e matam células tumorais [20]. Além disso, a infecção por parasita da malária aumenta CD8

+ T-célula mediada por imunidade anti-tumor através de uma maior número e função efectora tanto nas TdLNs, bem como no próprio tumor. infecção por parasita da malária também promove células NK-se infiltram no tumor que exibem elevada actividade citotóxica no microambiente tumoral.

infecções parasita da malária profundamente provocar o sistema imune do hospedeiro, induzindo a activação policlonal, proliferação maciça e diferenciação dos linfócitos com parasita não relacionados especificidades, bem como as respostas imunes para hospedar antígenos liberados durante a infecção parasita da malária [36] – [41], que podem servir como mecanismos de vigilância imune reforçadas contra o cancro do pulmão. Possivelmente, os anticorpos pré-existentes e respostas pré-activado não específicas do tumor, juntamente com as respostas humoral e celular tumor-Ag-específicos iniciados após a infecção pelo parasita pode inibir a tumorigénese fase inicial. Em seguida, quando a infecção parasita da malária é adquirida durante o crescimento e desenvolvimento do cancro do pulmão, as respostas imune inata e adaptativa pode ser ainda induzida e /ou reforçada e suprimem fortemente o crescimento de tumores e metástases. Além disso, existem várias moléculas candidatas em parasitas da malária que possam actuar como adjuvantes componentes [27], [28]. O glicosilfosfatidilinositol (GPI) da

P. falciparum

acredita-se ser um factor importante na indução de respostas pró-inflamatórias principalmente através de receptores de tipo Toll (TLR) de sinalização 2 /mediada MyD88-[42]. Hemozoína, uma substância bio-cristalina, é um desintoxicação hemina subproduto de parasitas da malária, tem sido mostrado para mediar a activação do sistema imune inato através TLR9 [27], [28]. Hemozoína também mostra um efeito adjuvante potente com vários antigénios modelo. O adjuvante “built-in” pode facilitar o efeito antitumoral específica em nosso estudo. Tomados em conjunto, o parasita da malária pode ser um veículo de vacina ideal não só para a apresentação de antigénios do cancro do pulmão (tais como MUC-1) a células T específicas do tumor, mas também actuar como um adjuvante para fornecer o meio adequado para aumentar a eficácia destas células efetoras [43] – [45]

No entanto, nossos estudos têm duas limitações claras.. Em primeiro lugar, não há nenhuma febre em malária de roedores [46], [47], o que também foi observada no nosso estudo (dados não mostrados). Por isso, não deve haver nenhum efeito hipertermia em nossos modelos de malária de roedores-cancerosas. Em segundo lugar, os efeitos anti-câncer foram confirmados para ser muito mais forte em ratos com campo de doença relativamente mais naturais (aproximadamente quatro semanas) de

P. yoelii

infecção em comparação com aqueles com um curso da doença mais curto (aproximadamente duas semanas) do

P.

infecção chabaudi ou aqueles com cursos de curta duração interrompidas de

P. yoelii

infecção (duas semanas, após o tratamento antimalárico, dados não mostrados). Isso significa que o período mais longo infecciosa é, o efeito mais forte na inibição do crescimento do cancro do pulmão será. Infelizmente, o mais longo período de infecção roedor malária só é mantido quatro semanas (

P. Yoelii

). Portanto, não poderia observar o efeito da infecção por malária a longo prazo sobre o crescimento do câncer. No entanto, uma das formas benignas do parasita da malária humana

P. vivax

produz febres periódicas elevados na fase aguda, e este parasita posteriormente sobrevive durante anos durante a fase crônica da infecção se o paciente renuncia tratamento [48], [49]. Assim, se a hipótese de que um longo curso de malária terapêutica para o cancro do pulmão humano deve ser eficaz.

Apesar Greentree propôs a hipótese baseada em ativação dos macrófagos da malária terapêutica (malarioterapia ou malariatherapy) para o câncer em 1981 [50], a relação positiva entre a malária e alguns cancros associados a vírus (tais como o cancro do colo do útero e do linfoma de Burkitt) tem sido bem documentada [51], [52]. No entanto, nós relatamos aqui que a infecção por malária suprime significativamente o crescimento LLC via indução de respostas antitumorais inata e adaptativa, que fornece um romance compreensão da relação entre a malária e câncer de pulmão. Nós sugerimos que a urgência é explorar a viabilidade de utilizar uma atenuada Plasmodium modificado com o gene como um vector vacina contra o câncer de pulmão e para identificar os componentes celulares ativos do parasita da malária para imunoterapia de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o animal instalações experimentais foram aprovados pelo Guangdong Provincial Departamento de Ciência e Tecnologia, a identificação de aprovação é SYXK (Guangdong) 2005-0063, e cumpridas as orientações do animal Comissão cuidado, Guangzhou Institutos de Biomedicina e Saúde, Academia chinesa de Ciências (animal Welfare Assurance # A5748-01). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

Ratos, células e parasitas

Fêmea de 8 a 10 semanas de idade camundongos C57BL /6 foram adquiridos a partir do Vital Rio Experimentação animal Company Limited (Pequim, China) e foi criado no Centro de animal dos Institutos Cantão de Biomedicina e Saúde de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório estabelecidas por este instituto. As células da linha de células LLC e linfoma YAC-1 murino foram obtidos a partir da Academia Chinesa de Ciências Cell Bank (Xangai, China). O plasmídeo pcDNA3.1 expressar mucina humana 1 (MUC1) [29], obtido a partir de Dr. Junho-Key Chung (Seoul National University College of Medicine, Seoul, Coreia do Sul), foi estavelmente transfectado em células LLC com Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) [53] e seleccionado com neomicina (G418, Sigma, St. Louis, MO, EUA), para gerar uma linha de células LLC-MUC1. Os níveis de expressão de MUC1 foram confirmados por Western blotting [53], [54]. O não-letal

P. yoelii

estirpe 17XNL foi obtido a partir da Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4).

Crescimento de tumores e metástases Ensaio de Inibição de

Para estabelecer tumores, camundongos C57BL /6 foram s.c. injectado com 5 × 10

5 células LLC murino. desenvolvimento das metástases foi avaliada através da contagem de nódulos metastáticos individuais. ***

P

0.001.

doi:10.1371/journal.pone.0024407.s005

(TIF)

Acknowledgments

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