Abstract

histona metilação desempenha um papel crucial em vários processos biológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento de câncer . No presente estudo, nós descobrimos que JARID2, um componente que interage de Polycomb complexo repressor-2 (PRC2) que catalisa a metilação de lisina 27 de histona H3 (H3K27), foi envolvido em factor de crescimento transformante beta (TGF-beta) epitelial induzida transição -mesenchymal (EMT) da linha de células de cancro do pulmão A549 e linha celular de cancro do cólon HT29. A expressão de

JARID2

foi aumentada durante EMT induzida por TGF-ß de estas linhas celulares e de knockdown

JARID2

inibiram conversão morfológica TGF-ß induzida pelo das células associadas com EMT.

JARID2

knockdown em si não teve nenhum efeito na expressão de genes relacionados com a EMT mas antagonizou mudanças de expressão TGF-ß-dependente de genes relacionados com a EMT, tais como

CDH1

,

ZEB

família e

microRNA-200

família. ensaios de cromatina imunoprecipitação mostraram que JARID2 foi implicado na repressão da transcrição TGF-ß induzida pelo de

CDH1

e

microRNA-200

genes da família através da regulação da metilação da histona H3 e ocupações EZH2 em suas regiões regulatórias . Nosso estudo demonstrou um novo papel de proteína JARID2, que pode controlar o recrutamento PRC2 e metilação de histonas durante EMT induzida por TGF-ß de linhas celulares de cancro do pulmão e de cólon

Citation:. Tange S, Oktyabri D, Terashima M, Ishimura a, Suzuki T (2014) JARID2 está envolvido em fator de crescimento transformador Beta-Induced epitelial-mesenquimal Transição de pulmão e linhas celulares de cancro do cólon. PLoS ONE 9 (12): e115684. doi: 10.1371 /journal.pone.0115684

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia do Sul

Recebido: 16 de setembro de 2014; Aceito: 25 de novembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tange et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a Investigação Científica C (número de concessão 24.590.346 para TS) e da Investigação Científica em áreas inovadoras (número de concessão 22.112.010 para TS) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Lisina (K) metilação na cauda amino-terminal da histona H3 (K4, K9, K27 e K36) tem emergido como uma importante modificação pós-translacional, devido à sua dinâmica específica para a regulação da transcrição [1], [2]. Metilação do H3K4 foi fortemente ligado à transcrição activa, sendo de metilação de H3K9 e H3K27 são marcas repressivas de cromatina. Estas modificações são reguladas por metiltransferases histona lisina (kmts) e demethylases lisina (KDMs). Estudos recentes têm indicado que a desregulação destas enzimas podem contribuir para os defeitos de desenvolvimento e patogênese de doenças humanas, incluindo câncer [1] – [3].

A fim de encontrar novos genes implicados no desenvolvimento do cancro, nós temos realizada mutagénese de inserção retroviral em ratinhos. Esta tela levou ao isolamento de centenas de genes candidatos de cancro, incluindo muitos genes que codificam KMTS KDMs e [4], [5]. Anteriormente, relatou que KDM5B /PLU1 /JARID1B, um demethylase H3K4 e um dos oncogenes candidatos, regulada a expressão de

KAT5

e

CD82

genes para aumentar a invasão da célula [6] e reprimiu a expressão de

microRNA-200

(

miR-200

) família, promovendo assim epitelial-mesenquimal de transição (EMT) de células cancerosas [7]. Assim os nossos estudos revelaram que as enzimas modificadoras de metilo histonas foram envolvidos não só na iniciação do tumor, mas também na progressão tumoral.

A progressão tumoral tem sido associada com a activação do programa de EMT que é induzida por sinais extrínsecos, tais como a transformação factor beta de crescimento (TGF-ß) [8], [9]. EMT é caracterizado pelas alterações na expressão de genes epiteliais e mesenquimais. Especialmente, a regulação da caderina-E é essencial para a EMT. Vários repressores transcricionais tais como ZEB1 ZEB2 e estão envolvidos em E-caderina a repressão transcricional durante EMT [10]. As propriedades reversíveis de EMT sugerem que a regulação epigenética, como a metilação do DNA, modificação da histona e microRNA podem estar envolvidos [11]. Existem vários papéis, incluindo o nosso estudo que demonstra a ligação entre a repressão da E-caderina e a função de enzimas de modificação de metilo histonas [7], [12], [13]. No entanto, o papel da metilação da histona na EMT está apenas começando a ser descoberto.

JARID2 é uma das proteínas que contêm Jarid JmjC de domínio (Jumonji C) e áridas (AT-domínio rico interação) [2]. No entanto, carece de proteína JARID2 histona característica desmetilase actividade de outras proteínas de domínio JmjC porque tem substituições de aminoácidos na região conservada [2]. JARID2 foi classificado como um componente acessório de Polycomb complexo repressor-2 (PRC2) que regula importantes padrões de expressão genética durante o desenvolvimento [14]. PRC2 contém as subunidades principais: EZH2, SUZ12, EED e RBBP4 /7, e é responsável pela metilação H3K27 repressiva [15]. JARID2 foi mostrado para controlar ocupação PRC2 e actividade para os genes alvo em células estaminais embrionárias (CES) [16] – [19]. Por outro lado, a desregulamentação da atividade PRC2 é pensado para contribuir para o desenvolvimento do câncer humano. EZH2, um componente enzimático de PRC2, foi mostrado para ser sobre-expresso em cancro metastático, e os níveis de expressão foram associados com a progressão do tumor [20], [21]. No entanto, o papel de JARID2, um componente interagindo de PRC2, durante a progressão do câncer permanece desconhecida.

Neste estudo nós investigamos a função do JARID2 durante EMT induzida por TGF-ß de linha de células do cancro do pulmão A549 e cólon HT29 linha de células de câncer. Descobrimos que as mudanças de expressão TGF-ß-dependente de genes relacionados com a EMT foram inibidas por

JARID2

knockdown e reforçada pela

JARID2

superexpressão. investigações mecanicistas sugeriu que JARID2 estava envolvido na repressão da transcrição TGF-ß induzida pelo de

CDH1

e

miR-200

genes da família através da modulação da metilação da histona H3.

Materiais e Métodos

Os plasmídeos

O RNA hairpin pequena (shRNA) vetores retrovirais -expressing foram construídos como descrito anteriormente [6]. As sequências de cadeia de sentido dos oligonucleótidos foram as seguintes:

JARID2

shRNA # 1, 5′-ccgggaaacaggtttctaaggtaaactcgagtttaccttagaaacctgtttcttttt-3 ‘

JARID2

shRNA # 2, 5′-ccgggcccaacagcatggtgtatttctcgagaaatacaccatgctgttgggcttttt-3 ‘

A seqüência de controle shRNA foi descrito anteriormente [6]. Confirmou-se que a expressão de

JARID2

foi regulada para baixo com a infecção de ambos

JARID2

shRNA-expressando retrovírus mesmo na presença de TGF-ß por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR ) e Western blot (Fig S1.). Nós também confirmou que tanto o

JARID2

shRNAs causado os mesmos efeitos em nossos estudos EMT (S2 ​​Fig.), E, ​​portanto, nós apresentamos os dados de

JARID2

shRNA # 1 como um resultado representativo (descrita como JARID2 KD). Human

cDNA JARID2

foi marcado com FLAG-6xHis-tag, e depois clonados em pDON-5 plasmídeo Neo (Takara) para produzir retrovírus expressando JARID2.

Cultura de células e transfecção

a linha de células de cancro do pulmão humano A549 e a linha celular do cancro do cólon humano HT29 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Y. Endo (Cancer Research Institute, Kanazawa Univ.) e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS, 2 mM de glutamina e penicilina /estreptomicina (Sigma) a 37 ° C em 5% de CO2. Para a indução de EMT, células A549 foram tratadas com 1 ng /ml de TGF-ß (R D Systems) durante 12 a 72 horas, ao passo que HT29 células foram tratadas com 5 ng /ml de TGF-ß. A produção e os procedimentos de infecção de retrovírus shRNA ou de ADNc que expressam foram descritos anteriormente [6].

PCR quantitativa

preparação de RNA e análise quantitativa de RT-PCR foram realizados como descrito anteriormente [6] . Os dados de PCR foram normalizados com respeito a controlar a expressão de GAPDH humano. As médias de pelo menos três experiências independentes são apresentados com os desvios-padrão.

P

-Valores foram calculados entre o controle e as amostras utilizando o teste t de Student. Os iniciadores utilizados para a PCR quantitativa foram descritos anteriormente [6], [7] e concebidos como se segue:

Humano

JARID2

, 5′-gagcatgtgtttcagcaagg-3 ‘e 5’-3 cttctcttccactagcctccag ‘

Human

JARID1A

, 5′- tgaacttctgtactgctgactgg-3′ e 5’agccccacatctaagcattc-3 ‘

Human

JARID1C

, 5′- ctacggaggaaccacagca -3 ‘e 5’agcaggcagaagatgtggtag-3’

Human

JARID1D

, 5′- tcacagcagtgcccagttta-3 ‘e 5’ggggtggtaacaagcagaag-3’

Human

Vimentin

, 5′- tacaggaagctgctggaagg-3 ‘e 5’ -accagagggagtgaatccag-3 ‘

para a quantificação microRNA, TaqMan microRNA Ensaios (Applied Biosystems) para

miR-200a

(# 000.502) e

miR-200c

(# 002300) foram utilizados. Todos os dados foram normalizados com respeito à

RNU6B

(# 001093) expressão.

imunotransferência, coloração de células e ensaio de imuno-fluorescência

imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [7] . Anti-JARID2 (# NB100-2214, Novus Biologicals), anti-caderina-E (# 610181, BD Transdução Lab), anti-fibronectina (SAB4500974, Sigma), anti-vimentina (ab8069, Abcam), anti-ZEB1 (# 3396, Cell Signaling), anti-ZEB2 (# 61096, o Active Motif), anti-fosforilado Smad3 (ab51451, Abcam) e anti-GAPDH (6C5, foram utilizados anticorpos Millipore). Para detectar as alterações morfológicas das células, as células A549 ou HT29 foram coradas com violeta de cristal 0,4% (Waldeck). Para permitir que a fluorescência directa do citoesqueleto de actina, as células foram coradas com 0,25 uM de tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC) -conjugated faloidina (Sigma). Por imunof luorescência indirecta, as amostras foram incubadas com anticorpo anti-E-caderina e tratados com anticorpo conjugado Alexa546-anti-IgG de ratinho (Invitrogen). Os núcleos foram visualizados com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios

ChIP experimentos foram realizados como previamente descrito [6], [22] . Os cromatinas reticulados foram immunopreciptated com anticorpo de rato (anti-H3K27me3, anti-H3K4me3 [22], anti-EZH2 (# 17-662, Millipore) e o anti-FLAG (M2, # F1804, Sigma)). O enriquecimento da região específico amplificado foi analisado por PCR quantitativa e a percentagem de enriquecimento de cada modificação sobre a entrada da cromatina ADN foi mostrado. Os iniciadores utilizados para a PCR quantitativa correspondem à região um dos

CDH1

gene, região b de

//429

gene miR-200b a, b região de

miR-200c /141

gene e região um dos

GAPDH

gene, respectivamente, como descrito anteriormente [7].

resultados

A expressão de JARID2 foi aumentada durante o TGF-ß induzida EMT

Anteriormente, mostramos que KDM5B /PLU1 /JARID1B desempenhou um papel importante na EMT de células cancerosas [7]. Jarid 1B é uma das proteínas que contêm Jarid domínio JmjC e áridas. Para investigar o envolvimento de outras proteínas Jarid em EMT, examinamos primeiro as mudanças na expressão gênica de

Jarid

membros durante o processo de EMT. Nós usamos uma linha celular de cancro do pulmão, A549, porque é um bom sistema de modelo EMT que mostra as alterações morfológicas claro durante EMT causados ​​pelo tratamento de TGF-ß [23]. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) demonstrou que

JARID1B

expressão foi significativamente aumentada em células A549 depois do tratamento de 1 ng /ml de TGF-ß (Fig. 1B), o que confirma o resultado anterior [7] . Para a expressão de

JARID1A

,

JARID1C

e

JARID1D

, não observamos quaisquer alterações significativas (Fig. 1A, 1C e 1D). No entanto,

JARID2

expressão foi demonstrado claramente aumentado pela TGF-ß (Fig. 1E). Também examinamos as mudanças de expressão da proteína para JARID2. Western blot mostrou que a expressão endógena de proteína JARID2 foi aumentada de forma significativa após o tratamento de TGF-ß (Fig. 1F), sugerindo o seu possível papel em EMT induzida por TGF-ß.

análise de qRT-PCR foi realizado para detectar a expressão de

JARID1A

(A),

JARID1B

(B),

JARID1C

(C),

JARID1D

(D) e

JARID2

(e) em células A549 antes e depois do tratamento de 1 ng /ml de TGF-ß (12 h, 24 h, 48 h e 72 h) (*,

P

0,01 comparando controlar). (F) por Western blot foi realizada para detectar a expressão de proteínas JARID2 durante EMT induzida por TGF-ß. Como um controlo, foi utilizado o anticorpo anti-GAPDH para mostrar que quantidades iguais de proteínas foram carregadas no gel.

knockdown de JARID2 inibida alterações morfológicas das células induzidas por TGF-ß

Para elucidar a função de JARID2 na EMT, examinamos se knockdown de

JARID2

iria influenciar o processo EMT induzida por TGF-ß. As células A549 foram infectadas com os retrovírus de controlo ou o retrovírus que expressam

JARID2

shRNA, e as células infectadas foram tratadas com ou sem TGF-ß. Após o tratamento de TGF-ß, as células de controlo foram dispersos, alongada e assume uma aparência do tipo fibroblastos associado com EMT (Fig. 2A).

JARID2

knockdown em si não se alterou significativamente as formas celulares, mas inibiu as alterações morfológicas das células induzidas por TGF-ß (Fig. 2A). Em seguida, realizada ensaio de imunof luorescência utilizando um anticorpo contra a E-caderina, um marcador de células epiteliais. As células A549 de controlo não tratados apresentaram coloração de E-caderina heterogénea, e esta coloração foi quase perdido em células TGF-ß-tratada tal como descrito anteriormente (Fig. 2B) [23]. Como mostrado na Fig. 2B, coloração E-caderina foi claramente detectado em

JARID2

células knockdown tratados com ou sem TGF-ß, sugerindo que a propriedade epitelial pode ser mantida em

JARID2

células knockdown mesmo depois de TGF-ß tratamento. Examinámos ainda mais o estado de actina nas células por coloração com faloidina-TRITC conjugado, uma vez que a actina reorganização ocorre durante o processo de EMT [8]. Em contraste com as células de controlo não tratadas, o TGF-ß induzida dramaticamente a formação de fibras de actina típica de EMT (Fig. 2C). No entanto, em

JARID2

células knockdown, não observamos a formação de fibras de actina, mesmo na presença de TGF-ß (Fig. 2C).

(A) Celulares alterações morfológicas de células A549 depois TGF-ß tratamento. As células A549 foram infectadas com retrovírus que expressam shRNA controlo ou

JARID2

shRNA (descrito como

JARID2

KD) sem ou com o tratamento de 1 ng /ml de TGF-ß durante 48 horas. imagens (B) de imunofluorescência de células que mostram a localização da E-caderina. Os painéis de células A549 com a mesma disposição com (A) foram coradas com anticorpo anti-E-caderina e com DAPI. (C) As imagens de fluorescência de células mostrando reorganização do citoesqueleto de actina por coloração com TRITC-faloidina (actina) e com DAPI. Barras de escala: 20 mm

Nós também examinou se

JARID2

knockdown iria causar efeitos semelhantes em outro modelo EMT.. Nós usamos uma linha de células de cancro do cólon humano, HT29, porque responde a TGF-ß para EMT [7]. Para a expressão de

JARID1A

,

JARID1B

,

JARID1C

e

JARID1D

, QRT-PCR mostrou que apenas a expressão

JARID1B

foi significativamente aumentada após o tratamento de 5 ng /ml de TGF-ß (Fig. 3B). A expressão de

JARID1D

não foi detectado nas células HT29, porque

gene JARID1D

está localizado em células HT29 Y-cromossoma e são derivados a partir de um paciente com cancro do cólon fêmea. QRT-PCR e Western blot revelou que

JARID2

expressão foi também aumentado em células HT29 depois de TGF-ß de tratamento (Fig. 3D e 3E). Como mostrado na Fig. 4, o tratamento de TGF-ß alterações morfológicas induzidas, desaparecimento da coloração de E-caderina e formação de fibras de stress de actina em células HT29.

JARID2

knockdown em si não causou quaisquer alterações significativas em comparação com células de controlo, mas antagonizou esses fenótipos induzidas-TGF-ß (Fig. 4). No seu conjunto, estes resultados indicaram que o knockdown de

JARID2

contrariado alterações morfológicas e rearranjos do citoesqueleto de A549 e células cancerígenas HT29 característicos de EMT-TGF-ß induzida.

análise de qRT-PCR foi realizado para detectar a expressão de

JARID1A

(a),

JARID1B

(B),

JARID1C

(C) e

JARID2

(D) em células HT29 antes e depois do tratamento de 5 ng /ml de TGF-ß (12 h, 24 h, 48 h e 72 h) (*,

P

0,01 comparando a controlar; **,

P

0,05 comparando com controlo). (E) de transferência de Western foi realizada para detectar a expressão de proteínas JARID2 durante EMT induzida por TGF-ß. Como um controlo, foi utilizado o anticorpo anti-GAPDH.

(A) Celulares alterações morfológicas de células HT29 após o tratamento TGF-ß. células HT29 foram infectadas com retrovírus que expressam shRNA controlo ou

JARID2

shRNA (descrito como

JARID2

KD) com ou sem o tratamento de 5 ng /ml de TGF-ß durante 72 horas. imagens (B) de imunofluorescência de células que mostram a localização da E-caderina. Os painéis de células HT29, com a mesma disposição com (A) foram coradas com anticorpo anti-E-caderina e com DAPI. (C) As imagens de fluorescência de células mostrando reorganização do citoesqueleto de actina por coloração com TRITC-faloidina (actina) e com DAPI. Barras de escala: 20 mm

Knockdown de JARID2 afetou as mudanças na expressão de genes relacionados com a EMT induzida por TGF-ß

EMT é caracterizada pelas mudanças nas células epiteliais e mesenquimais marcador. a expressão do gene [8]. Assim, analisamos a expressão de um marcador epitelial,

CDH1 /E-caderina

, e mesenquimais marcadores,

FN1 /Fibronectina

e

Vimentin

no

JARID2

células knockdown. QRT-PCR mostraram que o TGF-ß diminuiu a expressão de

CDH1 /E-caderina

mRNA em células A549 (Fig. 5a), como relatado anteriormente [23].

JARID2

knockdown em si não teve efeito sobre

CDH1

expressão, mas inibiu a repressão da

CDH1

induzida por TGF-ß (Fig. 5A). Para

FN1 /Fibronectina

e

Vimentin

cujas expressões foram up-regulada por TGF-ß,

JARID2

knockdown antagonizou o efeito de TGF-ß (Fig. 5B e 5C ). Estes resultados sugeriram que

JARID2

knockdown inibiu a expressão do gene de programa EMT induzida por TGF-ß em células A549.

análise de qRT-PCR foi realizada para detectar a expressão de

CDH1 /E-caderina

(A),

FN1 /fibronectina

(B),

Vimentin

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(e),

miR-200a

(F),

miR-200c

(G) e

JARID1B

(H) em células A549 infectadas com retrovírus expressando controle shRNA ou

JARID2

shRNA com ou sem o tratamento de 1 ng /ml de TGF-ß durante 24 horas (*,

P

0,01 comparando com controlo). (I) de Western blot foi realizada para detectar a expressão de E-caderina, fibronectina, Vimentin, ZEB1, ZEB2, fosforilada Smad3 (P-Smad3) e proteínas GAPDH utilizando os anticorpos correspondentes.

Durante EMT processo, tem sido relatado que a expressão de e-caderina é regulado por os repressores transcricionais tais como ZEB1 ZEB2 e [10]. Assim, analisamos a expressão de repressores de transcrição da família Zeb na

JARID2

células knockdown. Como mostrado na Fig. 5D e 5E, o tratamento TGF-ß-regulada a expressão de

ZEB1

e

ZEB2

em células A549.

JARID2

knockdown em si não afetou a expressão de

ZEB1

e

ZEB2

significativamente, mas inibiu o aumento de TGF-ß-dependente de ambas as transcrições (Fig. 5D e 5E ). Essa descoberta nos levou a investigar a possibilidade de que o efeito poderia ser devido à regulação da

miR-200

família de microRNAs. O

miR-200

família foi relatado para inibir ZEB1 e ZEB2 especificamente durante EMT [24], [25]. Assim nós examinamos se

JARID2

knockdown afetaria a expressão de dois miRNAs representativas,

miR-200a

e

miR-200c

. Consistente com os relatórios anteriores [24], o tratamento TGF-ß resultou na diminuição da expressão de

miR-200a

e

miR-200c

em células A549 (Fig. 5F e 5G).

JARID2

knockdown si só não afectou a expressão, mas inibiu a regulação negativa de ambos os microARNs induzidas por TGF-ß (Fig. 5F e 5G). Em seguida, examinamos a expressão de

JARID1B

no

JARID2

células knockdown, porque

JARID1B

foi encontrado para ser regulada para cima após o tratamento TGF-ß e ser implicado na EMT [7]. Como mostrado na Fig. 5H,

JARID2

knockdown em si não afetou a expressão de

JARID1B

significativamente, mas inibiu o aumento de TGF-ß-dependente de

JARID1B

transcrição.

Foram também analisadas as alterações na expressão da proteína para alguns dos produtos do gene relacionados com o EMT em células A549.

JARID2

redução knockdown cancelada TGF-ß-dependente de proteína E-caderina e aumento de fibronectina, Vimentin, ZEB1 e ZEB2 proteínas (Fig. 5I), o que nos permitiu confirmar os resultados QRT-PCR. Depois tentamos examinar se TGF-ß via de sinalização seria prejudicada ou não no

JARID2

células knockdown por detectar as proteínas Smad3 fosforilada após o tratamento TGF-ß [9]. Como mostrado na Fig. 5I, as proteínas Smad3 fosforilada foram induzidas por TGF-ß e seus níveis foram semelhantes em células de controlo e

JARID2

células knockdown. Este resultado indicou que a activação do factor de transcrição a jusante Smad3 pelo sinal de TGF-ß não iria ser prejudicada por

JARID2

knockdown. Além disso, confirmaram os efeitos do

JARID2

knockdown na regulação dos genes relacionados com a EMT em outra linha de células de câncer, HT29 (Fig. 6). QRT-PCR revelou que

JARID2

knockdown semelhante inibida de TGF-ß induzida por mudanças de

CDH1 /E-caderina

,

FN1 /Fibronectina

,

ZEB1

,

miR-200a

,

miR-200c

e

expressão JARID1B

em células HT29 (Fig. 6A-F), e Western blot nos permitiu confirmar a QRT resultados-PCR (Fig. 6G). Estes resultados em conjunto sugeriram que JARID2 não afectou a activação dos factores de transcrição a jusante por um sinal de TGF-beta, mas estava envolvido na regulação da transcrição de TGF-dependente-ß de genes relacionados-EMT na linha celular de cancro do pulmão A549 e a linha celular de cancro do cólon HT29.

análise QRT-PCR foi realizado para detectar a expressão de

CDH1 /E-caderina

(a),

FN1 /fibronectina

(B),

ZEB1

(C),

miR-200a

(D),

miR-200c

(e) e

JARID1B

(F) em células HT29 infectados com retrovírus expressando controle shRNA ou

JARID2

shRNA com ou sem o tratamento de 5 ng /ml de TGF-ß durante 24 horas (*,

P Art 0,01 comparando a controlar; **,

P

0,05 comparando com controlo). A expressão de

Vimentin

e

ZEB2

era originalmente de baixa ou não detectada em células HT29. (L) por Western blot foi realizada para detectar a expressão de E-caderina, fibronectina, ZEB1 e proteínas GAPDH utilizando os anticorpos correspondentes.

JARID2 está implicada na regulação da transcrição de CDH1 e miR-200 família gênica por TGF-ß através da conversão de histona H3 metilação

JARID2 é um co-fator importante de complexo enzimático PRC2 que catalisa a metilação de H3K27 [14], [15] e envolvidos na repressão da transcrição na CES [16] – [19]. Assim nós examinamos o estado desnaturado da histona H3 nas regiões reguladoras de

CDH1

e

miR-200

genes familiares, que foram transcricionalmente reprimida durante EMT induzida por TGF-ß, por imunoprecipitação da cromatina ( CHIP) ensaio. Geneticamente, o

miR-200

família é agrupada em duas unidades policistrónicos:

miR-200b /200A /429 Comprar e

miR-200C /141

[26]. Seguindo imunoprecipitação, os conjuntos de iniciadores posicionado a montante dos locais de início da transcrição de

CDH1

gene e dois cachos de microRNA foram utilizados na PCR quantitativa [7].

Porque JARID2 pode recrutar complexo PRC2 à cromatina CES em [16] – [19], analisou-se primeiro o estado transcricionalmente repressivo H3K27 metilado-tri (H3K27me3) em células A549. Sobre as regiões reguladoras de

CDH1

,

miR-200b /200A /429 Comprar e

miR-200c /141

genes, os níveis de H3K27me3 foram aumentou significativamente após TGF- SS tratamento (Fig. 7), que foi correlacionada com a repressão da transcrição destes genes. Por outro lado, as marcas H3K4me3 transcricionalmente activos diminuiu substancialmente sobre estas regiões reguladoras por TGF-ß (Fig. 7). Mais importante, foi observado o aumento do recrutamento de EZH2, uma subunidade catalítica de complexo PRC2, nestas regiões reguladoras após o tratamento de TGF-ß (Fig. 7). Estes resultados sugerem que o recrutamento induzido por TGF-ß de EZH2 nas regiões reguladoras podem ser responsáveis ​​pela repressão da transcrição em células A549.

JARID2

knockdown em si não causou quaisquer alterações de metilação de histonas e ocupações EZH2 sobre estas regiões. Além disso, o tratamento TGF-ß em

JARID2

células knockdown não resultou no aumento da H3K27me3, a redução de H3K4me3 eo aumento de EZH2 recrutamento (Fig. 7). Esta observação foi correlacionada com a inibição da repressão da transcrição TGF-ß-dependente de

CDH1

e

miR-200

genes da família em

JARID2

células knockdown (Fig. 5A, 5F e 5G). Não foi possível detectar o recrutamento de proteína endógena JARID2 nas regiões reguladoras por ensaio de chip com o anticorpo anti-JARID2, possivelmente devido à sua baixa reactividade para imunoprecipitação. No entanto, estes resultados sugerem que JARID2 foi responsável pela repressão da transcrição TGF-ß induzida pelo de

CDH1

e

miR-200

genes familiares durante EMT de células A549 e que sua função foi associada com a regulamentação do recrutamento de EZH2 na cromatina para a metilação de histonas. Como um experimento de controle, foi realizado ensaio de chip na região reguladora do gene GAPDH

alheios

em células A549. Não houve alterações significativas na H3K27 e metilação H3K4 e EZH2 ocupações na região reguladora de

GAPDH

gene por JARID2 knockdown e /ou tratamento TGF-ß (S3 Fig.). Isto indicou que as mudanças JARID2 mediadas de metilação das histonas H3 e recrutamento EZH2 pode ser específica para os genes alvos regulados por JARID2 e TGF-ß, que foi correlacionada com a especificidade da regulação da transcrição.

analisa chip H3K27me3, H3K4me3 e EZH2 sobre as regiões reguladoras de

CDH1

(a),

miR-200b /200A /429

(B) e

miR-200C /141

genes (C ) em células A549 são mostrados. Os ocupação de histonas metiladas ou proteína EZH2 nas regiões foram analisadas por PCR quantitativa (*,

P

0,01 comparando a controlar; **,

P

0,05 comparando com controlo) .

Além disso, nós também examinou os efeitos de

JARID2

knockdown no estatuto de metilação das histonas H3 e recrutamento EZH2 sobre as regiões reguladoras de

CDH1

e

miR-200 genes da família Online em outra linha de células de câncer, HT29 (Fig. 8). As análises revelaram que ChIP

JARID2

knockdown aumento igualmente inibida TGF-ß-dependente de H3K27me3 e EZH2 ocupações e diminuição da H3K4me3 sobre estas regiões reguladoras (Fig. 8). Estes efeitos JARID2 mediadas não foram observados na região de regulação do gene de GAPDH (S4 Fig.). Portanto, esses resultados em conjunto sugerem que JARID2 foi necessário para mudanças TGF-ß-dependente de metilação das histonas H3 e recrutamento EZH2 sobre os genes-alvo específicos durante o processo de EMT induzida por TGF-ß de linhas de células A549 e câncer HT29.

ChIP análises de H3K27me3, H3K4me3 e EZH2 sobre as regiões reguladoras de

CDH1

(a),

miR-200b /200A /429

(B) e

miR-200c /141

genes (C) em células HT29 são mostrados. Os ocupação de histonas metiladas ou proteína EZH2 nas regiões foram analisadas por PCR quantitativa (*,

P

0,01 comparando a controlar; **,

P

0,05 comparando com controlo) .

sobre-expressão de JARID2 reforçada regulação transcricional TGF-ß-dependente de genes relacionados com a EMT

para aumentar a nossa compreensão para a regulação da EMT por JARID2, nós examinamos os efeitos de

JARID2

sobre-expressão em células A549. Sobre-expressão de

JARID2

foi confirmada por QRT-PCR e Western blot e do nível de sobre-expresso

JARID2

não foi significativamente alterado antes e depois do tratamento TGF-ß (S5 Fig.) . Em seguida, examinaram a expressão de

CDH1 /E-caderina

,

FN1 /Fibronectina

,

Vimentin

,

ZEB1, ZEB2, miR-200a Comprar e

miR-200c

em células A549 com

JARID2

sobre-expressão.

JARID2

sobre-expressão em si não apresentaram quaisquer alterações significativas na expressão de genes relacionados com a EMT, mas aumentou os efeitos do TGF-ß na expressão de genes relacionados com a EMT (Fig. 9A-G). Na

JARID2

sobre-expressando células, a expressão de

CDH1, miR-200a

e

miR-200c

foi reprimido mais por TGF-ß, ea expressão de

FN1

,

ZEB1

e

ZEB2

foi ativado mais de TGF-ß (Fig. 9A-G). Nós também confirmou que

JARID2

sobre-expressão aumentada a redução TGF-ß-dependente de proteína E-caderina e aumento de fibronectina, Vimentin, ZEB1 e ZEB2 proteínas (Fig. 9H). Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de

JARID2

potenciada regulação transcricional dependente de TGF-ß-EMT durante o processo de células A549.

análise de qRT-PCR foi realizada para detectar a expressão de

CDH1 /E-caderina

(A),

FN1 /fibronectina

(B),

Vimentin

(C),

ZEB1

(D),

ZEB2

(e),

miR-200a

(F) e

miR-200c

(G) em células A549 infectadas com o retrovírus de controle ou o retrovírus expressando

JARID2

com ou sem tratamento de TGF-ß durante 24 horas (*,

P Art 0,01 comparando a controlar; **,

P Art 0,05 comparando a controlar; *** ,

P Art 0,05 comparando a controlar mais TGF-ß). (H) Western blot foi realizada para detectar a expressão de E-caderina, fibronectina, Vimentin, ZEB1, ZEB2 e proteínas GAPDH utilizando os anticorpos correspondentes.

Em seguida, tentou analisar se

JARID2

sobre-expressão em células A549 afetaria o status metilado de histona H3 eo recrutamento de EZH2 sobre as regiões reguladoras de

CDH1

,

miR-200b /200A /429

e

miR-200c /141

genes por meio de análise de chip. Por estas regiões reguladoras,

JARID2

sobre-expressão em si não alterou os níveis de H3K27me3 e H3K4me3 significativamente, mas aumentou os efeitos de TGF-ß modificações em ambos (Fig. 10), que se correlaciona bem com o Os níveis de expressão de

CDH1

e

miR-200 genes da família

. Além disso,

JARID2

sobre-expressão em si teve pouco efeito na ocupação EZH2, mas o recrutamento EZH2 reforçada nestas regiões regulatórias após o tratamento TGF-ß (Fig. 10). Também se pode detectar o aumento do recrutamento de proteínas JARID2 marcado com FLAG nas regiões apenas na presença de TGF-ß (Fig. 10).