Abstract
silenciamento do gene epigenético, mediada por hipermetilação DNA promotor aberrante e modificações de histonas repressivas, é uma característica marcante do câncer. Embora hereditárias, a natureza dinâmica e reversibilidade potencial através de intervenções farmacológicas fazer tais aberrações alvos atraentes. Desde cancros conter várias anormalidades epigenéticas, terapias de combinação que têm como alvo defeitos diferentes poderiam, potencialmente, melhorar suas eficácias individuais. 5-Aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-CdR), fármaco aprovado pela FDA para o tratamento da síndrome mielodisplásica, pode inibir metiltransferases de ADN (DNMTs) mediante a incorporação no ADN das células em divisão, o que resulta em desmetilação global. Mais recentemente, o primeiro demethylase histona, lisina demethylase específica 1 (LSD1), que desmetila tanto histonas e substratos não-histona, tornou-se um novo alvo para a terapia epigenética. Usando, clorgilina, um inibidor LSD1 (LSD1i) para o tratamento de linhas celulares de cancro, que mostram que a clorgilina emprega dois mecanismos de acção, dependendo do tipo de célula: ele pode induzir a desmetilação de ADN global ou inibir-driven LSD1 H3K4me2 e H3K4me1 desmetilação para estabelecer uma configuração da cromatina ativa. Nós também investigar a eficácia terapêutica de combinação de 5-Aza-CdR com clorgilina e determinar que este tratamento combinatória tem efeitos sinérgicos sobre reativar genes silenciados aberrante, enriquecendo H3K4me2 e H3K4me1. Muitos dos genes reactivados são classificados como antigénios do cancro do testículo ou pertencem à via de sinalização do interferão, sugerindo potenciais implicações para a imunoterapia. Em conjunto, os nossos resultados demonstram que o tratamento combinatória que consiste em um inibidor DNMT (DNMTi) e uma LSD1i têm reforçado valores terapêuticos e pode melhorar a eficácia da terapia epigenética
citação:. Han H, Yang X, Pandiyan K, Liang G (2013) Synergistic Re-Activation of epigenetically Silenciado Genes por Combinatória A inibição da DNMTs e LSD1 em células cancerosas. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10.1371 /journal.pone.0075136
editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China
Recebido: 07 de maio de 2013; Aceito: 10 de agosto de 2013; Publicação: 06 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
financiamento:. Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [RO1CA124518 e CA138794] para Gl. XY e KP são suportados generosamente pela Stand Up to Cancer [2000901485]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
silenciamento do gene mediado por modificações hipermetilação DNA promotor e histonas aberrantes é uma das marcas de câncer. Embora essas modificações são hereditárias, sua natureza dinâmica e reversibilidade através de intervenções farmacológicas torná-los alvos terapêuticos atraentes [1]. Ao longo das últimas décadas, várias drogas que têm como alvo diferentes tipos de alterações ambientais têm sido desenvolvidas com o objectivo de reactivar genes silenciados aberrante, incluindo DNMTi e inibidores de histona desacetilases (HDACi) [2], [3]. Muitos deles têm mostrado promissores valor terapêutico no tratamento de diversas doenças malignas, ambos como agentes isolados e em combinação com outras terapias e vários já foram aprovados pela FDA.
A N-terminais das histonas submetidos a uma variedade de pós translacionais para gerar conformações de cromatina transcricionalmente permissivas ou refractários, dependendo do tipo e local da modificação [4], [5]. Por exemplo, os promotores transcricionalmente ativos são marcadas pelas enriquecimentos de dimetilação e trimethylation de H3K4 e acetilação de H3 [6]. Transcricionalmente promotores inativos são marcados pelos enriquecimentos de qualquer trimethylation de H3K9 ou trimethylation de H3K27 [5]. A atividade equilibrada das enzimas histonas modificação que adicionar ou remover modificações específicas é fundamental para a fisiologia normal da célula [2]. As células cancerosas muitas vezes não têm esse equilíbrio e apresentam uma redução global das acetilação e redução específica do promotor em di- e trimethylation de H3K4, resultando no silenciamento do gene aberrante [1], [7]. metilação Histona lisina foi considerada como uma modificação relativamente permanente até a descoberta da primeira desmetilase histona -lisina específica desmetilase 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Depois disso, muitos esforços foram investidos no desenvolvimento de inibidores contra demethylases histonas.
LSD1 desmetila mono e dimetilação de H3K4 através de uma adenina flavina (FAD) mecanismo dependente [9], e, portanto, tem o potencial de reprimir a expressão do gene [10]. Antes da descoberta da sua capacidade de desmetilação, foi LSD1 conhecido associar a um número de complexos de co-repressor, incluindo COREST [11], CtBP [12] e um subconjunto de complexos de HDAC [13]. Durante o processo de desmetilação, uma imina intermediária é formada, que é mais hidrolisado para gerar uma lisina não metilada e formaldeído, como um subproduto [9], [14], [15]. LSD1 pode também desmetilar um número de substratos não-histonas, tais como DNMT1, que alegadamente torna mais estável [16], [17], assim potencialmente contribuir para o aumento da metilação global do DNA. Tomados em conjunto, LSD1 tem dois mecanismos potenciais de acção para suprimir a expressão de genes: pode desmetilar mono- e dimetilada H3K4, bem como estabilizar DNMT1
A sobre-expressão de LSD1 foi avaliado num certo número de doenças malignas, incluindo mielóide aguda. leucemia (AML) [18], neuroblastoma [19], o cancro da mama [20], carcinoma da bexiga, o cancro do pulmão de células pequenas e carcinomas colorrectais [21], o que sugere que os inibidores LSD1 pode ter benefício terapêutico importante em numerosos tumores. LSD1 foi identificado para bloquear a diferenciação em MLL [22] e regulam as transições epiteliais-mesenquimal (EMT) para activar genes de motilidade [23]. inibidores LSD1 pode promover a diferenciação de células de câncer de próstata de alto grau [24], suprimir a proliferação de células de cancro da bexiga [25], e reativar genes silenciados aberrante [26]. Os domínios catalíticos de LSD1 e oxidases de monoamina partilhar homologia estrutural e fazer uso do mesmo mecanismo catalítico [9]. Por isso, muitos inibidores da monoamina oxidase também são LSDI. Um tal inibidor da monoamina-oxidase, clorgilina, também pode inibir a desmetilases específicos de lisina [19], [20], [27], [28].
Devido à presença de múltiplas anormalidades epigenética em células cancerosas, foi investigada o valor terapêutico combinado de 5-Aza-CdR e clorgilina para inibir DNMTs e LSD1, no cancro da bexiga (T24), leucemia (HL60) e linhas celulares de cancro colo-rectal (HCT116). Observamos que clorgilina emprega dois mecanismos de ação diferentes nas três linhas de células que estudamos. Em células T24 e HL60, clorgilina sozinhos produz efeitos mínimos sobre a reactivação de genes silenciados aberrante em comparação com o controlo não tratado. No entanto, o tratamento combinatória induz efeitos sinérgicos sobre a reativação de genes epigenetically silenciados. Além disso, apenas os combinatórias tratamento resulta em enriquecimentos de H3K4me2, H3K4me1 e H3K9 /14 acetilação nos promotores dos genes supra-regulados. Por outro lado, em células HCT116, clorgilina sozinho induz a desmetilação de ADN global e reactivação de genes. No entanto, o tratamento combinatória não demonstraram efeitos sinérgicos sobre reactivação de genes. Apesar de mostrar diferentes mecanismos de ação nas linhas celulares, coletivamente, nosso estudo demonstra que o tratamento combinatória tem reforçado valores terapêuticos, e introduz uma nova abordagem no tratamento do cancro.
Materiais e Métodos
O tratamento medicamentoso e condições de cultura
células T24, HCT116 e HL60, adquiridos a partir de ATCC, foram semeadas a 2 × 10
5 células /100 mm de prato, 3 × 10
5 células /100 mm prato e 5 × 10
5/25 cm
2 balão, respectivamente. Eles foram tratados no dia seguinte com 1 uM, 0,3 uM ou 0,1 uM de 5-Aza-CdR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), respectivamente durante 24 horas. Após a remoção de 5-Aza-CdR, as células foram tratadas com 10 clorgilina uM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) todos os dias durante 21 dias. Várias doses de clorgilina foram testados: 1 uM, 10 uM e 100 uM. Clorgilina o crescimento de células deficientes em uma maneira dependente da dose e a dose óptima para clorgilina (10