Abstract

Fundo

O hedgehog (hh) via tem sido implicada na patogénese do cancro, incluindo adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Estudos recentes têm sugerido que a função oncogénica de Hh em PDAC envolve a sinalização nas células estromais, em vez de efeitos autonômicos celular nas células tumorais. No entanto, a origem ea natureza do tipo (s) de células do estroma, que são sensíveis à sinalização Hh permaneceu desconhecida. Desde sinalização Hh desempenha um papel crucial durante a vasculogénese embrionária e pós-natal, nós especulamos que o ligando Hh pode agir sobre a vasculatura do tumor enfocando especificamente a medula óssea (BM) células -derived.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

ciclopamina foi utilizado para inibir a via de Hh em linhas de células humanas e as suas PDAC xenoenxertos. os transplantes de BM, o co-cultivo de células de tumor e células pró-angiogénicos BM-derivados (BMPCs) foram utilizados para avaliar o papel de Hh derivado de tumor na regulação do compartimento BM e a contribuição das células BM-derivadas para a angiogénese em PDAC. administração ciclopamina atenuada sinalização de Hh no estroma, em vez de nas células cancerosas como reflectida pela diminuição da expressão da proteína de comprimento completo Gli2 e ARNm Gli1 especificamente no compartimento. Ciclopamina inibiu o crescimento de xenoenxertos de PDAC em associação com a regressão da vascularização do tumor e reduziu homing das células BM-derivadas para o tumor. os níveis de Ang-1 e IGF-1 de ARNm Host-derivados foram reprimidos por ciclopamina nos xenoenxertos de tumor.

In vitro

co-cultura e ensaios de plug matrigel demonstraram que Shh derivada de células induzida PDAC Ang-1 e IGF-1 na produção BMPCs, resultando na sua actividade morfogénese e a migração capilar aumentada.

conclusões /Significado

Identificamos a BMPCs como alvos do estroma alternativas de HH-ligante em PDAC sugerindo que a vascularização do tumor é um alvo terapêutico atractivo do bloqueio Hh. Nossos dados são consistentes com o conceito emergente de que as células BM-derivadas fazer contribuições importantes para epiteliais tumorigênese

Citation:. Nakamura K, Sasajima J, Mizukami Y, Sugiyama Y, Yamazaki M, Fujii R, et al. (2010) Hedgehog Promove a neovascularização no pâncreas, regulando Ang-1 e IGF-1 Expressão na medula óssea derivados de células pró-angiogénicos. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10.1371 /journal.pone.0008824

editor: Sudha Agarwal, Universidade do Estado de Ohio, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de outubro de 2009; Aceito: 01 de janeiro de 2010; Publicação: 21 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Nakamura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de YM da Nova Energia e Organização Industrial Technology Development of Japan (07A05010a). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos e em quinto lugar no Japão, e sua taxa global de sobrevida em 5 anos é de apenas 5,0-9,7% [1], [ ,,,0],2]. quimioterapia à base de gemcitabina para localmente avançado ou metastático PDAC possui apenas atividade modesta com um pequeno benefício de sobrevivência [3]. A identificação de novos alvos moleculares para PDAC para superar o mau prognóstico é, portanto, necessário. Até agora, uma gama de terapias direcionadas contra EGFR [4], Ras /MEK [5] e VEGF [6] não conseguiram melhorar significativamente a sobrevivência em ensaios clínicos.

activação aberrante do hedgehog (hh) via mais recentemente tem sido reconhecido como um dos mediadores do desenvolvimento PDAC e, portanto, é considerada como um alvo promissor para terapia de [7], [8]. Hh é um morfogénio necessário para a formação padrão adequado durante a embriogênese. expressão elevada de proteínas relacionadas com Hh, sonic hedgehog (Shh) ou hedgehog indiano (Ihh), prejudica morfogênese pâncreas com aumentos de mesênquima e diminui no compartimento epitelial [9], indicando que a regulamentação rigorosa do nível geral de atividade Hh é crucial para o desenvolvimento de pâncreas normal. Uma vez que Shh é misexpressed não só em PDAC mas também nas lesões precursoras de neoplasia intra-epitelial pancreática (PanIN) [8] e neoplasia mucinosos papilares intraductais [10], a desregulação da via este pode desempenhar um papel nas fases precoces da tumorigénese. Um certo número de genes de HH-alvo, tais como BMP [11], FOXM1 [12], e PMP22 [13], são sobre-expressos em PDAC, e não há conversa cruzada entre as vias oncogénicos incluindo a MAPK /ERK, PI3K /Akt [14 ], Wnt [15], o TGF-p /BMP [16] e a sinalização de Hh. Entre as moléculas que participam na sinalização de Hh, Smoothened (Smo) tem sido reconhecido como um mediador chave da sinalização; é um dos componentes do receptor para o ligando de Hh e converte Gli2 em um activador transcricional [17]. Assim, Smo é um alvo particularmente promissora para a terapia anti-cancro [18]. Ciclopamina, um alcalóide de esteróide natural, possui fortes efeitos inibitórios contra a Smo [18] e o tratamento com ciclopamina na configuração experimental inibe o crescimento de muitos tipos de cancro [19], [20], [21]. derivados cyclopamine com vários motivos estruturais foram geradas e mostram a promessa para possível uso clínico [22].

inibição do crescimento significativo Especificamente, vários estudos têm demonstrado de PDAC

in vivo

por via de bloqueio Hh [ ,,,0],7], [23]. O mecanismo inibidor do crescimento do tumor foi pensada para ser mediada principalmente através do bloqueio de um loop autócrino que pode ser necessária para a proliferação de [7], a sobrevivência [8] e motilidade [21] das células cancerosas. No entanto, a eliminação de Smo no epitélio pancreático não afecte a tumorigénese num modelo de ratinho de PDAC [24], e ligandos de Hh não induzem repórteres transcricionais da via em linhas PDAC. Além disso, a expressão transgénica de um alelo de Smo activado no epitélio pancreático falha para induzir Smo via genes alvo ou para induzir a transformação neoplásica [25]. Por conseguinte, tem-se especulado que a sinalização de Hh pode desempenhar um papel parácrino dentro do microambiente do tumor, em cancros epiteliais que não possuem mutações no componentes de sinalização Hh. papéis cruciais Com efeito, estudos realizados por nós e outros já definidas de células de cancro derivado de Hh em tipos de células no interior de compartimentos do estroma do tumor [26], [27], [28]. Apesar destas descobertas, os mecanismos precisos pelos quais algumas células do tumor são insensíveis à inibição Hh eo tipo (s) de células do estroma, que são sensíveis à sinalização Hh permaneceu desconhecida. Por isso, realizou estudos para elucidar esses mecanismos.

Métodos

Cultura celular, análise de proteínas e análise de RNA

linhas celulares PDAC humano foram obtidos de ATCC, Ciências da Saúde Investigação Recursos bank (Osaka, Japão) e celular Centro de Recursos para Biochemical Research (Sendai, Japão). BMMNC isolamento, ensaios de proliferação, a co-cultura, os ensaios de migração, imunotransferência, e qPCR são descritos em Methods S1. As sequências dos iniciadores estão resumidos na Tabela S1.

Animais, transplante de medula óssea (TMO) e imuno-histoquímica

Os estudos terapêuticos com ciclopamina foram realizadas com xenoenxertos de ratinhos nus, como descrito [7]. BMT procedimentos são fornecidos nos Métodos S1. Protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Asahikawa Medical Collage.

Os tecidos foram processados ​​como relatado anteriormente [26]. Os anticorpos e as condições de imunohistoquímica são apresentados em Métodos S1.

Celular, Molecular e Análises Estatísticas

As descrições detalhadas dos procedimentos são fornecidos em Métodos S1.

Resultados

In Vivo

Efeitos da ciclopamina sobre KP-1N xenoenxertos

a fim de elucidar os mecanismos pelos quais a sinalização de Hh poderiam apoiar a progressão do tumor em uma forma de células tumorais não autónomo, avaliamos o papel da sinalização Hh no crescimento da PDAC

in vivo

. Nós seleccionada uma linha celular, KP-1N, que exibiu uma expressão elevada de Shh mas era insensível à inibição do crescimento por ciclopamina

In vitro

(Figura S1, S2 e Tabela S2). Tratamento de KP-1N xenoenxertos com ciclopamina por dia durante 7 dias provocou uma redução de 46 por cento em peso do tumor, em comparação com tumores tratados com veículo de controlo (Figura 1A). A análise histopatológica revelou que cyclopamine tumores tratados tinham áreas abundantes de necrose, resultando em uma redução de 59% em peso do tumor viável. Em linha com esses achados, de coloração para Ki-67 e TUNEL demonstraram que o tratamento cyclopamine proliferação reduzido em 14% e aumentou a morte celular por 9%

in vivo

(Figura 1B); em contraste, não houve efeito significativo da cyclopamine sobre a proliferação /cinética de morte celular

in vitro

(Figura S2).

(A) ratos CD-1 nus portadores de xenotransplantes KP-1N foram tratados com ou sem ciclopamina (50 mg /kg /dia; sc) por dia, durante 7 dias (10 xenoenxertos para cada grupo). Os resultados são mostrados peso tumoral ± EPM como média (mg). H-E colorações para as seções de xenotransplante são mostrados e% de área necrótica (N) foi medido. Barras de escala; 200 um. (B) os tecidos de xenoenxerto foram coradas com anticorpo anti-Ki-67 (barras de escala; 200 uM) e o ensaio TUNEL (Barras de escala; 500 um) foi efectuado. Quantificação de proliferação /apoptose é mostrado como percentagem de células positivas em 5 campos viáveis ​​a partir de 10 secções. (C) ARN foi extraído a partir de tecido do xenoenxerto e os níveis de mRNA para Ptch1 Gli1 e foram quantificados por TaqMan qPCR.

De modo a determinar quais as células foram afectados pelo tratamento ciclopamina, medimos expressão de Ptch1 e Gli1 ARNm, alvos de transcrição da sinalização de Hh, em ambas as células de tumores humanos xenoenxertados, bem como o compartimento estromal do rato. Para isso, fizemos uso de sondas específicas de espécies. Observou-se que Ptch1 humana e Gli1 em tecidos de xenoenxerto foram apenas modestamente diminuiu por tratamento ciclopamina (Figura 1C). Foram observadas comparáveis, pequenas diminuições na expressão

in vitro

(Figura S3). Em comparação, os níveis de ARNm de rato e Ptch1 Gli1 mostraram uma regulação negativa marcadamente mais pronunciado, o que indica que as células do estroma são alvos importantes de bloqueio de Hh. Colectivamente, estes resultados indicam que o efeito anti-tumor no crescimento de ciclopamina xenoenxerto é mediada principalmente através de uma regulação negativa da sinalização de Hh em estroma associado ao tumor.

Efeitos de ciclopamina no tumor Vascularização

Entre os componentes do estroma em xenoenxertos PDAC, fomos particularmente curioso sobre a vasculatura do tumor, já que demonstraram que BM-derivado pró-angiogénico (precursoras), as células são sensíveis ao ligando Hh durante a neovascularização [26], [29]. Por isso, nós investigamos o efeito de ciclopamina na vasculatura tumoral em xenoenxertos de KP-1N. Imunocoloração para o marcador celular endotelial CD31 revelou que a densidade microvascular foi reduzida significativamente (42,6%), quando os ratinhos foram tratados com ciclopamina (Figura 2A). A vasculatura do tumor resultante foi reduzida e fragmentada, e a redução na área média navio foi dramático (64,8%). A inibição da angiogénese por ciclopamina também foi observada em Fato-2 xenoenxertos (Figura S4).

(A) xenoenxertos KP-1N tratados com ou sem ciclopamina foram coradas com CD31. Barras de escala; 500 um. Os dados são apresentados como média ± SEM MVD e média área do vaso. (B) coloração de imunofluorescência Duplo com α-actina de músculo liso (SMA) com CD31 ou NG2 com CD31. Barras de escala; 200 um. O número de CD31

+ microvasos cobertas com α-SMA ou NG2 pericitos positivos é mostrado.

Os nossos resultados sugerem que o bloqueio da sinalização de Hh “desestabiliza” os vasos tumorais. Nós fato para confirmar esta hipótese por coloração imuno-histoquímica para actina de músculo α-liso (SMA), NG2, e CD31. SMA e NG2 são expressos por pericitos, que são células que se associam intimamente com células endoteliais CD31-positivo para estabilizar vasos sanguíneos [30], [31]. Observou-se 50,0% ou 62,1% menos CD31

microvasos + cobertas com SMA

+ ou NG2

+ pericitos nos tumores cyclopamine tratada (Figura 2B). Assim, a sinalização de Hh é importante para a maturação e /ou estabilização da vasculatura tumoral.

Hh Promove A incorporação de células de MO-derivados para a neovasculatura

de medula óssea (BM) derivadas de tumores -derived As células são pensados ​​para desempenhar um papel no desenvolvimento de tumores [32], [33]. Por exemplo, têm sido observados vários tipos de células hematopoiéticas BM-derivados que associe estreitamente com a neovasculatura de tumores [34], [35], e, de facto, um pequeno número de células progenitoras BM-derivados foram demonstrados para incorporar dentro do lúmen de um crescente vasculatura onde eles diferenciam-se em células endoteliais num modelo de cancro de pulmão de rato [36]. Vários factores no microambiente tumoral pode modular o recrutamento e a retenção de células-derivadas BM durante o desenvolvimento da vasculatura do tumor [37]. Por isso, procurou-se determinar se a sinalização Hh contribui para este processo no PDAC. A fim de rastrear células BM-derivados, implantamos xenotransplantes KP-1N em ratos quiméricos com a BM marcado com GFP (modelo de transplante de medula óssea GFP-; ver Métodos). Ciclopamina diminuiu significativamente o recrutamento de células BM-derivados nos xenoenxertos em 60% em comparação com os tumores de controlo (Figura 3A).

(AD) murganhos GFP-BMT-quiméricas contendo xenoenxertos KP-1N foram tratados com ou sem cyclopamine. O recrutamento de células BM-derivados para o tumor foi monitorado por imunocoloração com anti-GFP (A). Os dados apresentados como a média ± SEM do número de GFP

+ células. Barras de escala; 100 um. tecidos de xenoenxerto de KP-1N foram imunocoradas com Gli2 (B), CD31, VE-caderina ou NG2 (C), em combinação com GFP. Barras de escala; 100 um. Mostrados são a média ± SEM de GFP

+ células recrutadas para CD31

+ vasos tumorais (

Painel

superior) e número de GFP

+ células co-localizada com CD31, VE-caderina

+, e NG2 (

painel inferior

).

Entre a família Gli de fatores de transcrição, o controle da degradação do Gli2 ea transformação em sua forma repressor definir a sinalização de Hh resposta [38]. Gli2 proteína é processada e degradado na ausência de ligando de Hh, ao passo que a presença de ligando promove Hh enriquecimento em Smo cílios [39], resultando na translocação nuclear de comprimento completo, proteína Gli2 transcricionalmente competente [40]. Portanto, foram avaliados o efeito do ciclopamina em proteína Gli2 através de análise de imunofluorescência, utilizando um anticorpo contra a forma de comprimento completo da Gli2 [41] (Figura S5A). células BM-derivados expressar comprimento completo proteína Gli2 e ciclopamina diminuiu tanto o número absoluto e a proporção relativa de células BM-derivados positivos Gli2 (Figura 3B), indicando que a sinalização de Hh é activada em células de MO-derivados numa sensível ao ciclopamina (Smo dependente) maneira. Também foi observada a proteína Ptch1 em células BM-derivados, bem como em células cancerosas e ciclopamina reduziu a expressão Ptch1 no compartimento estromal (Figura S5B). Não foi possível demonstrar a expressão da proteína Gli1 forte no xenoenxerto de tecido (dados não mostrados).

Em tumores de controlo, as células derivadas BM-GFP-positivas estão intimamente associados com CD31

+ vasos tumorais, mas que não são incorporadas para o lúmen das vasculaturas (Figura 3C). Por outro lado, um subconjunto de células derivadas BM-co-expressa VE-caderina demonstrando que as células BM-derivados não só são recrutados para a área peri-vasculares, mas também dão origem directamente ao endotélio do tumor. O proteoglicano NG2 é expressa por pericitos nascentes durante as fases iniciais da angiogénese, e um subconjunto de células-derivadas BM em tumores de xenoenxerto de co-expressa NG2. Estes resultados indicam que as células-derivadas BM contribuir para o desenvolvimento da vasculatura tumoral, não só, dando origem ao tipo específico de células, mas também através da associação de diferentes maneiras. Digno de nota, o tratamento ciclopamina diminuiu significativamente a integração da GFP

+ BM derivados de células pró-angiogénicos (BMPCs) em CD31

+, VE-caderina

+, ou NG2

+ vasculaturas tumorais. Confirmámos que BMPCs foram responsivos a Hh desde

In vitro

co-culturas de células de tumor com KP-1N resultou numa indução sensível ciclopamina-Gli1 de ARNm /Ptch1 em BMPCs, mas não na linha de células endoteliais maduras MS -1 (Figura S6 e dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a via de Hh desempenha um papel na neovascularização através da modulação da incorporação de células pró-angiogénicos (precursoras) BM-derivado para dentro dos vasos tumorais.

-tumor derivado de Hh provoca migração de BM- derivados Cells Pro-angiogénicos

In Vitro

e

In Vivo

Nós especulamos que os números reduzidos de células BM-derivados nos tumores tratados com cyclopamine pode ser o resultado de mobilização de células atenuadas a partir de BM. No entanto, o número de BMPCs circulantes, medida por marcação cultivadas PTM de sangue periférico com AcLDL /isolectina B4 [42], não foi significativamente reduzida na presença de ciclopamina (Figura S6). Esta descoberta sugere que pode Hh regulam directamente recrutamento, diferenciação, migração ou de precursores para BMPCs dentro do microambiente do tumor, em vez de afectar a mobilização dos precursores da medula.

Uma vez que a inibição da sinalização de Hh não afectou mobilização do BMPCs, procurou-se investigar os mecanismos pelos quais a sinalização de Hh pode melhorar a sua incorporação na vasculatura do tumor. Para fazer isso, nós examinamos os efeitos de Hh sinalização sobre a migração dos precursores. A migração de BMPCs através de uma membrana Transwell

In vitro

foi medida na presença de KP-1N no poço inferior. BMMNCs cultivadas que expressam c-kit, CD11b e VE-caderina foram utilizados como precursores para os BMPCs (Figura S6). O número do BMPCs migrar para o lado inferior da membrana aumentou significativamente quando co-cultivadas com KP-1 N, em comparação com as células pró-angiogénicos sem KP-1 N, o que implica que os factores segregados a partir das células PDAC pode melhorar a migração de os precursores (Figura 4A). Consistente com um papel para a via de Hh-Smo, o pré-condicionamento BMPCs com ciclopamina reduzida drasticamente a sua capacidade de migrar de uma maneira dependente da dose (Figura 4A). Para abordar diretamente o papel da sinalização SMO-dependente em células pró-angiogénicos BM-derivados, foram utilizadas as células de MO infectados com uma segmentação lentivírus shRNA Smo (Figura 4B). Supressão de Smo atenuou significativamente a sua migração para células tumorais KP-1N. O papel de Shh derivada de tumor na migração dos precursores também foi confirmada usando um anticorpo neutralizante de Shh (Figura 4C).

(A-B) A migração de células pré-angiogénicos BM-derivados (BMPCs) foi avaliada. BMMNCs cultivadas em meio EGM2-MV durante 4 dias e as células ligadas foram semeadas em Transwell (5 um de poro) revestidos com gelatina a 0,1%, e as células KP-1N foram semeadas no poço inferior. Número de células que migraram para o lado inferior da membrana foi quantificado por coloração com DAPI depois de 18 h de incubação. Os BMPCs foram pré-tratados com ciclopamina (A), shRNA lentivírus para Smo (B), e anti-Shh e /ou anti-VEGF por anticorpos neutralizantes (C), quando semeadas sobre o poço. Para um controlo positivo, o VEGF humano (50 ng /mL) foi adicionado ao poço inferior, e os BMPCs foram cultivadas por si só como controlo negativo.

De forma a elucidar os efeitos de modulação da via de Smo sobre a migração do BMPCs

in vivo

, foram realizados ensaios de plug matrigel. Ao sobrenadante concentrado a partir de células KP-1N misturadas com matrigel foi implantado subcutaneamente em ratinhos nus, o número de células hospedeiras que migram para a matrigel foi significativamente aumentada, e as células formaram uma estrutura de cabo semelhante, imitando morfogénese capilar

In vivo

(Figura 5A). A fim de distinguir as células BM-derivadas de outras células do estroma, a experiência foi repetida utilizando outros ratinhos quiméricos que foram submetidos a TMO. Uma vez que foi observada a expressão de ARNm de Tie2 significativa nas células pró-angiogénicos BM-derivados utilizados na

In vitro

ensaios (dados não mostrados), os ratinhos Tie2 /LacZ foram utilizadas como doador para o TMO [42]. Uma grande fracção de células dentro de Matrigel originou BM como reflectido por imunocoloração positiva para β-gal (Figura 5B). A migração de células hospedeiras em tampões de Matrigel foi atenuada de forma significativa quando ciclopamina foi adicionado à Matrigel. Um resultado semelhante foi também obtido usando um anticorpo anti-Shh (dados não mostrados).

ensaio de tampão de Matrigel utilizando ratinhos nus quiméricos Tie2 /LacZ-BMT. fator de crescimento reduzida Matrigel misturado com meio condicionado concentrado de KP-1N (CM

KP-1N) foi transplantado para os ratos quiméricos. Em grupos experimentais, de matrigel foi também misturado com ciclopamina. (A) morfogénese capilar dentro do matrigel foi quantificada por o número de pontos de ramificação em secções H-E. (B) Matrigel foi imunocoradas com β-gal. Mostrado são média ± SEM de células positivas β-gal.

Colectivamente, os nossos resultados demonstram que a inibição da sinalização de Hh derivado de tumores conduz à inibição de angiogénese tumoral e a desestabilização da vasculatura, com uma diminuição concomitante no recrutamento de BMPCs no estroma tumor.

Regulamento do pró e anti-angiogénicos Fatores por HH Sinalização

Para identificar a base molecular do rompimento vascular pelo bloqueio Hh, quantificamos os níveis de expressão de mRNA de fatores pró e anti-angiogénicos em xenoenxertos PDAC usando conjuntos iniciador /sonda espécie-específicos para qPCR. Especificamente, nós estávamos curiosos para conhecer os níveis de VEGF e SDF-1, que são considerados fatores pró-angiogénicos devido aos seus efeitos demonstrados no recrutamento e retenção de células precursoras pró-angiogénicos em locais de formação de tumor [34], [ ,,,0],43].

Verificou-se que o VEGF humano e SDF-1 a expressão de ARNm foram reduzidos em 31% e 33%, respectivamente, nos tumores tratados com cyclopamine (Figura S7). Estes resultados estão em contraste com a regulação negativa modesta de VEGF e SDF-1 em células de ARNm KP-1N-tratada cyclopamine

in vitro

, quer em condições de normóxia e de hipóxia (Figura S8). Da mesma forma, a estabilidade HIF-1α não foi afetada em condições de hipóxia

in vitro

. Além disso, o bloqueio de Shh por anticorpo neutralizante não provocar uma redução no ARNm de VEGF em células de KP-1 N, o que sugere que a sinalização do Shh autócrino não confere um fenótipo angiogénico directamente sobre o KP-1N (Figura S8). Em vez disso, estes resultados sugerem que colectivos sinalização de Hh colide com o estroma e que os factores derivados do estroma podem contribuir para a expressão de VEGF e SDF-1 nas células de tumor in

in vivo

.

tem sido demonstrado que o cancro associado fibroblastos secretam SDF-1 para recrutar células precursoras endoteliais derivadas da medula óssea para o estroma do tumor, a fim de mediar a angiogénese [44]. Portanto, o próximo quantificada a expressão destes factores pró /anti-angiogénicas por o estroma tumoral de murino. níveis rato VEGF e SDF-1 não foram afectados por ciclopamina

In vivo

(Figura 6A), o que indica que Hh não está envolvido na modulação destes factores pró-angiogénicos por estroma tumoral.

expressões (A) de ARNm de pro- murino /factores anti-angiogénicos em xenoenxertos foram quantificados por qPCR. (B, C) ensaio de co-cultura foi realizada utilizando trenswell. células pró-angiogénicos BM-derivados (BMPCs) foram infectados com um lentivírus controlo expressando shRNA ou shRNA Smo e co-cultura com células KP-1N semeadas em Transwell (0,4 mm). O ARN foi colhido a partir da BMPCs 12 h depois de qPCR (normalizados para as células sem KP-1N). (D) Ensaio de formação do tubo foi efectuada por cultura de MS-1 em Matrigel, na presença ou ausência de BMPCs marcado com GFP. morfogénese capilar foi observada após 8 h de incubação com ou sem anticorpo neutralizante anti-IGF-1. barra de escala, 500 mm. Número de pontos de ramificação e incorporação dos BMPCs no tubo foi quantificada.

A seguir, examinou a expressão de fatores que modulam a estabilidade vascular. Nos tumores de camundongos tratados com cyclopamine, observou-se uma redução acentuada no murino de Ang-1, IGF-1, PDGF-B e ARNm, factores conhecidos para estabilizar a neovasculatura. Ang-1 desempenha um papel crucial durante a angiogénese para estabilizar neovasos [30], e o seu receptor cognato Tie2 é expresso em células endoteliais, monócitos pró-angiogénicos, bem como precursores de pericitos de origem mesenquimal [45]. A redução de Ang-1 foi acoplada com 86,3% de regulação positiva de Ang-2, um antagonista natural para Tie2, que conduz à dissociação do revestimento mural de células para iniciar a angiogénese [46] (Figura S9). Em um esforço para compreender a regulação destes fatores de sinalização de Hh, comparamos os níveis de mRNA em BMPCs que foram co-cultivados com células KP-1N. Observou-se Ang-1 e IGF-1, mas não PEDF-B de ARNm foi regulada positivamente em mais do que duas vezes de uma forma sensível à ciclopamina (Figura 6B), e a regulação negativa simultânea de ARNm de Ang-2 nos precursores. A expressão alterada de Ang-1 e Ang-2 foi cancelada por ciclopamina, e o efeito sobre a Ang-1 /razão de Ang-2 foi dramático (redução de 54,3%; Figura S9). Resultados consistentes foram observados quando segmentado Smo nos precursores derivados de BM-shRNA lentiviral, confirmando que a alteração de Ang-1 por expressão do gene ciclopamina foi devido ao bloqueio da via de SMO-dependente (Figura 6C). sinalização de Ang-1 /Tie2 Assim, HH-dependente parece ser um dos possíveis mecanismos pelos quais BMPCs estabilizar neovasos.

IGF-1 é alvo de Hh sinalização no BM-derivados de células pró-angiogénicos

O Redução em IGF-1 ARNm que observamos em xenoenxertos cyclopamine tratada (Figura 6A) também foi recapitulado nos ensaios de co-cultura; isto é, a indução forte de IGF-1 em BMPCs por factores KP-1N-derivados foi significativamente bloqueada, quer por ciclopamina ou shRNA contra a Smo (Figura 6B, C). Para verificar o papel do IGF-1 durante a neovascularização, um ensaio de formação do tubo foi realizada utilizando MS-1 (mouse madura linha CE) com a BM derivados de precursores marcados com GFP pró-angiogénicos (Figura 6D). morfogénese Capilar por MS-1 foi induzida pela BMPCs, e o efeito foi maior quando foram pré-condicionados, na presença de células KP-1N. Surpreendentemente, o efeito na formação capilar foi significativamente reduzida após tratamento com um anticorpo neutralizante anti-IGF-1. Assim, o IGF-1 é um importante alvo de sinalização de Hh em células BM-derivados, e a infra-regulação de IGF-1 em xenoenxertos de tumores por tratamento ciclopamina poderia contribuir para a perturbação da angiogénese.

Discussão

no presente estudo, foram identificadas as células pró-angiogénicos BM-derivados (BMPCs) como um dos alvos parácrinos de Hh, que desempenha um papel fundamental para promover a angiogénese tumoral e progressão tumoral. A vasculatura do tumor desestabilizado que observamos após tratamento cyclopamine primeiro nos levam a especular que podemos observar uma redução no estroma Ang-1 e IGF-1, fatores conhecidos por ser regulada por Hh via [47], [48].

Ang-1 desenvolve e estabiliza a vasculatura primitiva sob sinalização de Hh em pulmão de ramificação morfogénese [49] e Shh aumentou os níveis de ARNm de Ang-1 em fibroblastos, mas diminuiu a Ang-2 [47], [50]. A nossa experiência de co-cultura demonstraram Ang-1 mRNA em BMPCs foi regulada por factores solúveis de KP-1N de forma SMO-dependente, sugerindo um papel dos precursores como reservatório de Ang-1 no microambiente tumoral para estabilizar Tie2-expressando ECs assim como os subconjuntos de células pró-angiogénicos. Com efeito, uma certa fracção das células BM-derivados também expressar receptor TIE-2 [51], suportando um efeito autócrino ou parácrino alternativa sobre a sua actividade angiogénica pelo estroma circundante através de Ang-1 do ligando.

Existem várias fontes celulares de IGF-1 no estroma tumoral, e a redução no derivado de estroma de IGF-1 que observamos pode explicar a inibição do crescimento de células PDAC

in vivo quando

sinalização de Hh estava bloqueada [27]. IGF-1 pode também aumentar a actividade das células BM-derivadas para promover neovascularização através da via PI3K /Akt sinalização [52]. No presente estudo, o aumento da morfogénese capilar de células de MS-1 na BMPCs estimuladas com células PDAC foi claramente atenuada por anticorpos anti-IGF-1 (Figura 5D). Assim, o IGF-1 parece ser um dos objectivos fundamentais da sinalização de Hh na BMPCs e medeia o seu efeito na neovascularização. Houve uma redução significativa na expressão de PDGF-B no estroma tumoral

In vivo

, bem como em BMPCs

In vitro

; No entanto, o nosso ensaio de co-cultura de BMPCs com KP-1N não demonstrou a regulação positiva de PDGF-B de ARNm, sugerindo que o ligando derivado de Hh-cancro é improvável que desempenham um papel importante na indução de PDGF-B. No entanto, a regulação negativa de PDGF-B por ciclopamina podem parcialmente responsáveis ​​pelo recrutamento de pericitos diminuiu em rede vascular recém-formada em xenoenxertos.

Os mecanismos moleculares que nós descobrimos aqui demonstram claramente que a sinalização de Hh desempenha um papel parácrino na a progressão do tumor. Recentemente, foi relatado que a indução da transcrição de Gli pode ser mantida independente do Smo [24], ea regulação não-canônica de genes Gli-alvo é mediada em parte através de TGF-β e sinalização Kras. De facto, a maioria das células, incluindo PDAC KP-1N, expressar Kras oncogénicos e tem sido demonstrado que a via de TGF-β-Smad é activado em células de KP-1N [53]. Estes percursos podem ser responsáveis ​​pela redução modesta de Gli1 transcrição por cyclopamine que observamos. É também possível que o

In vivo

inibição do crescimento por meio do bloqueio de Hh que observamos pode ser mediada através de um efeito sobre a propriedade de auto-renovação das células PDAC iniciar raras [54]. No entanto, a alteração significativa na cinética de proliferação /morte que observou-se em uma grande proporção das células cancerosas nos xenoenxertos tratados com cyclopaminewas claramente acompanhado pela inibição da angiogénese.

ciclopamina atenuada não só o recrutamento de BM-derivado células para o tumor, mas também a sua incorporação na vasculatura tumoral, suportando um envolvimento de Hh na angiogénese associada ao tumor. Nossos dados não suportam a noção de que a sinalização autócrina de Hh em células cancerosas contribui para a angiogênese do tumor, e sim sugerir que Hh atua exclusivamente no estroma. Shh foi demonstrado para controlar directamente a actividade das células BMPCs por estimular a sua proliferação, migração e indução de factores angiogénicos para promover a remodelação vascular [26], [29], [55]. Foi demonstrado que factores segregados por células PDAC pode melhorar a migração das células precursoras, pelo menos em parte, de uma forma SMO-dependente. Houve um efeito adicional de Hh sinalização na montagem CE através de uma ativação dos BMPCs juntamente com brotando ECs maduro. Nós mostramos anteriormente que Shh pode aumentar a actividade dos precursores para promover a morfogénese capilar por HUVEC [26]. Barras de escala; Barras de escala;