Abstract

As cinases são moduladores jusante e effectors de diversas cascatas de sinalização celular e desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento da doença neoplásica. Neste estudo, objetivou-se avaliar SRC, LYN e proteína CKB e expressão de mRNA, assim como a sua metilação do promotor, no câncer gástrico. Encontrámos expressão elevada de SRC e LYN quinase ARNm e proteínas, mas a diminuição dos níveis de CKB quinase, alterações que podem ter um papel na capacidade de invasão e metástase de tumores gástricos. A expressão dos três quinases estudados também foi associado com expressão de oncogene MYC, um possível marcador biológico para o cancro gástrico. Para compreender os mecanismos que regulam a expressão desses genes, avaliou-se a metilação do promotor de ADN dos três quinases. Descobrimos que reduziu

SRC

e

LYN

metilação e aumento da

CKB

metilação foi associada com câncer gástrico. A reduzida

SRC

e

LYN

metilação foi associado com o aumento dos níveis de ARNm e a expressão da proteína, sugerindo que a metilação de DNA está envolvido na regulação da expressão destas cinases. Por outro lado, reduziu

CKB

metilação foi observada em amostras com mRNA reduzida e expressão da proteína, sugerindo expressão CKB foi encontrado para ser apenas parcialmente regulados por metilação do DNA. Além disso, verificou-se que as alterações no padrão de metilação do DNA dos três quinases estudados também foram associados com o aparecimento do cancro gástrico, cancro gástrico avançado, mais profunda invasão do tumor e a presença de metástases. Portanto, SRC, expressão LYN e CKB ou metilação do DNA podem ser marcadores úteis para prever a progressão do tumor e direcionamento das estratégias anti-câncer

Citation:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegro RC, et al. (2015) Expressão desregulamentado de SRC, LYN e CKB Quinases por DNA metilação e seu potencial papel no câncer gástrico capacidade de invasão e metástase. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

editor: Jose G. Trevino, University of Florida, United States |

Recebido: 27 de maio de 2015; Aceito: 25 de setembro de 2015; Publicação: 13 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mello et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; subvenções # 471072 /2012-5 e 402.283 /2013-9; bolsa para MCS e RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; conceder #ICAAF 123/2014 para RRB) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; concessão # 2009 /07145-9; bolsa para MFL) como subsídios e bolsas de estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto tipo de câncer mais frequente ea segunda maior causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1]. Tratamento da GC em estágio avançado continua a ser difícil, eo prognóstico ainda é pobre, em parte como resultado de recorrência local, invasão tumoral e /ou metástase. A taxa relativa de sobrevida global em 5 anos é actualmente inferior a 20% [2]. Uma melhor compreensão da biologia da progressão da neoplasia é fundamental para reduzir a taxa de mortalidade com o desenvolvimento de novos gestão paciente e estratégias terapêuticas.

Fosfotransferases, também conhecido como quinases, são moduladores jusante e efectores de várias cascatas de sinalização celular e desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de doenças neoplásicas [3]. Até à data, as drogas várias proteína-quinase interagindo foram registradas para os ensaios clínicos [4]. Nós previamente realizada triagem para identificar proteínas quinase expressos em GC usando Captura de Espectrometria de Massa Compound [5, 6] (S1 Arquivo), e 22 proteínas quinases, incluindo SRC, LYN e CKB, foram detectados (S1 Tabela). Estes três quinases foram seleccionados para mais investigações (S1 FIG).

SRC foi a primeira descoberta do proto-oncogene, e que desempenha um papel central em vias de transdução de sinal celular. actividade de Src aberrante é observado em vários cancros humanos, incluindo GC [7-9], e pode ser importante durante o desenvolvimento e progressão do tumor [10, 11]. A função mitogénica do SRC é, pelo menos em parte, mediada pela indução de MYC, um regulador do ciclo celular e o factor de transcrição [12, 13]. O nosso grupo anteriormente descrito MYC regulação positiva em GC humano e em primatas não humanos N-metil-tratada nitrosoureia [14-19]. Uma vez que a activação de CRE, bem como de outras quinases, tem efeitos pleiotrópicos que dependem do tipo de célula e de contexto [20], é ainda importante para compreender o possível relacionamento entre quinases e expressão MYC na carcinogénese do estômago e o mecanismo molecular envolvidos na sua regulação.

LYN é outro membro da família Src de quinases, e o gene de

LYN

está localizado no cromossoma 8q13. O nosso grupo previamente relatado a presença de ganhos do cromossoma 8 (em que o

MYC

gene também está localizado) em casos de GC da Região Norte do Brasil [16, 21-23] e em todas as linhas de células GC estabelecidas a partir de neoplasias em esta população [24, 25]. Portanto, este cromossomo pode conter genes importantes envolvidos na carcinogênese gástrica. Para nosso conhecimento, nenhum estudo anterior investigou o papel da LYN e sua regulação em GC. No entanto, a sobre-expressão LYN foi avaliado em vários cancros [26-32]. Além disso, a regulação da

LYN

por metilação do DNA foi demonstrado tanto em câncer colorretal e sarcoma de Ewing [33, 34], e

LYN

metilação tem sido observada em alguns hematopoiéticas e não hematopoiéticas linhas de células [35]. A metilação do DNA é uma modificação molecular de ADN que está fortemente associada com a função do gene e a função do gene de tipo específico de células [36]. Além disso, a metilação de ADN pode ser um biomarcador robusto, uma vez que é muito mais estável do que o RNA ou proteína e é, por conseguinte, um alvo promissor para o desenvolvimento de novas abordagens para o diagnóstico e prognóstico de cancros [36].

CKB é uma das duas isoformas citosólicas de creatina quinase e podem participar nos processos metabólicos que envolvem a glicólise em células não musculares [37]. Em contraste com as células normais, que geram energia principalmente através da fosforilação oxidativa, a maioria das células cancerosas preferem glicólise aeróbica, que é conhecido como o efeito Warburg [38]. Curiosamente, o oncogene MYC parece activar vários transportadores de glicose e as enzimas glicoliticas, contribuindo assim para o efeito Warburg [39]. Nosso estudo proteômica anterior revelou que várias proteínas envolvidas nos processos de produção de energia foram desregulados em amostras de GC e reforçado o efeito Warburg neste neoplasia [40]. O papel do CKB em GC permanece mal compreendido: alguns estudos transcriptomic relatou a regulação positiva de

CKB

em amostras de GC [41, 42], enquanto outro mostrou

CKB

downregulation [43]. Além disso, como para o

LYN

gene,

CKB

metilação foi anteriormente descrito no hematológica e linhas celulares de cancro sólidos, incluindo linhas celulares de GC [44]. A metilação do

CKB

parece estar relacionada com o seu nível reduzido de expressão; No entanto, uma investigação mais aprofundada é ainda necessário compreender a regulação da

CKB

por modificações epigenéticas

.

Portanto, nós primeiro teve como objetivo avaliar a expressão de mRNA e proteína da SRC, LYN e CKB em uma grande um conjunto de amostras de GC. Então, nós avaliamos se esses genes podem ser regulados por metilação do DNA na carcinogênese gástrica. Além disso, foi investigada a possível associação entre a expressão da quinase ou metilação e variáveis ​​clínicas, bem como a expressão MYC e metilação.

Material e Métodos

As amostras de tecido

expressão

Kinase e padrões de metilação foram avaliadas em 138 pares de amostras de GC e suas amostras de tecido gástrico não neoplásicas correspondentes obtidos de pacientes que foram submetidos a gastrectomia no Norte do Brasil. Todos os pacientes tinham histórias negativos da exposição a quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia, e não houve co-ocorrência de outros cancros diagnosticados. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética de João de Barros Barreto Hospital Universitário (Protocolo # 316737). consentimento informado por escrito, com a aprovação do comitê de ética foi obtido de todos os pacientes antes da coleta da amostra.

Parte de cada amostra de tumor dissecados foi fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE). As secções de tecido FFPE foram coradas com HE para avaliação histológica ou usado para a análise imuno-histoquímica (IHQ). Porções adicionais de cada tumor e amostras de tecidos emparelhados não neoplásicas foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à purificação de proteínas e de ácido nucleico.

Todas as amostras foram classificadas de acordo com Lauren [45 ], e os tumores foram classificados de acordo com os critérios de estadiamento TNM [46]. A presença de

Helicobacter pylori

, um carcinógeno de classe I, em amostras gástricas foi detectada pelo teste da urease, e o seu factor de virulência citotoxicidade gene associado A (gene CagA) foi detectar por PCR utilizando ADN purificado em simultâneo com proteínas e mRNA, como anteriormente realizado pelo nosso grupo [47]. vírus de Epstein-Barr (EBV) foi detectada por RNA de hibridação in situ [47].

Para 49 destes pares de amostras neoplásicas e não-neoplásicas, avaliou-se a imuno MYC, de expressão e de estado de metilação de dados de mRNA anteriormente publicada pelo nosso grupo [18].

Protein, mRNA e DNA purificação

a proteína total, mRNA e DNA foram simultaneamente isolados de amostras de tecido gástrico utilizando o /RNA Kit DNA AllPrep /Protein ( Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O sedimento de proteína foi dissolvido numa solução tampão contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, EUA), e 0,5% de cada um cocktail Fosfatase Inibidor 1 e 2 (Sigma -Aldrich, EUA), como previamente realizada pelo nosso grupo [48]. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford (Sigma-Aldrich, EUA). A concentração de ARN e qualidade foram determinados utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemanha) e 1% de agarose gel, respectivamente. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

análise imunorreactividade Proteína

secções de tecido de tumor (3 ou 4 mm de espessura) foram desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série gradual de etanol. Após recuperação de epítopo induzida pelo calor, as secções de tecido foram incubadas com anticorpos monoclonais de rato primária contra SRC (diluição 1: 400; clone 28, Life Technologies, EUA), LYN (diluição 1: 400; clone C13F9; Life Technologies, EUA) ou CKB (diluição 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, EUA). Um kit de anticorpo secundário conjugado com peroxidase universal (LSAB Sistema, DakoCytomation, EUA) foi utilizado para detecção. Utilizou-se 3,30-diamino-benzidina /H

2O

2 (DakoCytomation, Dinamarca) como cromógeno e hematoxilina como contrastante. Uma amostra de proteína imuno-positiva foi definida como uma que tem 10% ou mais das células neoplásicas que eram positivos para a proteína.

análise de expressão proteica

análise de Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente pelo nosso grupo [49]. proteína reduzida (25 ug) de cada amostra foi separada por 12,5% homogéneo por SDS-PAGE e para uma membrana de PVDF (Hybond-P, GE Healthcare, EUA) apagou-eletro. A membrana de PVDF foi bloqueada com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween 20, e 5% de leite com baixo teor de gordura e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos correspondentes primárias anti-SRC (diluição 1: 1000; clone 28, Life Technologies, EUA), anti-LYN (diluição 1: 1000; clone C13F9; Life Technologies, EUA), anti-CKB (diluição 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, EUA), e anti-ACTB (diluição 1: 250; Ac -15, Life Technologies, EUA). Depois de uma lavagem exaustiva, foi adicionado um anticorpo secundário conjugado com peroxidase durante 1 h à temperatura ambiente. bandas imuno foram visualizados utilizando o reagente Luminol western blot, e as imagens foram obtidas usando um sistema de imagem digital ImageQuant 350 (GE Healthcare, Suécia). ACTB foi utilizado como um controlo de referência carregamento.

expressão de ARNm de análise

Primeiro, o ARN foi transcrito reverso utilizando o High-Capacity cDNA Archive kit de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies, EUA) . DNA complementar foi então amplificado por em tempo real transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) usando sondas TaqMan compra produtos Assays-on-demand para Gene Expression (Life Technologies, EUA) e um Tempo Real-instrumento de PCR 7500 Rápido (Life Technologies , EUA). O

gene GAPDH

foi selecionado como um controlo interno para a entrada de RNA e eficiência de transcrição reversa. Todos RT-qPCRs foram realizadas em triplicata para ambos os genes-alvo (

SRC

: Hs01082246_m1;

LYN

: Hs00176719_m1;

CKB

: Hs00176484_m1) eo controle interno (

GAPDH

:. NM_002046.3)

a quantificação relativa da expressão do gene foi calculada de acordo com Livak e Schmittgen [50]. A amostra de controlo correspondente foi designado como um calibrador a partir de cada tumor.

análise de metilação do DNA

O padrão de metilação e a frequência de genes de quinase foram avaliados por PCR específicos de metilação (MSP) [51]. O Kit de DNA Metilação de EZ-relâmpago ™ (Zymo Research, EUA) foi utilizado para modificar o ADNg por tratamento com bisulfito, converter citosinas não metiladas em uracilos e citosinas metiladas deixando inalterada. iniciadores específicos para os promotores de genes estão descritos na Tabela 1.

As reacções de PCR foram realizadas usando 0,1 umol /L de dNTPs, 2 mmol /l de MgCl

2, 0,5 umol iniciadores, 1,25 U de Taq ADN-polimerase, e 100 de ADN modificado com bissulfito ng. Após desnaturação inicial de 5 min a 94 ° C, 40 ciclos a 94 ° C durante 45 s, a temperatura de emparelhamento (Tabela 1) durante 45 s, e 72 ° C durante 30 segundos foram realizados, seguido por uma extensão final de 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram directamente carregado sobre geles de agarose a 3% e a electroforese. O gel foi corado com SYBR

® Seguro DNA Gel Stain (Life Technologies, EUA) e diretamente visualizados sob iluminação UV. Como um controlo positivo para todas as reacções de MSP, uma amostra ADNg foi completamente metilado usando CpG metilase (SSSI, New England Biolabs, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Além disso, os iniciadores para a detecção da sequência de tipo selvagem foram usadas para monitorizar a conversão completa do ADN obtido na reacção de bissulfito

As amostras foram estratificados como se segue:. 1) de uma amostra foi definida como hypomethylated quando uma amplificação positiva produto foi detectado apenas no PCR com iniciadores específicos para as sequências não metilados; 2) uma amostra foi definida como hipermetilado quando amplificação positiva foi detectada apenas no PCR com iniciadores específicos para as sequências metiladas; 3) uma amostra foi definida como parcialmente metilado quando amplificação positiva foi detectada na PCR com os dois conjuntos de iniciadores.

especificidade ‘Os iniciadores e MSP resultados foram confirmados utilizando uma abordagem de sequenciação de PCR bissulfito (BSP) [52] . BSP também foi utilizada para avaliar a percentagem de metilação. Os iniciadores e temperaturas de BSP anneling estão descritos na Tabela 1. A seguir à amplificação, os fragmentos foram purificados em gel utilizando o Kit de NucleoSpin e PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Alemanha), ligado no vector pGEM T-easy Vector (Promega, Alemanha) e clonado competente

e

.

coli

células JM109. Após o tempo de incubação, foram escolhidas as colónias brancas por PCR com M13 para frente (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘) e M13 inverso (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-iniciadores 3’) [53]. Após desnaturação inicial durante 3 min a 94 ° C, a amplificação por PCR consistiu em 35 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 90 segundos foram realizados, seguido por uma extensão final de 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose. Seis clones foram seleccionados para a purificação e sequenciados num sequenciador automático ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Todas as sequências foram alinhadas com BioEdit v7.0.5 [54], e as análises de metilação foram realizadas com o software BIQ Analyzer [55]. A percentagem de metilação para cada amostra foi calculada pela divisão do número de CpG metilados pelo número total de CpG (CpG sequenciado em todos os seis clones).

Análise estatística

Os dados são mostrados como a faixa de freqüência, mediana e interquartil (IQR). O teste de Shapiro-Wilk para avaliar a distribuição da idade, ARNm, a expressão da proteína e a percentagem de metilação de dados e para determinar o teste subsequente apropriado para comparações estatísticas. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para investigar possíveis associações entre mRNA quinase ou a expressão da proteína e as variáveis ​​categóricas, como imuno, padrão de metilação e características clínico-patológicas. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para investigar possíveis associações entre a porcentagem de metilação e imuno e características clínico-patológicas. teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar a percentagem de metilação entre pares de amostras neoplásicas e não neoplásicas. Uma associação entre variáveis ​​categóricas foi analisada utilizando o teste do qui-quadrado (χ

2). Um teste de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar a possível correlação entre mRNA e expressão de proteínas, bem como a metilação do promotor. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo. foi aplicado o ajuste Bonferroni do p-valor quando comparações múltiplas foram realizadas, com o nível alfa a ser dividido pelo número de comparações.

Resultados

expressão Kinase em tumores gástricos

células gástricas não-atípicas não apresentou SRC ou LYN imuno (Fig 1A e 1C). No entanto, SRC imunorreactividade foi observada em células displásicas. membrana celular e imunorreactividade citoplasmática para SRC e LYN foi detectada em células neoplásicas (Figura 1B e 1D), e também apresentado LYN imunorreactividade nucleico. CKB imunorreactividade foi detectada no citoplasma ou na membrana celular em células não neoplásicas gástricos (Fig 1E). Em contraste, as células GC não apresentaram imunorreatividade CKB (Fig 1F)

A) mucosa gástrica sem SRC imunorreatividade.; B) câncer gástrico tipo difuso apresentando membrana celular e imuno citoplasmática de SRC; C) tecido gástrico não neoplásicas sem LYN imunorreactividade; câncer gástrico D) do tipo intestinal apresentando LYN imunorreatividade; E) mucosa gástrica não-neoplásica mostrando fraca coloração CKB citoplasmática em células glandulares; F) do tipo difuso células gástricas cancerosas sem CKB imunorreactividade.

SRC, LYN e CKB imunorreactividade foi detectada em 72 (52,2%), 66 (47,8%) e 0 (0%) do tumor amostras. SRC e LYN imunorreactividade foram associados com maiores níveis de ARNm e de proteína em amostras de GC (p 0,001, em todas as comparações; teste U de Mann-Whitney; Figura 2A, 2C, 2E e 2G). Os níveis de proteína e ARNm de SRC foram aumentados, pelo menos, 1,5 vezes (pelo menos um aumento de 50% na expressão) em 67 (48,6%) e 80 (58%), respectivamente, as amostras de GC, em relação ao seu combinados gástrica não neoplásico amostras (Fig 2B, 2D e 2K). Além disso, a proteína e os níveis de ARNm de LYN foram aumentados, pelo menos, 1,5 vezes em 36 (26,1%) e 72 (52,2%) amostras de GC, respectivamente (Figura 2F, 2H e 2K). Por outro lado, a regulação negativa de proteína e ARNm CKB (pelo menos 50% de redução de expressão) foi detectada em 104 (75,4%) e 49 (35,5%) amostras de GC, respectivamente (Figura 2I, 2J e 2K). Observou-se uma correlação forte e direta entre mRNA e expressão de proteína para SRC (p 0,001, ρ = 0,856, teste de correlação de Spearman), LYN (p 0,001, ρ = 0,762) e CKB (p 0,001, ρ = 0,819)

A) Associação entre SRC imunorreatividade e sua expressão da proteína.; B) a expressão de proteínas SRC; C) Associação entre SRC imunorreatividade e sua expressão de mRNA; D)

SRC

expressão de mRNA. E) Associação entre LYN imunorreatividade e sua expressão de proteínas; F) LYN a expressão da proteína; G) Associação entre LYN imunorreactividade e a expressão de ARNm; H)

LYN

expressão de mRNA; I), a expressão da proteína CKB; J)

CKB

expressão de mRNA; K) imagem representativa of Western-blot, em cada TNM de cada amostra é show. A proteína e a expressão de ARNm foram determinados por Western-blot e análise por RT-qPCR, respectivamente. Em todos os gráficos, a expressão em tumores gástricos foi normalizada por tecido gástrico não neoplásica correspondente. * Diferença significativa entre os grupos por Mann-Whitney (p 0,05). IHC +: casos que apresentam imunorreatividade de proteínas; IHC-: casos sem imunorreatividade de proteínas; . NM: amostra normal mucosa

A imunorreatividade da SRC foi associada com a imunorreactividade do LYN (p 0,001, χ

2 test), com 52 (37,7%) das amostras de GC apresentando imunorreactividade para ambas as proteínas. Além disso, foi observada uma correlação directa entre a proteína e SRC LYN (p 0,001, ρ = 0,556) e ARNm (p 0,001, ρ = 0,779) expressão. Os níveis de proteína CKB e a expressão de ARNm foram inversamente correlacionada com SRC (p 0,001, ρ = -0,734; p 0,001, ρ = -0,806, respectivamente) e LYN (p 0,001, ρ = -0,643; p . 0,001, ρ = -0,703, respectivamente)

a Tabela 2 mostra os resultados para SRC, LYN e expressão CKB e as características clinicopatológicas. Os tumores de pacientes com CG de início tardio apresentou significativamente maior SRC e proteína LYN (por IHC e Western blotting) e ARNm (por RT-qPCR) expressão, bem como a redução da expressão da proteína CKB por transferência de Western, em comparação com o início precoce CG amostras (p 0,05, para todas as comparações; Tabela 2). O aumento da expressão de ARNm e proteína de SRC e LYN e reduzida expressão CKB foram associadas com o estádio avançado, mais profunda invasão do tumor, bem como a presença de linfonodos e metástases distantes (p 0,05, para todas as comparações; Tabela 2)

observou-se um aumento gradual significativa em proteínas SRC (por western blotting) e a expressão de ARNm correspondente à fase do tumor (p 0,008, para a maioria das comparações; teste U de Mann-Whitney seguindo-se correcção de Bonferroni; Fig 3A e 3B). Em contraste, uma diminuição gradual significativa na expressão da proteína e ARNm CKB foi observada correspondente à fase do tumor (p 0,008, para a maioria das comparações; Fig 3G e 3H). No que diz respeito à expressão LYN, não observamos uma diferença significativa entre as fases I e II, ou entre os estágios III e IV. No entanto, as fases I e II foram significativamente diferentes das fases III e IV (p 0,008, para que estas comparações; Fig 3D e 3E)

A) a expressão da proteína SRC.; B)

SRC

expressão de mRNA; C) Percentagem de

SRC

metilação; D) a expressão da proteína LYN; E)

LYN

expressão de mRNA; F) Percentagem de

LYN

metilação; G) CKB a expressão da proteína; H)

CKB

expressão de mRNA; I) Percentagem de

CKB

metilação. A proteína e a expressão de ARNm foram determinados por Western-blot e análise por RT-qPCR, respectivamente. Em analisa esses expressão, a expressão em tumores gástricos foi normalizada por tecido gástrico não neoplásica correspondente. A metilação do DNA foi determinada por sequenciação de bissulfito de PCR. * Diferença significativa entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney seguido de correções de Bonferroni para análise de comparação múltipla (p 0,008); ** Diferença significativa entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney seguido de correções de Bonferroni para análise de comparação múltipla (p 0,001);

+ diferença entre os grupos, mas não estatisticamente significativa após o ajuste Bonferroni (p 0,05).

Quinase gene padrões de metilação em amostras gástricas

A Tabela 3 mostra o padrão de metilação do as proteínas cinases estudados em amostras gástricas neoplásicas e não-neoplásicas por MSP. Aproximadamente 60% e 30% das amostras de GC apresentou amplificação positiva com apenas o conjunto de primers não metilado (amostras hypomethylated) para o

SRC

e

LYN

genes, respectivamente (Fig 4A e 4B). A hipometilação destes genes não foi observada em qualquer amostra não neoplásico. Portanto, a frequência de

SRC

e

LYN

hipometilação foi significativamente maior em GC do que em amostras gástricas não neoplásicas (p 0,001, para todas as comparações; χ

2 de teste, seguido por correções de Bonferroni)

a)

SRC

análise de metilação do promotor, em que as amostras 1 e 2 apresentaram promotor hypomethylated, amostra 3 apresentou metilação parcial e amostra 4 apresentou promotor hypermethylated.; B)

LYN

análise de metilação do promotor, em que as amostras 1 apresentou promotor hypomethylated, amostra 2 apresentaram metilação parcial e as amostras 3 e 4 apresentavam promotor hypermethylated; C)

CKB

análise de metilação do promotor, em que as amostras 1 e 2 apresentaram promotor hypermethylated, e as amostras 3 e 4 apresentavam promotor hypomethylated. C-: branco; C +: controle positivo, a amostra gDNA completamente metilado; U: PCR com conjunto de primers não metilado; M: PCR com conjunto de primers metilado; MW: marcador de peso molecular; pb:. pares de bases

A análise BSP confirmou a análise MSP. Por BSP, 82 (59,4%) das amostras neoplásicas e 0 (0%) das amostras não neoplásicas apresentaram uma sequência clonada sem CpG metilação no

promotor SRC

. Além disso, 4 (2,89%) e 1 (0,72%) de amostras neoplásicas e não-neoplásicas apresentada uma sequência clonada sem metilação de CpG em

LYN

promotor, respectivamente. Por BSP, a percentagem de

SRC

[0,135 (0,31)

contra

0,563 (0,23); p 0,001] e

LYN

[0,238 (0,40)

contra

0,7063 (0,26); p 0,001] metilação foi inferior em amostras do que em amostras neoplásicas não neoplásicas (Figura 5A e 5B)

A)

SRC

metilação em amostras de tumores gástricos e não tumorais.; B)

LYN

metilação em tumores gástricos e amostras não tumorais; C)

CKB

metilação em tumores gástricos e amostras não tumorais; D) A correlação entre a percentagem de

SRC

metilação em tumores gástricos e amostras não tumorais emparelhados; E) A correlação entre a percentagem de

LYN

metilação em tumores gástricos e amostras não tumorais emparelhados; F) Correlação entre a percentagem de

CKB

metilação em tumores gástricos e amostras não tumorais emparelhados. * Diferença significativa entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney (p 0,05).

O

SRC

e

LYN

padrões de metilação do neoplásica e não amostras neoplásicas enquanto encontrado para ser associado (p 0,001, tanto para análises; χ

2 de teste). Observou-se que 70/81 (86,4%) dos tumores com hypomethylated

SRC

apresentados metilação parcial deste gene na amostra não-neoplásica correspondente. Além disso, verificou-se que 37/41 (90,24%) dos tumores com hypomethylated

LYN

apresentado metilação parcial deste gene na amostra não-neoplásica correspondido.

SRC

e

LYN

metilação parcial em amostras não neoplásicas foi mais frequentemente observada em indivíduos que apresentam amostras de tumores com hipometilação deste gene em comparação com tumores com metilação parcial (p 0,001, para ambos análises) ou hipermetilação (p 0,001, tanto para as análises). Além disso, parcialmente metilado

LYN

em amostras não neoplásicas foi também mais frequentemente detectadas em indivíduos que apresentam amostras tumorais com metilação parcial deste gene em comparação com tumores com hipermetilação (p = 0,004). Por BSP, observamos também que a percentagem de

SRC

(p 0,001, ρ = 0,6902; Fig 5D) e

LYN

(p 0,001, ρ = 0,739; Fig 5E ) metilação de amostras neoplásicas e não-neoplásicas foram correlacionados.

CKB

hipometilação parcial e foi observada em ambas as amostras neoplásicas e não-neoplásicas. No entanto, 48 (39%) de amostras de GC apresentou

CKB

hipermetilação (Fig 4C), que não se detectou nas amostras não neoplásicas. Além disso, a frequência de

CKB

amostras -hypermethylated foi significativamente maior no neoplásicas em comparação com amostras gástricas não neoplásicas (p 0,001), e

CKB

metilação parcial também foi significativamente mais frequente em GC do que em amostras não neoplásicas (p 0,001). Por BSP, a percentagem de

CKB

metilação foi maior nas amostras neoplásicas que nas amostras não neoplásicas [0,511 (0,42)

contra

0,133 (0,12); p 0,001; Figura 5C]. sequências clonadas sem a metilação de CpG foi detectado em quatro (2,89%) e 0 (0%) de amostras neoplásicas e não-neoplásicas, respectivamente.

O

CKB

padrão de metilação do neoplásicas e não amostras -neoplastic pareceu estar associado (p = 0,014, por χ

2 de teste). Uma análise 2×2 usando o χ

2 teste revelou que os pares em que as amostras de tumores apresentou hipermetilado

CKB

e as amostras não neoplásicas combinados apresentou hipometilação deste gene foram mais frequentes do que pares de tumores com hipermetilação e combinava amostras não neoplásicas com metilação parcial (p = 0,0381), mas este achado não atingiu significância estatística, quando foi aplicado o ajuste Bonferroni (α ajustado = 0,05 /3 = 0,0167). No entanto, ao BSP, observou-se que a percentagem de

CKB

metilação de amostras neoplásicas e não-neoplásicas foram inversamente correlacionados (p 0,001, ρ = -0,375; Fig 5F).

observou-se uma correlação direta entre o

SRC

e

LYN

padrões de metilação nas amostras não neoplásicas (p 0,001, ρ = 0.627). Além disso, uma correlação inversa foi detectada entre

SRC

e

CKB

(p 0,001, ρ = -0,467) e

LYN

e

CKB

(p 0,001, ρ = -0,359) metilação. No entanto, em amostras de GC, foi observada uma correlação directa entre a percentagem de metilação de as três quinases estudados:

SRC

e

LYN

(p 0,001, ρ = 0,840);

SRC

e

CKB

(p 0,001, ρ = 0,684);

LYN

e

CKB

(p 0,001, ρ = 0,663).

regulação metilação de quinases

Para elucidar a regulação epigenética da estudado genes, foi avaliada a possível associação entre a metilação do promotor e imuno proteína e mRNA e expressão de proteínas (por western blot)

Foi observado que tanto o mRNA e expressão de proteína de SRC (p . 0.001, ρ = -0,834; p 0,001, ρ = -0,718; respectivamente; Figura 6A e 6B) e LYN (p 0,001, ρ = -0,792; p 0,001, ρ = -0,654; respectivamente; Figura 6D e 6E) foi inversamente correlacionada com a percentagem de metilação do promotor. Além disso, os tumores com SRC [0,062 (0,08)

contra

0,375 (0,33); p 0,001; teste de Mann-Whitney; p Li et al.