Abstract

O aumento da proliferação das células cancerosas é diretamente dependente do aumento da atividade da máquina retículo endoplasmático (ER), que é responsável por dobramento de proteínas, montagem e transporte. De facto, é tão crítica que as perturbações no retículo endoplasmático pode conduzir a apoptose. Este organelo cuidadosamente regulada representa um alvo única de células cancerosas, enquanto poupando células saudáveis. Neste estudo, um extracto padronizado mangostão (MFE) foi avaliada para a modulação de proteínas de stress ER no cancro da próstata. Duas linhas de células cancerosas humanas da próstata, 22Rv1 e LNCaP e células epiteliais da próstata (PrECs) adquiridos a partir de dois pacientes submetidos à prostatectomia radical foram tratados com MFE. A citometria de fluxo, o MTT, com BrdU e Western blot foram usadas para avaliar a apoptose celular, viabilidade, proliferação e ER stress. Em seguida, avaliou-se a estabilidade de MFE microssomal e a actividade anti-cancro em ratinhos nus. MFE induzida apoptose, diminuição da viabilidade e proliferação de células cancerosas da próstata. MFE aumentou a expressão de proteínas de stress ER. Curiosamente, MFE promove selectivamente estresse ER em células de câncer de próstata, poupando PrECs. MFE suprimiu o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de tumor sem toxicidade evidente. Mangosteen extrato da fruta promove selectivamente estresse do retículo endoplasmático em células cancerosas, poupando as células epiteliais da próstata não tumorigénicas. Além disso, em um extrato da fruta in vivo definindo mangostão reduz significativamente a formação de tumores xenoenxerto

Citação:. Li G, Petiwala SM, Pierce DR, Nonn L, Johnson JJ (2013) Selective Modulação do retículo endoplasmático marcadores de estresse na próstata As células cancerosas por um extrato padronizado Mangosteen frutas. PLoS ONE 8 (12): e81572. doi: 10.1371 /journal.pone.0081572

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Julho, 2013; Aceito: 14 de outubro de 2013; Publicação: 18 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde /National Cancer Institute 1R03CA138953 (J. Johnson). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o aumento da proliferação das células cancerosas é diretamente dependente do aumento da atividade da máquina retículo endoplasmático (ER), que é responsável por dobramento de proteínas, montagem e transporte [1], [2]. De facto, é tão crítica que a modulação da síntese de proteínas não regulada se adequadamente pode levar à apoptose [3] – [6]. Isto é especialmente verdadeiro para as células cancerosas que se acumularam uma capacidade de superar os pontos de verificação do ciclo celular e apoptose [7]. À medida que a procura para a síntese proteica aumenta, há um aumento proporcional no “desleixo translacional” que conduz à acumulação de proteínas desdobradas e dobradas de mis-ER alterando a homeostase. Se não for controlada, estas células iria sofrer apoptose, no entanto, é claro que eles não têm nenhuma intenção em fazê-lo. Como esperado, as células cancerosas desenvolvem uma solução alternativa que utiliza uma via de transdução de sinal conhecido como a “resposta a proteínas desdobradas (UPR)”. Este processo pode alterar a transcrição e tradução de proteínas, assim, que restabelece ER homeostase – a um grau. Isto por sua vez promove a resistência à apoptose e aumenta a sobrevivência das células. Este fenómeno é bem estabelecida em muitos cancros diferentes, incluindo o cancro da próstata.

A teoria predominante da UPR, que é regulada por vários diferentes ER estresse proteínas /percursos, é que uma modulação positiva de estresse ER promoverá sobrevivência [2]. Em essência, isso é verdade, porém, o que pode ser mais significativo é o grau em que as proteínas ER estresse são modulados. Como evidenciado pelos nossos estudos aqui incluídos, bem como estudos por outros investigadores, apresentamos dados que sugerem que um aumento significativo nas proteínas ER estresse irá resultar em apoptose em células cancerosas.

Para os nossos estudos, avaliamos um extrato de o mangostão (

Garcinia mangostana

) e achei que modulam significativamente proteínas ER estresse. Ainda mais interessante foi a resposta aparentemente específicos para aumentar a ER proteínas de stress em células de cancro da próstata enquanto diminui a proteínas de stress ER em células epiteliais da próstata. Este efeito representa uma relação complexa que existe em células não-cancerosas e cancerosas. Aqui nós apresentamos provas de que um aumento no CHOP ER proteína resposta ao estresse /GADD153 é uma abordagem viável para novas estratégias para o desenvolvimento de terapias.

Materiais e Métodos

extrato da fruta mangostão, kits e anticorpos

Mangosteen fruta extracto (MFE) foi obtido a partir de Avesthagen, Inc. (Chatsworth, CA). Todos os anticorpos para análise de Western blot, kit de ensaio de proliferação de células BrdU, e caspase-3 clivada kit de ELISA foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kit de ensaio de proteína BCA e substratos quimioluminescentes foram obtidos a partir de Pierce (Rockford, IL). kit de APO-DIRECTA ™ foi obtido a partir de sistemas de fluxo de Phoenix (San Diego, CA). One-Step estojo de RT-PCR foi obtido a partir de Life Technologies (Grand Island, NY). RNeasy Mini Kit e de DNase isenta de RNase definir foram obtidos a partir de QIAGEN (Santa Clarita, CA).

Cromatografia Líquida de

Para determinar a concentração de α-mangostino nas amostras de extracto de fruto mangostão foram analisados em um módulo de separação de HPLC Waters 2695. As separações foram conseguidas usando um gradiente, como previamente descrito [8]. Para a determinação dos níveis séricos de α-Mangostin, as amostras de soro foram analisadas em uma bomba Thermoseparation SpectraSystem P4000 com um AS 3000 amostrador automático, um detector Thermoseparation SpectraSystem UV2000 a 243 nm, tempo de corrida de 20 minutos, e 10 ul de volume de injecção à temperatura ambiente. As separações foram alcançados com um sistema solvente isocrático, a 1,0 mL /min, e um Capcell Pak C-18, 3 um, 4,6 x 250 mm com filtro em linha Upchurch pré-coluna. O limite de quantificação e de detecção é de 0,039 ug /ml (ou seja 95 nM), e 0,0098 ug /ml (ou seja, 23,9 nM), respectivamente.

Cultura celular e tratamento

células

e LNCaP 22Rv1 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina. Todas as células foram mantidas em condições padrão de cultura de células como descrito previamente [9]. As células foram cultivadas no meio acima mencionado suplementado com uma gama de doses de MFE para tempos desejados, em seguida, pronto para experiências a jusante.

células primárias epiteliais prostáticas e tratamento

células epiteliais prostáticas primários (PrECs ) foram estabelecidos a partir de tecido prostatectomia radical na Universidade de Illinois, Chicago Medical Center, como descrito anteriormente [10]. O tecido fresco a partir da zona periférica foi seleccionado por um patologista de acordo com um protocolo IRB-aprovado. Resumidamente, o tecido foi digerido com colagenase em, e plaqueadas em placas revestidas com colagénio em PrEGM meios (Lonza, Walkersville, MD) para o crescimento de células epiteliais. Todas as células foram utilizadas na passagem secundária e ~ 70% de confluência (densidade celular). PrECs foram tratadas com 15 ug /ml de MFE durante 24 horas seguido por experiências jusante

A viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada por 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il). – 2, 5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito anteriormente [11].

proliferação celular

a proliferação celular foi determinada por ensaio BrdU de acordo com o manual do fabricante.

A citometria de fluxo

O kit APO-DIRECTA ™ (Phoenix fluxo de Systems, San Diego, CA) foi utilizado para medir a apoptose de células tratadas por citometria de fluxo [11]. Resumidamente, 22Rv1 células foram plaqueadas a 50-60% de confluência e, em seguida, tratou-se com meio completo contendo MFE. O kit foi seguido por instruções de protocolo.

Western blots

lisados ​​de células inteiras a partir de células tratadas foram preparadas como previamente descrito [9], [12]. Os lisados ​​foram quantificados usando o ensaio BCA de acordo com o manual do fabricante. Um protocolo de Western blot foi seguido comum. Resumidamente, a mesma quantidade de lisados ​​foram carregados a cada poço de 12% de gel pré-moldadas (Bio-Rad, Hercules, CA). Após transferência, as membranas foram bloqueadas e incubadas com anticorpo primário (1:1000) durante a noite a 4 ° C, enxaguadas brevemente, depois incubadas com o anticorpo secundário (1:2000) à temperatura ambiente durante 1 h. As membranas foram lavadas, incubadas com substratos e expostos num FluorChem E Imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA).

RT-PCR

Os iniciadores para a XBP-1 e de GAPDH de RT-PCR foram sintetizados por IDT (Coralville, IA) de acordo com estudos anteriores [13]. As sequências foram; XBP-1 para a frente, 5′-TTA GAG AAA CGA ACT CAT GGC C-3 ‘, a XBP-1 reverso, 5′-GGG TCC AAG TCC AGA TTG ATG C-3′, GAPDH para a frente, 5’-ACC CAT GTC ACA GCC ATC AC-3 ‘, reverso da GAPDH, 5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’. células 22Rv1 e LNCaP foram tratadas com 15 ug /ml de MFE durante 24 h. O ARN total foi extraído a partir de células tratadas e de controlo. Um micrograma de ARN total foi utilizado como molde para uma etapa de RT-PCR. o protocolo do fabricante foi seguido.

ELISA

caspase-3 níveis em mesmas quantidades de diferentes lisados ​​celulares foram detectadas com ELISA. manual do fabricante foi seguido.

Estabilidade da MFE padronizada para a- mangostino em microssomas hepáticos

0,5 mg /ml microssomas de fígado humano (Invitrogen) e microssomas de fígado de rato (BD Biosciences) foram incubados com a substância de ensaio, mangostino /MFE a uma concentração final de 1 uM, em uma solução contendo 5 mM isocítrico ácido, MgCl 5 mM de

2, 0,2 U /ml isocítrico ácido Desidrogenase e 1 mM de NADP + em 100 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,4). Os compostos foram incubados com microssomas a 37 ° C durante 0, 10, 20 e 30 minutos em duplicado. Os tubos de controlo foram incubadas sem NADP +. Após a incubação, as amostras foram agitadas e mantidas em gelo até estarem prontos para centrifugação a 17.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Após centrifugação os sobrenadantes foram transferidos para frascos e analisados ​​utilizando o método de LC-MS tal como descrito antes.

In vivo

modelo de xenoenxerto de tumor 22Rv1

Todas as experiências com animais foram efectuados de acordo com as orientações aprovadas pela Comissão Cuidado e Uso animal da Universidade de Illinois em Chicago. O protocolo foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais na Universidade de Illinois em Chicago (número de protocolo: ACC-11-019) para garantir medidas foram tomadas para amenizar o sofrimento dos animais. Na conclusão do estudo, todos os ratos receberam anestesia geral por inalação (isto é, isoflurano), seguido de CO

2 asfixia acordo com o protocolo de animais aprovados para a eutanásia. Todos os animais foram monitorados diariamente, além de pessoal de cuidado animal. Atímicos (

nu /nu

) ratos sem pêlo masculino (Harlan Laboratory, Madison, WI) sete e oito semanas de idade foram alojados em condições livres de patógenos com 12 h de luz 12 h cronograma /escuro e alimentados com uma autoclavado AIN-76A dieta

ad libitum

como descrito anteriormente [9], [12]. 22Rv1 células foram usadas para determinar o

In vivo

efeitos de MFE com base no facto de que estas células formam tumores rápida e reprodutível em ratinhos nude com xenoenxertos de tumor. Catorze animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos, com sete animais de cada grupo. Os animais do grupo 1 receberam veículo (100 ul de óleo de semente de algodão) por administração intraperitoneal (IP) e serviu como controlo. Os animais do Grupo 2 receberam mangostão extracto de fruta (35 mg /kg) dissolvida em óleo de semente de algodão por IP duas vezes por semana. Os pesos corporais foram registados ao longo do estudo.

A análise estatística

Toda a análise estatística foi realizada usando o software VassarStats. Os dados são expressos como média com desvio padrão para todos os grupos. A significância estatística de diferenças de medidas entre todos os grupos de controlo e tratados foi determinado por ANOVA de uma via seguido pelo teste HSD de Tukey para comparações múltiplas. pareado t de Student foi utilizado para o par de comparações entre os grupos sábios, conforme necessário. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

HPLC do extracto de mangostão

Usando HPLC determinamos que MFE continha mais de 35% α-Mangostin e foi utilizada em todo o estudo (figura 1A . B). Múltiplos picos indicam que MFE também contém xantonas adicionais, tais como β-Mangostin e γ-Mangostin (Fig 1A . B).

[A], xantonas polifenólicas isoladas a partir do mangostão. [B], Cromatograma de HPLC do extracto de mangostão. Sub-painel representa uma expansão do perfil para revelar componentes adicionais no extrato.

extrato reduziu a viabilidade celular Mangosteen frutas e proliferação celular em células de câncer de próstata

Observamos que MFE tem toxicidade óbvia em ambas as células LNCaP 22Rv1 e sob microscópio (Fig. 2A). Utilizando o ensaio MTT, observamos que MFE diminuiu a viabilidade celular 22Rv1 e LNCaP em uma dose e forma dependente do tempo com um efeito melhor em 22Rv1 células (Fig 2B . C). MFE também inibiu a proliferação de células LNCaP 22Rv1 e de uma forma dependente da dose (Fig. 2D).

[A], imagens microscópicas de células de cancro da próstata MFE-tratadas e não tratadas, a dose MFE foi indicado. [B], as células LNCaP foram tratados com doses crescentes de MFE para 24, 48, ou 72 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. [C], células 22Rv1 foram tratados com doses crescentes de MFE para 24, 48, ou 72 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. [D], ambos 22Rv1 e as células LNCaP foram tratados com doses crescentes de MFE, a proliferação celular foi avaliada por ensaio de BrdU. Os valores de absorvância a 450 nm (A450) representam o número de células em proliferação. Estas experiências foram realizadas em triplicado e são representados pela média, juntamente com o desvio padrão.

apoptose induzida extracto Mangosteen em células de cancro da próstata

A uma dose de 15 ug /ml de MFE, a percentagem de células apoptóticas foi 22Rv1 média de 37%, determinado por citometria de fluxo (Fig. 3A). Correspondentemente, o nível de marcador de apoptose de células clivada da caspase-3 e a expressão da proteína Bax pró-apoptótico em 22Rv1 e LNCaP aumentou com doses MFE (Fig 3B . C). Estes resultados são consistentes com a nossa anterior de avaliação puro α-mangsotin [9].

[A], percentagem de células apoptóticas em MFE-tratadas e células não tratadas foram determinados por citometria de fluxo. MFE de dose foi de 15 ug /ml. [B], caspase-3 clivada em níveis de doses crescentes de MFE células tratadas 22Rv1 e LNCaP. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de células tratadas com MFE e caspase-3 níveis foram avaliados a partir mesmas quantidades de lisados ​​celulares por ELISA, detalhes, veja

Materiais e Métodos

. os níveis de expressão relativa foram indicados como valores de absorvância a 450 nm (A450). [C], expressão da Bax, em doses crescentes de MFE-tratada 22Rv1 e LNCaP. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de células tratadas com o MFE, expressão do Bax foi detectado por Western blot, e β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Estes resultados são representantes de três experimentos independentes.

extracto de mangostão frutos aumentou a expressão de proteínas de resposta de proteínas desdobradas em células de câncer de próstata

Tem sido bem estabelecido que o estresse ER ativa UPR para restabelecer homeostatsis célula. Assim, examinamos a expressão de importantes ER estresse proteínas /UPR em células de cancro da próstata tratados com FME (22Rv1 e LNCaP). A expressão de três proteínas UPR importantes, pâncreas ER Kinase (PKR) -como ER quinase (PERK), enzima que requer inositol 1 (IRE1) e proteína homóloga C /EBP (CHOP), foram gradualmente-regulada com doses crescentes de MFE em 22Rv1 e células LNCaP (Fig. 3A).

extracto Mangosteen modulado ER específico de stress-caspase-4

tem sido relatado que a caspase-4 está localizada a membrana do RE e pode função como uma caspase-ER stress específica em células humanas [14]. Detectamos caspase-4 clivados em ambas as células LNCaP 22Rv1 e após o tratamento das células com uma gama de doses de MFE durante 24 h. Os resultados mostraram um aumento dose-dependente dos níveis de caspase-4 clivada em células tratadas com MFE (Fig. 3B).

extrato Mangosteen frutas modulados acompanhantes ER

Também investigamos as possíveis mudanças de expressão chaperones ER em células cancerosas da próstata tratados com MFE. BiP (proteína de ligação de imunoglobulina), um acompanhante ER crítica envolvida em ER estresse /RPU, foi regulado para cima com doses crescentes MFE (Fig. 3C). Calnexina é uma proteína de membrana do RE para o enrolamento adequado e controlo de qualidade [15]. Observou-se um ligeiro aumento de expressão de calnexina de 0 a 10 ug /ml de MFE em ambas as linhas celulares. Curiosamente, a expressão calnexina diminuiu dramaticamente em 15 ug /ml de MFE 22Rv1 em células (Fig. 3C). proteína ER endoplasmático oxidoreductin-1 (Ero1-Lα) é uma oxidase de ER e supra-regulados por CHOP para aumentar os níveis de proteínas deformadas [16]. MFE aumento Ero1-Lα de um modo dependente da dose (Fig. 3C). MFE também aumentou outra chaperona ER, PDI de um modo dependente da dose (Fig. 3C). Estes dados demonstram que MFE aumentou a expressão de chaperones ER estresse em células de câncer de próstata.

induzida extrato Mangosteen frutas emendados XBP-1 em células de câncer de próstata

em proteínas

Durante o estresse ER, de ligação caixa de X 1 (XBP-1) mRNA sofre unir para produzir um factor de transcrição upregulating genes UPR. Assim, utilizou-se RT-PCR para detectar a XBP-1 em células emendado 22Rv1 e LNCaP tratadas com MFE. Emendados e cDNA da XBP-1 não excisado ambos observados em células tratadas com apenas não excisado a XBP-1 de ADNc em células de controlo (Fig. 4D).

Células

22Rv1 e LNCaP foram tratados com doses crescentes de MFE ou α-Mangostin durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram preparados e sujeitos a Western blot para detectar a expressão de proteínas de stress ER críticos. [A], a expressão de proteínas de stress em ER doses crescentes de células 22Rv1 e LNCaP tratadas com MFE. [B], caspase-4 níveis de doses crescentes de células 22Rv1 e LNCaP tratadas com MFE. [C], expressão de múltiplos chaperonas ER em doses crescentes de células 22Rv1 e LNCaP tratadas com MFE. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. Estes resultados são representativos de três experiências independentes. [D], o painel superior, diagrama esquemático de XBP-1 splicing durante o estresse ER. painel inferior, as imagens em gel de agarose de produtos de RT-PCR. células 22Rv1 e LNCaP foram tratadas com 15 ug /ml de MFE durante 24 h. O ARN total foi extraído e submetido a RT-PCR. foram usadas XBP-1primers abrangendo a sequência de splicing. Os produtos de RT-PCR foram corridos num gel de agarose a 2%. GAPDH foi utilizado como controle.

Mangosteen extrato da fruta induzida seletivamente ER estresse em células de câncer de próstata, poupando as células epiteliais da próstata não-cancerosas

Em seguida, o nosso objetivo foi caracterizar o potencial de MFE para promover ER stress em células não-cancerosas. células epiteliais da próstata (PrECs) foram isolados a partir de biópsia da próstata em dois pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical. As células foram cultivadas até 60-70% de confluência e, em seguida, tratada com MFE. Curiosamente, 15 ug /ml de MFE diminuíram significativamente a expressão em PERK PrECs de ambos os pacientes, enquanto mesma dose de MFE aumentou significativamente a expressão em PERK 22Rv1. Como uma proteína a jusante regulada por PERK, CHOP expressão não aumentou em PrECs tratados MFE, enquanto que dramaticamente aumentada em células 22Rv1 tratados MFE (Fig. 5). Estes dados demonstraram que o MFE promove selectivamente o stress ER /RPU em células de cancro da próstata, mas não em células epiteliais da próstata não-cancerosas, sugerindo um efeito diferencial na modulação proteínas de stress em células cancerosas ER contra células não-cancerosas.

PrECs foram isolados a partir de doentes submetidos a prostatectomia radical. As amostras foram, em seguida, utilizado para preparar as células para o tratamento com os agentes do estudo. PrECs a partir de dois doentes com cancro da próstata ou diferentes 22Rv1 células foram tratadas com 15 ug /ml de MFE durante 24 hr e, em seguida, submetido a transferências de Western. Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. Menos e mais símbolos representam respectivamente ausência e presença de agentes indicados. Estes resultados são representantes de três experimentos independentes.

Estabilidade da α-mangostino no extrato de mangostão na presença de microssomas hepáticos

Para caracterizar a extensão do metabolismo P450, α-mangostino e extrato de mangostão foi incubada na presença de microssomas de fígado de rato e fontes humanas. Para esta experiência particular, avaliou-se microssomas hepáticos em que a administração do agente em estudo. Por 30 minutos, a estabilidade de α-mangostino MFE foi encontrado decréscimo ligeiramente no rato e de fígado humano microssomas de 30,8% e 17%, respectivamente (Figura 6A . B). Estes resultados sugerem que o metabolismo de fase I tem um papel mínimo no metabolismo do α-mangostino, que é o mais abundante xantona em MFE. Estes dados sugerem que a Fase II metabolismo em microssomas parece ser a principal via de metabolismo MFE. Foram preparadas

microssomas de fígado humano e de rato como descrito nos materiais e métodos. As barras pretas representam o respectivo controlo para esse ponto de tempo individual. barras cinzentas representam a estabilidade microssomal de α-Mangostin na Fase I enzimas do sistema em ambos mouse e microssomas de fígado humano. A ‘sem pré-incubação’ foi realizada (dados não mostrados) e não tem qualquer impacto sobre a interpretação destes dados. [A], Mangosteen Fruit Extract (padronizado para a- Mangostin) foi incubado com microssomas de fígado de rato. [B], Mangosteen Fruit Extract (padronizado para a- Mangostin) foi incubado com microssomas de fígado humano. [C], Doze animais foram injectados por via subcutânea em cada flanco do rato (isto é, dois tumores por ratinhos) com 10 ~ 1 ×

6 22Rv1 células para iniciar o crescimento do tumor. Vinte e quatro horas após a implantação de células, os animais em cada coorte receberam veículo por administração intraperitoneal ou extracto mangostão (35 mg /kg). Os pesos corporais de ratinhos nus atímicos tratados com veículo de controlo ou o extracto de mangostão (35 mg /kg) por via intraperitoneal duas vezes por semana foram medidos duas vezes por semana. [D], o volume médio do tumor de extrato de ratinhos tratados com controlo e mangostão foram plotados ao longo de dias após a inoculação de células tumorais. Os pontos de dados representam a média de 12 tumores de seis ratos; barras representam o desvio padrão da média, *

P Art 0,01. [E], representantes de portadores de tumor ratos de controle e no grupo MFE-tratada.

extracto de mangostão fruta inibiu significativamente o crescimento de células de câncer de próstata humana 22Rv1 em ratinhos atímicos sem toxicidade óbvia

Para examinar atividade anticancerígena do MFE

in vivo

, construímos modelos de ratos de xenotransplante com 22Rv1 células e os tratou com MFE ou veículo. Em comparação com o controlo, 35 mg /kg de MFE crescimento tumoral significativamente inibido (Figura 6D . E). Entretanto, não se observou qualquer diferença significativa no peso corporal entre o grupo tratado com o MFE e o grupo tratado com veículo (Fig. 6C), sugerindo MFE tem baixa ou nenhuma toxicidade a uma dose eficaz.

Discussão

O mangostão (

Garcinia mangostana

) fruta é relatado para ter uma variedade de propriedades farmacológicas incluindo o aumento índices apoptóticos em várias linhas celulares de cancro diferença [17], [18]. Uma variedade de polifenóis conhecidos como xantonas, que consistem de um sistema de anel aromático tricíclico, juntamente com vários isoprenilo, hidroxi, ou grupos metoxi ter sido isolado a partir do mangostão. O xanthone mais abundante é α-mangostino, um xanthone isoprenylated, que recebeu a maior atenção por suas propriedades promotoras de saúde [9], [19] – [23]. Ao avaliar o fruto incluindo o endocarpo e exocarp juntamente com o folhas, cascas e raízes mais de 60 xantonas diferentes foram isolados até o momento a partir do mangostão. Descrevemos previamente sobre a actividade anti-cancro de α-mangostino em células de cancro da próstata e um modelo de ratinho nus atímicos [9]. Neste estudo anterior observamos α-mangostino para inibir CyclinD1 /CDK4 e sugerem um possível mecanismo para a inibição competitiva no local de ligação de CDK4. Neste mesmo estudo, também observamos ratinhos nus implantados com células 22Rv1 para exibir um volume de tumor de 65% menor após tratamento diário com α-mangostino. Na nossa experiência, bem como outros investigadores, α-mangostino é bem tolerada com alguns relatos de doses tão elevadas como 200 mg /kg de peso corporal, não estando associado com qualquer toxicidade específica. Vários relatórios juntamente com os nossos estudos observaram α-mangostino para induzir apoptose, no entanto, os eventos que ocorrem antes da apoptose são menos compreendidos. Além disso, já relatado recentemente sobre o perfil farmacocinético do administrado por via oral α-mangostino em ratos e mostraram que a contagem de sangue completo (CBC), incluindo células brancas do sangue com diferencial não foi alterada [24]. Por esta razão, começou a explorar o retículo endoplasmático como um alvo potencial de um extracto de mangostão altamente caracterizado ( 35% α-mangostino).

O retículo endoplasmático é extremamente sensível a alterações no seu ambiente circundante que têm um efeito directo sobre a sua estrutura, a integridade e a função de [1], [2]. Como o câncer é promovido e progride há um aumento da demanda nos requisitos do retículo endoplasmático como evidenciado por um aumento na síntese de proteínas. Este aumento da procura corre o risco de fabricação de proteínas que se desdobram ou deformadas. Um aspecto importante deste aumento da demanda na síntese de proteínas é a “resposta de proteína desdobrado”, que inclui Perk, CHOP e várias outras proteínas ER estresse [25]. Como homeostase do ER está “restabelecida”, as proteínas podem ser dobradas corretamente ou sofrem degradação que por sua vez permitirá que as células sobrevivam. Se não é estabelecido homeostase pela resposta proteína desdobrada ou é perturbado por um agente externo, estas células irão sofrer apoptose. Portanto, abordagens para aumentar a resposta ER proteína relacionada com o stress pode ser uma abordagem atractiva para alterar a homeostase do ER em células cancerosas, a fim de promover a apoptose. A evidência por outros investigadores e nos sugere que a utilização de pequenas moléculas que modulam ER proteínas de stress podem também retardar o desenvolvimento do tumor, crescimento, invasão, proporcionando assim uma nova estratégia terapêutica [26], [27].

ER o stress não só favorece a sobrevivência das células cancerosas, mas em situações específicas podem promover a apoptose. agentes naturais, tais como a curcumina a partir da cúrcuma (

Curcuma longa

) foram relatados como indutores de stress ER pró-apoptótico em leucemia humana HL-60 de células por regulação positiva da expressão de PERK fosforilada, CHOP, Bip e clivada da caspase -4 [28]. Coerente com isso, em nosso estudo após o tratamento com células 22Rv1 e LNCaP MFE ambos sofrem estresse ER como evidenciado por um aumento nas proteínas de estresse ER incluindo Perk, CHOP, IRE1α, Bip e caspase-4. CHOP é uma proteína de stress ER jusante /RPU bem estabelecida e desempenha um papel importante na apoptose induzida por ER-stress [29]. Os mecanismos que CHOP contribui para a apoptose incluem a inibição anti-apoptótica de Bcl-2 e se-regulação GADD34 e Ero1α. -Regulação de GADD34 e Ero1α vai agravar o estresse ER pela recuperação tradução e aumentando os níveis de proteínas deformadas. Em 22Rv1 células, o aumento mais dramático de CHOP ocorreu com a dose de 15 ug /ml de MFE. Coincidentemente, calnexin, uma proteína de membrana ER garantindo dobrável e controle de qualidade adequada, caiu notavelmente a 15 ug /ml tratamento MFE. Isto sugere que 15 ug /ml MFE causado um possível colapso do sistema de ER controle de qualidade. Além disso, Perk, IRE1 e Bip todos foram submetidos a um impressionante aumento de 15 ug /ml tratamento MFE. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que 15 ng /ml de MFE pode ser uma dose ideal para empurrar o stress ER de pró-sobrevivência para pró-apoptose em células de cancro da próstata.

O próximo passo foi entender se MFE vai em resultado ER stress em células não-cancerosas ou se parece haver um efeito selectivo para as células cancerosas. Para entender isso melhor, células epiteliais da próstata foram isolados a partir de dois seres humanos submetidos à prostatectomia radical. O efeito da MFE foi analisada em células benignas da próstata primário epiteliais (PrECs) e 22Rv1 células. Em contraste com as linhas de células de cancro da próstata tratados com MFE imortalizadas, que resultam num aumento da actividade PERK, PrECs mostraram uma diminuição de vantagem. Esta resposta bifásica dependente do tipo de célula ilustra ainda mais a complexidade de ER stress na carcinogénese do cancro da próstata. Tomados em conjunto, a evidência sugere que MFE alvejar seletivamente as células cancerosas da próstata, poupando as células normais. será necessária uma nova e mais detalhada compreensão deste efeito diferencial.

Como já anteriormente descrito α-mangostino quando administrado por via oral resultou numa tumoral 65% menor em células 22Rv1 [9]. Em ratinhos implantados 22Rv1 tratados com MFE observou-se um volume tumoral 88% menor quando comparada com ratinhos de controlo. A dose usada nesta experiência foi de 35 mg /kg de extracto de fruta de mangostão que se aproxima a 12 mg /kg de α-mangostino. Para compreender se α-mangostino é o principal constituinte do extracto de fruta de mangostão 22Rv1 células foram tratadas com 35 mg /kg e 70 mg /kg de α-mangostino. O regime de tratamento com apenas α-mangostino representa um aumento de 300 a 600% em exposição α-mangostino. Mesmo a 70 mg /kg de α-mangostino, o que resultou num tumor de 69% menor, a fitoquímicos puro não foi tão eficaz como o MFE contendo 12 mg /kg de α-mangostino (dados não publicados). Em retrospectiva, isto não é tão surpreendente como uma mistura de fitoquímicos são muitas vezes referidos como tendo um efeito sinérgico que é superior ao fitoquímicos individuais. Como evidenciado pela nossa cromatograma há uma variedade de xantonas presentes no nosso extracto, possivelmente, maior do que 20 xantonas adicionais, que podem ser responsáveis ​​para as propriedades anti-cancro superiores de um extracto de mangostão em comparação com um indivíduo de xantonas.

a acumulação de linha germinal e /ou mutações somáticas em células “normais” resulta numa incapacidade para superar os pontos de verificação do ciclo celular e apoptose, resultando, assim, no início do cancro. À medida que a proliferação de células aumenta um aumento da procura na máquina de proteínas de uma célula deve adaptar-se através de vários mecanismos, incluindo o stress retículo endoplasmático. Em nossos estudos temos observado extrato de mangostão padronizado para a- mangostino para induzir seletivamente estresse ER em células de câncer de próstata que se correlaciona com um aumento nos índices apoptóticos. Interessantemente, em células epiteliais de próstata normais obtidas a partir de pacientes com alto risco de desenvolver cancro da próstata MFE é observado para diminuir o stress ER.