Abstract

O Zinc Finger proteína (ZnF) 280B foi identificado como um alvo inesperada de um shRNA projetado para sGCα1. Outras análises mostraram que estas duas proteínas são ligadas de outra maneira, com 280B sobre-regulação da expressão sGCα1. Knock-down e sobre-expressão experimentos mostraram que 280B serve pró-crescimento e as funções pró-sobrevivência no cancro da próstata. Surpreendentemente no entanto, estas funções pró-cancerosas de 280B não são mediadas por sGCα1, que por si só tem funções semelhantes em cancro da próstata, mas pelo p53-regulada negativamente. A proteína p53 é um alvo da segunda 280B no cancro da próstata, mas ao contrário sGCα1, p53 é regulada negativamente por 280B. 280B induz exportação nuclear p53, levando à degradação proteossómica subsequente. A proteína responsável pela regulação p53 por 280B é Mdm2, a ubiquitina ligase E3, que promove a degradação de p53 por induzir sua exportação nuclear. Mostramos aqui que 280B up-regula a expressão das proteínas MDM2 em células de câncer de próstata, e este regulamento é através do promotor Mdm2. Para demonstrar um

in vivo

relevância para essa interação, estudos de expressão mostram que os níveis de proteína 280B são regulados positivamente no cancro da próstata e estes níveis correspondem a níveis reduzidos de p53. Assim, através do aumento da expressão das proteínas MDM2, a proteína 280B uncharacterized fornece um novo mecanismo de supressão de p53 no cancro da próstata

Citation:. Gao S, Hsieh CL, Zhou J, Shemshedini L (2013) Zinc Dedo 280B Regula sGCα1 e p53 em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (11): e78766. doi: 10.1371 /journal.pone.0078766

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 14 Agosto, 2013; Aceito: 23 de setembro de 2013; Publicação: 13 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) R01CA127873-01A1. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O supressor de tumor p53 tem um papel crucial na coordenação das respostas celulares a várias tensões (incluindo danos no DNA, sobre-expressos oncogenes e diversas limitações metabólicas) [1]. Em resposta a tensões celulares, a expressão de p53 é induzido e a proteína é translocado para dentro do núcleo para se ligar a ADN de uma forma específica de sequência, activando deste modo ou reprimir genes alvo [2]. Assim, a p53 pode orquestrar saídas biológicos, tais como a apoptose, paragem do ciclo celular, senescência, ou modulação da autofagia. Vários alvos directos a jusante estão envolvidos na função anti-proliferativa dos p53, incluindo pró-sobrevivência

suvivin

[3] e do inibidor do ciclo celular

p21 /CIP1

[4].

Mdm2 (rato dupla minuto 2 homólogo) é o principal regulador da p53 [5]. Principalmente, Mdm2 é uma ligase E3, que regula negativamente a p53 através de exportação nuclear e dependente de ubiquitina proteossoma degradação [6] – [9]. Além disso, a transferase da histona acetil (HAT) proteínas p300 e CBP (proteína de ligação a CREB) estabilizar p53 através de acetilação, e este efeito de estabilização pode ser anulada por Mdm2 através da formação de um complexo ternário com p53 e p300 ou CBP [10], [11]. As mutações em p53 que que levam à perda de função de representar a variação genética mais comum em cancros humanos [12], [13]. Curiosamente, uma perda completa de p53 é encontrado apenas em cancro da próstata avançado [14]. foi mais tarde determinou-se que uma perda combinada de p53 e PTEN, um supressor de tumor envolvido na sinalização de PI3-AKT [15], foi suficiente para impulsionar o desenvolvimento de cancro da próstata invasivo [16]. Outra supressor de tumor, NKX3.1, foi demonstrado que o aumento de acetilação e a estabilidade de p53 por meio de mecanismos de Mdm2-dependente [17].

guanilil-ciclase solúvel (sGC) é o receptor de óxido nítrico (NO), e é bem conhecido pela sua actividade enzimática para converter guanosina 5′-trifosfato (GTP) para cíclico de guanosina 3 ‘, 5’-monofosfato (cGMP). Esta via é principalmente envolvido nos sistemas cardiovascular e nervoso [18]. Temos relatado anteriormente que a subunidade α1 da SGC (sGCα1; nome gene

GUCY1A3

) é um alvo direto de receptor de andrógeno (AR) e desempenha papel importante na condução proliferação de células de câncer de próstata [19]. Determinou-se também que sGCα1 serve uma função pró-sobrevivência no cancro da próstata através da inibição da actividade de p53 e suprimir selectivamente genes que estão envolvidos na apoptose, por meio de um mecanismo de sequestro da p53 citoplasmática [20]. Interessantemente, estas funções pró-cancerosas de sGCα1 são independentes da actividade da enzima GCs. Mais recentemente, o potencial terapêutico da segmentação sGCα1 foi desenvolvido através de um péptido de ligação que tem actividade anti-cancro forte [21].

Zinco dedos (ZnF) são um motivo de ligação de ADN comum encontrada em vários factores de transcrição, e C

2H

2 motivo é o tipo mais comum [22]. Este motivo é caracterizado por dois resíduos de cisteína e histidina dois de coordenação de um ou mais iões zinco, e projectando-se para uma estrutura de dedo do tipo que interage com ADN [23]. Estão surgindo evidências de que as proteínas ZnF desempenham um papel importante em cancros humanos. Por exemplo, ZNF23 inibe o crescimento de células tumorais através do realce de p27 /Kip 1-expressão, e os níveis de proteína ZNF23 expressão são muito reduzidos no cancro humano [24]. No cancro colorectal, ZKSCAN3 expressão (ZNF306) foi elevada e sob-expressão de ZKSCAN3 reduzida tumorigenicidade [25]. Além disso, vários relatórios mostram que as proteínas ZnF pode afetar a atividade p53. ZNF668 foi identificada como um supressor de tumor no cancro da mama, o que estabiliza a p53, impedindo ubiquitinação p53 mediada por Mdm2 e degradação [26]. ZNF307 suprime a actividade de p53 e p21, aumentando a transcrição das proteínas MDM2 e EP300 [22].

Ao estudar a função de sGCα1 usando RNAi, identificou-280B Dedo de Zinco (ZNF280B, posteriormente chamado 280B) como um alvo de um dos sGCα1 shRNAs. A pouca informação disponível sobre 280B e a possível relação de proteínas ZnF com p53 nos encorajou a prosseguir a análise 280B para um papel potencial no câncer de próstata. Neste estudo, que mostram uma interacção funcional entre 280B, p53, e Mdm2. A sobre-expressão de 280B diminuíram significativamente os níveis de p53, diminuindo a sua estabilidade. Este efeito sobre a estabilidade de p53 é mediada pela capacidade de 280B para induzir a expressão das proteínas MDM2, através de um efeito positivo sobre o promotor Mdm2. Ao suprimir p53, 280B fornece funções de pró-sobrevivência e pró-crescimento no câncer de próstata. Em apoio a esta, alta expressão de 280B é associado com baixos níveis de p53 em tecidos tumorais de próstata.

Materiais e Métodos

cultura de células e siRNA transfecção

LNCaP, C81 e células CWR-22Rv1 foram cultivadas como previamente descrito [20]. células epiteliais da próstata normais (Prec) foram cultivados em PrEGM como recomendado pelo fornecedor (Lonza). Mexidos ARNsi de controlo, sGCα1 siRNA, MDM2 siRNA (GAACAAGAGACCCUGGUUA) e ZNF280B siRNA (GGAACAAUCAUGUGAGGAA) (Dharmacon) a 40 nM de concentração final foi transfectado em células utilizando Lipofectamina Simax (Invitrogen).

Reporter Assay e transfecção de plasmídeo

C81 células foram cultivadas até 80-90% de confluência em meio RPMI-1640 com 5% de FBS. Após 24 horas, o meio foi substituído com meio isento de soro e as células foram transfectadas transientemente com o plasmídeo repórter p53-Luc ou Mdm2-Luc plasmídeo repórter, e ARNsi de controlo ou ARNsi contra ZNF280B e p53. O plasmídeo que codifica b-galactosidase pCH110 foi utilizada para monitorizar a eficiência de transfecção [27]. O plasmídeo p53-Luc foi gentilmente cedido pelo Dr. Andrei Gudkov e contém três elementos de resposta p53. O plasmídeo de expressão de MDM2-Luc e Mdm2 foi gentilmente cedido pelo Dr. M. Jason Shohet. A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 e a actividade da luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de luciferase da Promega.

adenovírus e lentivírus Infecções

C81 células foram infectadas com 5-50 MOI de qualquer um adenovirus expressando ZNF280B (ABMGood)) ou um adenovírus vazio como um controlo. Após 48 horas, as células foram submetidas a RT-PCR e transferência de Western.

sGCα1 shRNA, shRNA vazio, e vectores de pacotes foram adquiridos a Abertas Biosystems. As partículas lentivirais foram preparados seguindo o protocolo da Companhia. As células LNCaP foram infectadas com lentivírus e seleccionados utilizando puromicina a uma concentração de 4 mg /ml. Após 4 dias de selecção, as células foram submetidas a ensaio de MTT, qRT-PCR, transferência de Western.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi utilizada para comparar o nível de ZNF280B nos tecidos da próstata e tecidos tumorais normais obtido a partir do CHTN. foi utilizado para imunoistoquímica como previamente descrito [27]

Os ensaios de proliferação

Após transfecção siRNA durante 3 dias, 20000 células de cada condição foram semeadas em anticorpo ZNF280B (Sigma 1:200 diluição). placas de 24 poços. O ensaio de MTT (Sigma) foi usada como anteriormente [21], para determinar o número de células.

Western blotting e Fraccionamento celular

transferência de Western foi realizada como descrito [19] utilizando anticorpos primários contra sGCα1 ( Cayman Chemical), ZNF280B (Abgent), MDM2 (Santa Cruz), Survivina (Cell Signaling Technology), p21 (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz), β-tubulina (Abcam), RARa (Santa Cruz), β- actina (Abcam).

células C81 tratadas com siRNA e adenovírus foram recolhidas e lavadas uma vez com PBS frio. 10% das células foram guardadas como entrada e a porção restante foi dividido em fracções nucleares e citosólicos usando Nuclear /Cytotsol Fraccionamento Kit (MBL International). As fracções foram então sujeitas a Western Blotting para medir os níveis de proteína p53 e ZNF280B.

semi-quantitativo de RT-PCR e QRT-PCR

ARNm total foi isolado utilizando o reagente Trizol seguinte protocolo de fabrico ( Invitrogen), e submetido a semi-quantitativo de RT-PCR e PCR QRT- análises tal como descrito [28]. Os iniciadores a montante e a jusante de PCR utilizados para cada gene foram:

Survivina

, 5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 ‘e 5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3’;

p53

, 5′-GGCCCACT TCACCGTACTAA-3 ‘e 5′-G TGGTTTCAAGGCCAGATGT-3’;

sGCα 1

, 5′-AGCAGTGTGGAGAGCTGGAT-3; e 5′-CTGATCCAGAGTGCAGTCCA-3 ‘;

p21

, 5′-GACACCACTGGAGGGTG ACT-3 ‘e 5’-CAGGTCCACATGGTCTTCCT;

GAPDH

, 5′-CGACCACTT TGTCAAGCTCA-3 ‘e 5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’.

MDM2

, 5′-TTTCGCAGCCAGGAGCACCG-3 ‘e 5′-AGTTTCCTTCACGGGGCGCG-3’;

ZNF280B

, 5′-TCCCAAAAGGGCTAAACTCA-3 ‘e 5’GTCCTTTGGAAAAGC- TGCTG-3’.

Resultados

Um sGCα1 siRNA como alvo 280B em células de câncer de próstata

para estudar o papel de sGCα1 endógeno em células de cancro da próstata, que utilizado para knockdown shRNA este gene em células LNCaP. Entre cinco shRNAs diferentes, dois eram mais eficaz na expressão da proteína sGCα1-regulação para baixo: shRNA7 e shRNA8 (dados não mostrados). Estes shRNAs foram utilizados para um estudo mais aprofundado. Como mostrado na Fig. 1, shRNA8 foi mais eficaz do que a diminuição shRNA7 ambos os níveis de mRNA e proteína sGCα1 (Figura 1B.) (Fig. 1A); Foram observados resultados semelhantes com siRNA7 e siRNA8 (Fig. S1B, C). É interessante notar, no entanto, shRNA7 (e siRNA7) foi significativamente mais forte do que shRNA8 (e siRNA8) em bloquear a proliferação de células LNCaP (Fig. 1C e A Fig. S1C). Este resultado surpreendente nos levou a considerar a possibilidade de efeitos off-alvo de uma ou ambas as shRNAs. Uma pesquisa BLAST identificaram que 17 de 21 nucleotídeos de siRNA7 combinou perfeitamente com a parte do gene 280B (Fig 1D.); uma parte significativa do siRNA8 combinados o gene HIF1A (dados não mostrados). shRNA7 e siRNA7 foram capazes de significativamente regular negativamente 280B tanto ao nível do mRNA (Fig. 1E) e proteína (Fig. 1F), enquanto shRNA8 /siRNA8 não teve qualquer efeito, em células LNCaP e as duas linhas celulares independentes de hormonas C81 e CWR-22Rv1; Curiosamente, nem shRNA8 nem shRNA7 afectada expressão HIF1A (dados não mostrados). Tendo em vista estes dados, a hipótese de que o efeito negativo maior no crescimento celular de shRNA7 /siRNA7, em comparação com shRNA8 /siRNA8, é devido ao efeito adicionado de shRNA7 /siRNA7 em 280B. Para testar esta hipótese, foi utilizado um siRNA específico-280B, que curiosamente tem um efeito negativo significativo sobre a proliferação de células LNCaP (Fig. 1H). A hipótese foi directamente testada através da realização de uma dupla knockdown de sGCα1 usando o siRNA8 e o siRNA específico-280B (Fig. 1G), o qual bloqueou a proliferação de células mais fortemente do que o siRNA8 ou 280B siARN sozinha e quase na mesma medida como siRNA7 ( Fig. 1H). Estes dados sugerem fortemente que 280B serve uma função pró-crescimento em células de cancro da próstata.

(, B, C A) As células LNCaP foram infectadas com lentivírus ou vazio lentivírus expressando um dos dois diferente sGCα1 shRNAs (7, 8 ) e expressão sGCα1 foi medida por PCR em tempo real (A) ou por Western blot (B), e a densidade celular foi medida pelo ensaio de MTT (C). (D) O diagrama mostra a homologia de nucleótidos entre os ARNsi 7 e 280B. (E, F) de células LNCaP, C81, e CWR22-RV1 foram submetidas aos mesmos níveis de infecções e 280B foram medidos por PCR em tempo real (E) ou por Western blotting (F). células (G, H) C81 foram transfectadas com controlo (Ctrl), sGCα1 siRNA (7,8), 280B siRNA, 280B e mais sGCα1 ARNsi 8, e os níveis de sGCα1 foram medidos por Western blotting (L), e a densidade celular foi medida pelo ensaio de MTT (H). Todos os níveis de expressão são em relação à primeira condição (A, D), e que foi definido como 1. β-actina serviu como um controlo de carga nos Western blots. Os gráficos de barras representam médias de três experiências independentes e mais SD. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,01).

280B up-regula sGCα1 mRNA e proteína em células de câncer de próstata

Para estudar o papel da 280B em células de câncer de próstata, que usamos o 280B-específica siARN (a partir da Fig. 1G). O siARN 280B foi capaz de regular negativamente, como esperado, o ARNm e proteína de 280B (Fig. 2A) e, surpreendentemente, sGCα1 expressão (Fig. 2A). Uma explosão pesquisa da sequência 280B siARN identificado apenas o gene 280B como um alvo directo e mostrou claramente que sGCα1 não tem qualquer semelhança de sequência com a sequência de siRNA 280B. Estes dados sugerem que o mRNA e proteína sGCα1 são um alvo da proteína 280B, não o siARN.

(B, A) As células LNCaP foram transfectadas com ARNsi níveis 280B e sGCα1 ou controlo foram medidos por-tempo real PCR ou por Western blotting (A) e de células de densidade foi medida pelo ensaio de MTT (B); fase de contraste fotos foram tiradas no dia 6 (B). (C, D), as células LNCaP foram infectadas com adenovírus vazio ou sGCα1 após transfecção com controlo (-) ou níveis 280B siRNA (+), e sGCα1 foram medidos por Western blotting (C), e a densidade celular foi medida pelo ensaio de MTT (D ). Todos os níveis de expressão são em relação à primeira condição (A), e que foi definido como 1. β-actina serviu como um controlo de carga nos Western blots. Os gráficos de barras representam médias de três experiências independentes e mais SD. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,01).

Para determinar se o sGCα1 regulada para baixo é responsável pela proliferação celular reduzida resultante 280B knockdown, repetiu-se a transfecção com o siARN 280B, que quanto antes (ver Fig. 1 H), resultou num marcado abrandamento no crescimento celular de LNCaP (Fig. 2B). Com efeito, as células tratadas com siRNA 280B alterou a sua morfologia e começaram a morrer (Fig. 2B). Para determinar se sGCα1 sobre-expressão pode salvar as células, as células transfectadas com ARNsi foram infectadas com adenovírus sGCα1, resultando em níveis de proteína sGCα1 recuperadas (Fig. 2C). A sobre-expressão de sGCα1 falhou para resgatar as células (Fig. 2D), o que indica que sGCα1 é ou não capaz ou não suficiente para resgatar células de cancro da próstata ter reduzido expressão 280B e, assim, sugerem que outro alvo 280B está envolvido.

280B regula negativamente a proteína p53 em células de cancro da próstata

Uma vez que o nosso trabalho anterior mostrou que sGCα1 inibe a actividade de p53 no cancro da próstata [20] e outro trabalho indicou que as proteínas ZnF podem afectar a via de sinalização de p53 [29] , queríamos determinar se 280B afeta p53. Curiosamente, siRNA knock-down de 280B levou ao aumento dos níveis de proteína p53 em LNCaP, C81 e células CWR-22RV1 (Fig. 3A). Em contraste, adenovírus mediada por sobre-expressão de 280B marcadamente reduzidos níveis de proteína p53 (Fig. 3B). O efeito foi observado apenas na proteína p53, uma vez que os níveis de ARNm de p53 não foram afectados por 280B (Fig. 3C e D). Colectivamente, estes dados mostram que regula negativamente 280B p53 única ao nível da proteína e, assim, é distinto do seu efeito sobre sGCα1, o que é positivo e observado em ambos os níveis de mRNA e proteína.

(A, C) de LNCaP , células C81, CWR22-RV1 foram transfectadas com o controlo (-) ou 280B de siRNA (+) e p53, survivina, p21, e 280B níveis de expressão foram medidos por transferência Western (A) ou PCR em tempo real (C). células (B, D) foram infectadas com C81 vazio (-) ou 280B adenovírus (+) e p53, survivina, p21 e os níveis de expressão 280B foram medidos por transferência Western (B) ou PCR em tempo real (D). Todos os níveis de expressão são em relação à primeira condição (C e D), e que foi definido como 1. células (E) C81 foram transfectadas com 0,2 ug de p53-Luc e de controlo (-), ou 280B (+) siRNA, na presença de controlo ou siRNA p53. a actividade transcricional de p53 actividade foi quantificada medindo a actividade de luciferase. Todas as actividades são relativas à primeira condição, e esta actividade foi definido como 1. (F, G) As células a partir de (E) foram submetidas a transferência de Western para o p53, Survivina, p21, e 280B (F), e medição da densidade celular pelo ensaio de MTT (L). β-actina serviu como um controlo de carga nos Western blots. Os gráficos de barras representam médias de três experiências independentes e mais SD. Os asteriscos indicam significância estatística (P 0,02).

Uma vez que os níveis de proteína 280B altera p53, seria de esperar que a afetar p53 atividade transcricional. Este foi monitorizada por ensaio de gene repórter ou expressão de genes regulados por p53 endógenos. Usando um plasmídeo repórter da luciferase contendo elementos de resposta p53 [30], observou-se um aumento significativo da actividade de p53 em resposta a transfecção siRNA 280B (Fig. 3E). transfecção transiente de 280B plasmídeo de expressão causado uma pequena, mas significativa diminuição da actividade de p53 (Fig. S2). Para estudar os genes endógenos, que voltada para a expressão de survivina e p21, uma vez que o crescimento celular inibido significativamente 280B siRNA (ver Fig. 2B). Survivina é um gene reprimido-p53 que medeia a sobrevivência das células e o p21 é um gene induzida por p53, que inibe a progressão do ciclo celular. Em resposta à depleção 280B, proteína de Survivina foi reduzida e p21 foi aumentada em todas as três linhas celulares (Fig. 3a). Os dados de PCR em tempo real confirmou que afecta 280B survivina e p21 ao nível do mRNA (Fig. 3C). Entretanto, foram observados os efeitos opostos, quando as células foram tratadas com 280B sobre-expressão, originando um aumento de Survivina e reduzidas proteínas p21 (Fig. 3B) e ARNm (Fig. 3D).

Estes resultados sugerem que 280B pode servem a uma função pró-sobrevivência no cancro da próstata. Para testar esta hipótese, nós monitoramos a apoptose através da medição de clivagem PARP. Tanto as células LNCaP e CWR-22Rv1 apresentaram níveis elevados de PARP clivada em resposta a 280B knockdown (Fig. S3). Para estudar o papel da p53 no presente processo, foram utilizados etoposido, que como esperado, induziu níveis elevados de p53 e clivagem PARP elevada (Fig. 3F). Mais importante, estes efeitos foram diminuídos ou ido quando 280B foi sobre-expresso (Fig. 3F), demonstrando claramente que 280B pode proteger as células da apoptose induzida por etoposido.

próxima explorou se a p53 está envolvido na inibição do crescimento induzida pelo siARN 280B. Para fazer isto, utilizou-se ARNsi para diminuir a expressão de p53 endógeno em células C81, o qual foi confirmado pela actividade do gene repórter reduzida (Fig. 3E) e a expressão de proteínas reguladas-p53 (Fig. 3G). Significativamente, siRNA knockdown de p53 foi capaz de crescimento de células de resgate quase completamente inibida pela depleção 280B siRNA (Fig. 3H), sugerindo fortemente que a p53 é responsável pela elevada do crescimento celular suprimidos pelos 280B knockdown.

280B desestabiliza o proteína p53 em células de cancro da próstata por cima de regulação de Mdm2

os dados acima mostram que 280B inibe a actividade transcricional de p53 e diminui os níveis de proteína p53, sem alterar o seu nível de ARNm sugerem que 280B tem como alvo a proteína p53. Para determinar se 280B pode afectar a estabilidade da proteína p53, utilizou-se ciclo-heximida (CHX) para medir p53 semi-vida. Sub-expressão de 280B por ARNsi específico leva a um aumento na p53 meia-vida de 14 min a 24 min (Fig. 4A), ao passo que a sobre-expressão de 280B diminuiu fracamente a meia-vida (Fig. 4B).

(, B a) as células C81 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou 280B siRNA (a) ou infectadas com adenovírus vazio ou 280B adenovírus (B) durante 48 horas e, em seguida, tratada com 100 mg /ml de ciclo-heximida (CHX) para a indicada vezes, após o que transferência de Western foi utilizada para medir os níveis de p53. painéis esquerdo representam quantificada Western blots. células (C, D) C81 foram transfectadas com ARNsi 280B ou 280B infectadas com adenovírus e submetido a fraccionamento de células, seguido por transferência de Western para medir a citosólica (C) ou níveis nuclear (N) de p53 e 280B. Note-se que os números acima das pistas representam níveis relativos de proteína p53, normalizados para os níveis de p-actina, sendo a primeira pista definido como 1. células (E) C81 foram infectadas com adenovírus vazio ou 280B adenovírus durante 48 horas e depois tratou-se com 10 mM nutlin-3A ou de veículos, seguido por transferência de Western para medir a citosólica (C) ou (N) os níveis de p53 nucleares e 280B. Para todas as experiências, β-actina serviu como um controlo de carregamento. β-tubulina e RAR, utilizados como marcadores para citosólicas e nucleares fracções, respectivamente (C, D, E).

Para entender melhor o efeito 280B na estabilidade da proteína p53, p53 acompanhámos localização subcelular. Note-se que Western blotting para β-tubulina (citosólica) e RARa (nuclear) confirmou a pureza das duas fracções celulares e que o 280B é exclusiva ou principalmente uma proteína nuclear (Fig. 4C). A redução dos níveis de proteína endógenos 280B resultou em p53 nuclear significativamente elevados, mas nenhuma alteração nos níveis de citossólicos (Fig. 4C). O experimento complementar, a sobre-expressão de 280B, p53 reduziu novamente nuclear sem alterar os níveis citossólicos (Fig. 4D). Estes resultados sugerem que a degradação de p53 promove 280B proteossómica através da indução de p53 exportação nuclear. Para se obter evidência para esta, p53 localização subcelular foi monitorizada na presença de nutlin 3A, um inibidor da interacção com proteínas MDM2 p53 e exportação nuclear, assim, [31]. Como mostrado na Fig. 4E, nutlin-3A quase eliminou completamente a redução 280B mediada nos níveis de p53 nucleares, um resultado consistente com um papel 280B em p53 exportação nuclear.

exportação nuclear de p53 depende Mdm2, que é um passo essencial líder a degradação de p53 proteossómica [6], [7]. Confirmou-se o efeito em células de cancro da próstata, em que Mdm2 siARN induzida níveis mais elevados de p53, enquanto nuclear transiente sobre-expressão das proteínas MDM2 estes níveis reduzidos (Fig. S4), que imita o efeito 280 em p53. Desde que as proteínas ZnF têm a capacidade de regular a transcrição, a hipótese de que 280B pode afetar p53 através da regulação da expressão das proteínas MDM2. Nós começaram a investigar esta possibilidade, medindo a expressão das proteínas MDM2, que é significativamente reduzida, tanto o ARNm e os níveis de proteína quando se esgota 280B (Fig. 5A). Em contraste, 280B sobre-expressão tem o efeito oposto, resultando em aumentos acentuados em ambos

Mdm2

mRNA e expressão de proteína (Fig. 5B). Uma vez que o

Mdm2

ARNm é afectada por 280B, é possível que o efeito é transcricional. Para testar esta possibilidade, analisamos uma atividade potencial 280B no

promotor Mdm2

, usando um ensaio de gene repórter luciferase. A expressão transitória em células de 280B C81 aumentado

Mdm2

actividade do promotor de um modo dependente da dose (Fig. 5C) e depleção de siRNA 280B bloqueou

Mdm2

actividade do promotor (Fig. 5D). Estes resultados demonstram claramente que actua sobre o 280B

Mdm2

promotor e sugerem que o promotor pode ser um alvo directo de 280B.

(A, B, E) C81 células foram transfectadas com (A , e) ARNsi de controlo (-) ou 280B siRNA (+) ou (B, e) infectadas com adenovírus vazio (-) e 280B adenovírus (+) e submeteu-se em tempo real de RT-PCR e transferência de Western para medir a expressão de mdm2 e 280B. (C, D) C81cells foram transfectadas com 0,1 ug Mdm2-Luc e co-transfectadas com (C) siRNA de controlo (-) e 280B siRNA (+), (D) pCIneo vazio (-) e 0,2 ug e 0,4 ug 280B, e monitorizados para 280B actividade medindo a actividade de luciferase. (E) C81cells foram co-transfectadas com pCIneo vazio (-) ou Mdm2 (+) e ARNsi de controlo (-) ou Mdm2 siRNA (+), seguido por transferência de Western para medir a citosólica (C) ou nucleares (N) os níveis de p53, 280B, e Mdm2. Para todas as experiências, β-actina serviu como um controlo de carregamento. p-tubulina e RARa foram usadas como marcadores para citosólicos e nucleares fracções, respectivamente (E). Todos os níveis de proteína p53 foram em relação à primeira condição, e foi definido como 1. Os asteriscos * e ** indicam significância estatística de P 0,05 e P . 0,01, respectivamente

Para começar a estudar a o envolvimento das proteínas MDM2 na exportação nuclear 280B mediada por p53, a expressão de MDM2 foi alterado nas células C81 para determinar se este poderia afectar a actividade da p53 280B localização subcelular. Na verdade, este foi o caso, como a sobre-expressão das proteínas MDM2 reduziu significativamente a acumulação nuclear de p53 que foi desencadeada por 280B knockdown (Fig. 5E). Na experiência complementar, Mdm2 knockdown eliminou a actividade negativa que a sobre-expressão 280B tem sobre os níveis de p53 nuclear (Fig. 5E). Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que o efeito sobre a p53 280B é mediada através da regulação da expressão de MDM2 280B. Note-se que Mdm2 é primariamente citoplasmática em células de câncer de próstata.

280B é sobre-expressos em tumores de próstata e se correlaciona com a proteína p53 reduzida

Para estabelecer a importância de 280B no cancro da próstata, primeiro examinou a expressão de 280B num painel de linhas celulares de cancro da próstata e uma linha celular normal. Os resultados de RT-PCR mostrou níveis de mRNA 280B foram 6-7 vezes superior em células cancerosas do que as células epiteliais da próstata normais (PrEC) (Fig. 6A). Western blotting mostrou a mesma conclusão, com níveis significativos de proteína nas células de cancro da próstata e nada detectável nas células PrEC (Fig. 6A). Para estender nossas observações ao ambiente clínico, foi realizada imuno-histoquímica em tecidos emparelhado-jogo a partir de 4 pacientes. Os pacientes 2 e 4 apresentaram forte imunorreatividade 280B do que os tecidos normais (Fig. 6B), mostrando que a expressão 280B é elevada em alguns tumores de câncer de próstata. Como seria de esperar para um factor de transcrição, 280B é expresso exclusivamente nos núcleos de células de todos os tumores (Fig. 6B). O estudo tecido foi expandido para incluir mais tecidos e para procurar uma possível correlação entre 280B e expressão da p53. Como mostrado na Fig. 6C, 280B proteína é expressa em 6 de 10 tumores da próstata, ao passo que em apenas um dos três de próstata normal. Curiosamente, a proteína p53 é expressa mais altamente nesses tumores (# 1 e # 7) que não expressam níveis detectáveis ​​de 280B, e o nível de p53 menor encontra-se no tumor com a expressão mais elevada 280B. Estes dados revelam uma relação inversa na expressão de 280B e p53 em tumores da próstata e, portanto, são consistentes com um papel importante para 280B como um regulador negativo da p53 no cancro da próstata

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(A) PCR em tempo real e western blotting foram usadas para detectar a expressão de 280B na próstata normal (PrEC) e linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP, C81, e CWR-22Rv1). (B) Imuno-coloração de 280B em 4 pares combinados de tecidos da próstata, normal contra o tumor. extracto (C) celular a partir de tecidos prostáticos normais 4 e 9 tecidos tumorais foram sujeitas a transferência de Western para detectar 280B, a p53, e os níveis de expressão de MDM2. β-actina serviu como um controlo de carga.

Discussão

Antes deste estudo, 280B era uma proteína descaracterizado, com a única informação disponível descrevendo a sua relação com a grande família de zinco factores de transcrição dedo [32]. Neste estudo, foram identificados dois alvos de 280B, sGCα1 e p53, os quais têm funções importantes no cancro da próstata. O primeiro, sGCα1, tem um papel bem caracterizado NÃO sinalização e um papel menos conhecido na progressão do cancro da próstata. No que diz respeito à última função, os nossos dados anteriores mostraram que sGCα1 é um mediador importante de suporte de androgénio da proliferação de células de cancro da próstata [33] e um repressor de p53 que fornece as células de cancro da próstata uma função pró-sobrevivência [20]. A nossa descoberta de que 280B aumenta a expressão de sGCα1 é consistente com 280B com função pró-cancerosas, que estão claramente indicados pela sua expressão elevada no cancro da próstata e a sua função pró-proliferativo em células de cancro da próstata. Curiosamente, foi observado o efeito positivo de 280B em ambos os mRNA e proteína sGCα1, o que sugere que o ARNm, e talvez o promotor sGCα1, pode ser alvo de 280B. Usando um trecho 1-kb do promotor sGCα1 na qual os actos ar [33], não se observou actividade 280B (dados não mostrados). Isto pode ser devido, quer ao efeito 280B em sGCα1 está fora nossa região 1-kb, ou é pós-transcricional, algo que vai ser estudada no futuro. Vale ressaltar que 280B compartilha uma sequência de DNA comum limitada com sGCα1, a sequência que é alvo de siRNA7, o que nos levou a identificar 280B. Tendo em conta estes dados, é intrigante a considerar a possibilidade de um miRNA endógeno comum ou siRNA, que atua em ambos sGCα1 e 280B. Se existir um tal ARN reguladora, este ARN poderia ser prevista para ser sub-regulada no cancro da próstata, tanto desde sGCα1 e 280B são sobre-expressos nesta doença. Identificação de um tal ARN específico é um importante objectivo futuro do laboratório.

Apesar da regulação positiva por 280B de sGCα1, sobre-expressão de sGCα1 surpreendentemente não conseguiu resgatar células inibidas por 280B exaustão, sugerindo um outro alvo de 280B . A nossa busca levou a p53. Em contraste com sGCα1, p53 é regulada negativamente pela 280B, e este regulamento está direcionado para a proteína p53. Sub-expressão de p53 é capaz de quase completamente inibida por células de resgate 280B expressão diminuída. Assim, no contexto da diminuição da expressão 280B em células de cancro da próstata, o que resultou em níveis reduzidos de sGCα1 e aumento da p53, o aumento da p53 foi principalmente ou exclusivamente responsável pelo crescimento celular reduzida e, provavelmente, a apoptose aumentada.