Abstract

O desenvolvimento de tumores requer angiogênese e anti-angiogénicos terapias foram introduzidas no tratamento de cancro. Neste contexto, proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs) surgem como alvos interessantes, devido à sua função como co-receptores dos principais fatores, pró-angiogénicos. Deste modo, os estudos anteriores sugeriram que os efeitos anti-tumorais de heparina,

i.e.

sobre-sulfatado SH, e diversos miméticos de heparina.; No entanto, uma desvantagem significativa é o seu mecanismo não específico de ação e efeitos colaterais potencialmente graves relacionados às suas propriedades anticoagulantes. Aqui, temos explorado o uso de anticorpos humanos ScFv anti-HS (αHS) como uma abordagem mais racional para segmentar função HSPG em células endoteliais (ECs). αHS foram inicialmente selecionados para o seu reconhecimento de epítopos do SH localizada preferencialmente para a vasculatura de tumores de glioblastoma paciente,

i.

tumores cerebrais altamente angiogénicos. Inesperadamente, descobrimos que essas αHS exibiu efeitos pró-angiogénicos potentes em ECs humanos primários. αHS foram mostrados para estimular a diferenciação CE, que foi associado com o aumento da formação do tubo CE e proliferação. Além disso, αHS suportado sobrevivência CE sob hipóxia e inanição,

i.

Condições típicas do microambiente do tumor. É importante ressaltar que a proliferação αHS mediada foi eficientemente contra-atuado pela heparina e estava ausente em células mutantes HSPG deficientes, confirmando efeitos-HS específicos. A um nível mecanístico, a ligação de αHS para HSPGs de ECs, bem como células de glioblastoma foi encontrado para desencadear de sinalização dependentes de p38 MAPK resultando num aumento da proliferação. Conclui-se que vários αHS que reconhecem epítopos SH abundantes na vasculatura do tumor pode provocar uma resposta pró-angiogênico, o que tem implicações para o desenvolvimento de segmentação baseada em anticorpos de HSPGs no câncer

Citation:. Christianson HC, van Kuppevelt TH, Belting M (2012) células ScFv Anti-sulfato de heparano Anticorpos inesperadamente Activate endotelial e câncer através de p38 MAPK: Implicações para a segmentação baseada em Antibody de sulfato de heparano proteoglicanos no câncer. PLoS ONE 7 (11): e49092. doi: 10.1371 /journal.pone.0049092

editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Agosto, 2012; Aceito: 08 de outubro de 2012; Publicação: 09 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Christianson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Fundo de Câncer Sueco; Conselho de Pesquisa sueco; Sociedade Sueca de Medicina; Sociedade fisiográficos, Lund; as Fundações Gunnar Nilsson, Lundgren e Kamprad; os fundos de doação Hospital Universitário de Skåne; eo financiamento Governamental de investigação clínica nos serviços de saúde nacionais (ALF). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a progressão de transformação maligna em desenvolvimento do tumor manifesto exige o recrutamento de vasos sanguíneos,

ou seja

o interruptor angiogênico [1], [2]. A angiogénese é um processo multi-passo dependente do endotélio (CE) a proliferação, a migração para o tecido circundante e, finalmente diferenciação para um novo vaso. A ligação de vários fatores angiogênicos,

por exemplo

VEGF-A, FGF, e HB-EGF ao sulfato de heparan (HS) cadeias de polissacarídeos sublinha a importância de proteoglicanos do SH (PGs) em biologia CE [3] – [5] . HSPGs actuar como co-receptores que apresentam factores de crescimento para a sua tirosina-quinase de elevada afinidade de sinalização de receptores na superfície da célula [6], [7]. modificações postsynthetic extensas das cadeias SH lineares, compostas de unidades de dissacárido do ácido glucurónico repetitivo N-acetilglucosamina e, incluem sulfatação em várias posições ao longo da cadeia, o que resulta em domínios de carga negativa que proporcionam locais de ligação para vários factores de crescimento, proteases e citoquinas envolvidas na o desenvolvimento do tumor [3] – [7]. Por conseguinte, os embriões de rato modificado para expressar um polipéptido VEGF-A falta a sequência HS-ligação exibiram uma diminuição da formação de ramo capilar [8], e os modelos de ratos transgénicos com qualquer uma deleção homozigótica do motivo HS-obrigatório em PDGF-BB ou reduzida HS sulfatação, exibido recrutamento pericyte defeituoso e obscurecido anatomia microvascular [9], [10]. expressão alterada de enzimas reguladoras envolvidas na formação da estrutura fina das cadeias do SH têm sido implicados no cancro,

por exemplo

hipermetilação gene silenciamento gênico mediado de 3-O sulfotransferase e HSulf-1 foi encontrado em vários tipos de câncer [11], e HSulf-2 sobre a expressão correlacionada com o aumento da angiogênese e fator de crescimento de capacidade de ligação no cancro da mama [12]. Além disso, heparanase HS-degradantes tem sido associada com a progressão do tumor e os resultados pobres paciente através de remodelação do microambiente do tumor [13]. HSPGs ter sido implicada em vários aspectos do desenvolvimento tumoral e angiogénese; No entanto, o papel de HSPG como um alvo do tratamento anti-angiogénese continua a ser definida. Na verdade, várias estratégias têm sido exploradas de modo a alcançar este objectivo, o mais importante dos HS imitam a heparina e seus derivados [14] – [18]. As principais desvantagens com estes compostos são os seus modos inespecíficos relativas de segmentação e riscos significativos de complicações hemorrágicas relacionadas com as suas actividades anticoagulantes. Outros tratamentos possíveis alvo-SH para a terapia do cancro envolvem proteínas ou péptidos com resíduos de aminoácidos carregados positivamente que actuam como inibidores competitivos do factor de crescimento que se ligam a cadeias SH [19].

terapia à base de anticorpo é uma das mais rápido crescentes áreas terapêuticas em oncologia médica e anticorpos dirigidos contra VEGF, o receptor do factor de crescimento epidérmico 2 (HER-2), receptor de EGF ou CD20 ter sido aprovado para o tratamento de

por exemplo

mama metastático e cancro colo-rectal e agressivo B- linfomas de células [20]. anticorpos recombinantes mais pequenas, como anticorpos de cadeia simples variável de fragmento (ScFv) são opções interessantes de direccionamento melhorado devido à sua farmacocinética favoráveis ​​[21] – [23]. Curiosamente, van Kuppevelt e co-trabalhadores anteriormente descrito o desenvolvimento e a caracterização de várias epitopo específico, derivado de apresentação de fagos, ScFv αHS para sondar a diversidade estrutural das cadeias de SH em vários tecidos [24], [25]. No presente estudo, procurou-se identificar αHS ScFv que reconhecem epitopos SH expressos na vasculatura dos tumores de glioblastoma paciente, e investigado o uso desses αHS como uma estratégia putativo para inibir vários aspectos da função CE.

resultados

identificação de clones αHS que reconhecem HS epítopos do tumor Vasculature

inicialmente procurou-se identificar αHS clones com especificidades epitopo conhecido (Tabela 1) [26] que pode reconhecer o nicho vascular tumores de glioblastoma paciente. Este tipo de tumor foi escolhido com base nas suas características fenotípicas bem conhecidos da angiogénese induzida por hipoxia manifestados por hiperplasia CE profunda [27]. Como mostrado na Fig. 1A-D, três αHS clones separados (AO4B08, EV3C3 e HS4E4) preferencialmente coradas para HS epitopos localizada na vasculatura do tumor,

ou seja

αHS mostrou co-localização com a forte marcadores CE fator de von Willebrand (vWF) e integrina avp3, sendo este último um conhecido marcador de endotélio activado [28]. SH epitopos reconhecidos pelo mesmo conjunto de anticorpos αHS foram encontrados para ser expressa também em células endoteliais primárias humanas (HUVEC) (Fig. S1A-C). A especificidade do αHS para HS

in vitro

foi mostrado por acentuadamente reduzida ligação a ECs após o tratamento com liase heparanase que enzimaticamente degrada HS (Fig. S1D). A especificidade do αHS para HS também era verdade

in vivo

em secções de tumor glioblastoma de xenotransplante, como tratamento heparanase resultou em uma perda completa de coloração αHS (Fig. 1E, o painel superior direito). A seguir, realizada colorações com um anticorpo (3G10), que é conhecido por reconhecer especificamente a proteína de núcleo HSPG com um topo HS remanescente após o tratamento com heparanase, mas que não reconhece tanto cadeias SH livres ou HSPG intactas [29]. secções de tumores não tratados não mostraram coloração com 3G10 (Fig. 1E, painel inferior esquerdo), enquanto secções de tumor tratados com heparanase exibido positividade substancial para o epitopo 3G10 predominantemente localizados em estruturas de navios-like que se assemelhava muito as αHS coloração padrão (cf. Fig. 1E, painel inferior direito e no painel superior esquerdo). Juntos, esses estudos identificar vários αHS clones que reconhecem epítopos SH associados com HSPGs intactas abundantes no nicho vascular de tumores de glioblastoma.

, secções de tumor glioblastoma pacientes foram coradas para HS utilizando os anticorpos αHS AO4B08 (A e D) , EV3C3 (B) ou HS4E4 (C) (verde) e para o vWF (a-C, marcador endotelial; vermelho) ou a integrina avp3 (D, marcador de endotélio activado; vermelho), e analisadas por microscopia de fluorescência. co-forte associação entre epítopos do SH e vasculatura do tumor é indicada por imagens fundidas (A-D, painéis à direita; amarelo). As imagens mostradas são representativas de três tumores diferentes e, pelo menos, cinco secções por tumor, e foram obtidos a 20 × ampliação. Barra de escala, 50? M. E, painéis superiores: Especificidade de αHS foi avaliada por coloração AO4B08 de secções de tumores de xenoenxerto de U-87 MG de glioblastoma, quer após nenhum tratamento (Ctrl) ou pré-tratamento com heparinase III liase (HS-liase) para digerir HS. painéis inferiores: anticorpo 3G10 foi utilizado para detectar tocos SH de HSPGs que permanecem após a digestão HS liase. Expecedly, 3G10 coloração não era detectável em secções de tumores não tratados com HS intacta (Ctrl, painel esquerdo); No entanto, a coloração de 3G10 SH liase tratados espécimes (painel direito) mostra um recipiente como o teste padrão que se assemelha largamente a coloração AO4B08 (painel superior esquerdo). Scale bar, 20 mM

Efeitos funcionais de αHS na Primária ECs Humano

Com base na hipótese de que HSPGs são alvos adequados para tratamento anti-angiogênico [3]. – [10], [13] – [18] a seguir, realizada uma série de estudos funcionais com CEPs primárias humanas. Consistente com um papel de HSPGs em função CE, a heparina mimético HS marcadamente reduzida proliferação de CE de uma maneira dose-dependente (Fig. 2A). O mesmo era verdade para o baixo peso molecular heparina composto peso tinzaparina (Fig. 2B), que é um anticoagulante amplamente utilizado e que está atualmente sob investigação por sua tumor efeitos em pacientes com câncer de pulmão inibindo (https://clinicaltrials.gov/ct2/? mostrar /NCT00475098 prazo = tinzaparincancer . Terminou = 7)

, as HUVECs foram cultivadas em meio sem soro na presença das concentrações indicadas de heparina (a) ou a heparina de baixo peso molecular, tinzaparina (B ). A proliferação celular foi determinada por medição da incorporadas [

3H] timidina durante um período de 48 h. C, células HUVEC foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência (Ctrl) ou na presença de AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) durante 72 h. A morfologia celular foi visualizado por coloração com violeta de cristal, e capturados usando um microscópio óptico invertido equipado com uma câmara digital. Esquerda e meados painéis mostram imagens representativas de um fenótipo CE alongado em αHS-tratados, em comparação com células de controlo. O painel direito mostra a análise quantitativa da extensão de células individuais em três campos microscópicos separados por poço (n = 4), utilizando o software Image J.. D, células HUVEC foram cultivadas em matrigel,

ie

uma matriz extracelular derivada de tumor, em meio isento de soro, na ausência (Ctrl) ou na presença de AO4B08 (αHS; 3 ug /ml) e foram deixados a formar tubos durante aproximadamente 20 h. À esquerda e meados painéis mostram imagens representativas de aumento da formação de tubo em αHS-tratados, em comparação com células de controlo a partir de pelo menos três experiências independentes. O painel direito mostra a análise quantitativa do número de tubos intactas a partir das três campos microscópicos por poço (n = 4) utilizando o software Image J.. E e F, αHS estimula a proliferação de CE: HUVEC foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência ou presença de AO4B08 (αHS) nas concentrações indicadas e avaliados quanto à proliferação por [

3H] timidina durante um período de 3 h. F, HUVEC foram submetidas a análise de fases do ciclo celular após 6 h sem (Ctrl) ou com tratamento AO4B08 (αHS). Fracção de células na respectiva fase do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo após coloração nuclear com o iodeto de propídio. Os dados são apresentados como a média ± S.D. * Estatisticamente diferente de não tratada Ctrl, P . 0,05

Uma desvantagem significativa com heparinas é o seu mecanismo não específico de ação e efeitos adversos potencialmente graves. Assim, decidimos explorar a possibilidade de segmentação baseada em anticorpos da HS como estratégia anti-angiogênico mais específica e racional, inicialmente estudando um dos αHS previamente selecionados,

i.

AO4B08, em função CE. AO4B08 ECs tratadas exibida uma morfologia alongada, com um aumento de aproximadamente 75% das células de comprimento significativo, em comparação com células não tratadas (Fig. 2C). alongamento CE é conhecida por estar associada com um tubo de formação e brotação CE fenótipo [30]. Por conseguinte, AO4B08 foi encontrada para promover a formação do tubo de 2 vezes, em comparação com células de controlo (Fig. 2D). Além disso, foi encontrado αHS para aumentar substancialmente a proliferação de CE de uma forma dependente da dose com uma estimulação máxima de cerca de 3,5 vezes, em comparação com o controlo (Fig. 2E). Notavelmente, AO4B08 estimulação da proliferação mediada CE foi demonstrado já em 3 h de tratamento, o que sugere uma resposta relativamente rápida. O efeito sobre a proliferação de AO4B08 CE foi mantido após 24 h de tratamento AO4B08 (Fig. S2). Estimulação da proliferação CE por AO4B08 foi ainda apoiada por um aumento da fração de células em fase S, e uma correspondente redução do G1-fase na AO4B08 tratados, em comparação com células de controlo (Fig. 2F).

αHS Protege primário ECs humano de hipoxia e fome associada à célula-morte

a hipóxia e a deficiência de nutriente são características do microambiente do tumor [31], e como hipóxia foi mostrado para modular a composição SH da superfície celular das células endoteliais em um aumento da capacidade de ligação do factor de crescimento [32], nós concluímos que o bloqueio mediada por anticorpo de HS pode sensibilizar células endoteliais no contexto da hipoxia e fome. Para este fim, células endoteliais foram cultivadas a hipoxia (1% de O

2) na presença ou ausência de AO4B08, e avaliadas quanto a apoptose por análise de caspases clivada. privação de soro de ECs de hipóxia induzida caspase 3 e 7 de ativação em ECs e, curiosamente, a clivagem caspase foi eficientemente contra-atuado por tratamento AO4B08 (Fig. 3A). Em mais apoio destes dados, AO4B08 mostrou aumentar significativamente o número de células endoteliais viáveis ​​a hipóxica e condições de soro deficiente (Fig. 3B). Ao todo, os dados anteriores sugerem que um αHS mostrado para reconhecer estruturas SH vasculatura residente tumorais podem exercer efeitos pró-angiogénicos em ECs.

, HUVECs foram cultivadas durante 72 horas em meio completo (10% FBS), soro forma livre, ou em meio isento de soro suplementado com AO4B08 (αHS; 3 ug /mL), como indicado, em condições de hipoxia (1% de O

2). Os lisados ​​celulares foram analisados ​​quanto à total e caspase-3 clivada e 7, bem como α-tubulina por imunotransferência. O painel superior mostra imunoblots representativos de três experiências independentes. Os painéis inferiores mostram quantificação dos rácios de caspase caspase /total a partir de uma experiência representativa. B, células HUVEC foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência (Ctrl) ou na presença de AO4B08 (αHS; 3 ug /ml) sob condições hipóxicas durante 72 h, e, em seguida, coradas com violeta de cristal. O painel esquerdo mostra imagens representativas de células coradas. painéis da direita mostra a análise quantitativa de células viáveis. Os dados são apresentados como a média ± D.P.. * Estatisticamente diferente de não tratada Ctrl, P . 0,05

Estimulação

αHS mediada por células é específico para HS, mas não é HS epitopo ou célula específica

A seguir, investigou a especificidade do funcional efeitos de αHS. estimulação da proliferação de CE AO4B08 apareceu estritamente dependente HS ligação como indicado pela reversão eficiente por heparina de uma forma dependente da dose (Fig. 4A). Já na concentração de heparina mais baixa utilizada (10 ug /ml), cerca de 75% da proliferação AO4B08-dependente foi inibida, e a 100 ug /ml, o efeito foi completamente revogada (Fig. 4A). Importante, descobrimos ainda que αHS adicionais clones mostrou reconhecer a vasculatura do tumor glioblastoma, HS4E4 e EV3C3 (Fig. 1), também estimulou a proliferação de CE, e que este efeito foi eficientemente contra-actuado pela heparina (Fig. 4C). Deve notar-se que nas experiências de proliferação mostrados na Fig. 2A, as células foram tratadas com heparina durante 48 h, enquanto que nas experiências de inversão αHS células foram incubadas com heparina apenas por 3 h (fig. 4A e C). Importante, várias variantes de CS,

i.

Um glicosaminoglicano de perto relacionada à heparina, não foi capaz de inverter o efeito estimulador da αHS (Fig. 4B). Além disso, sob estas condições, de ligação à heparina (10 ug /ml) da superfície celular αHS eficientemente inibidos (Fig. S3B). Embora, estes resultados indicam que os efeitos mediados αHS sobre a proliferação de CE são HS específico, mas não se restringe a um epitopo HS específico, o efeito estimulador foi mais pronunciada para EV3C3 seguido por AO4B08 e HS4E4 (Fig. 4C). Estes resultados parecem correlacionar-se com a abundância de superfície celular do epitopo respectivos αHS,

i.e.

ECs αHS ligado preferencialmente na ordem EV3C3 . AO4B08 HS4E4 (Fig S3A.). Além disso, o efeito dos vários clones αHS pareceu não estar directamente ligada à distribuição celular do respectivo epítopo, como AO4B08 e HS4E4 colorações apresentado um padrão semelhante ao longo da periferia da célula, ao passo que EV3C3 mostrou uma coloração mais difusa com o aumento da densidade em direcção ao região perinuclear (Figura S1A-C.)

a, as HUVECs foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência (barras brancas) ou a presença de AO4B08 (barras pretas; 1,25 ug /ml). e com o indicado concentração de heparina durante 3 h e avaliados quanto à proliferação celular pela [

3H] ensaio de incorporação de timidina. * Estatisticamente diferente do controlo não tratado, P 0,05; # Estatisticamente diferente a partir de AO4B08-tratada, P 0,05. As células de controlo foram incubadas sem o anticorpo. B, células HUVEC foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência (barras brancas) ou a presença de AO4B08 (barras pretas; 1,25 ug /ml) sem (Ctrl) ou com CS-6, CS4, ou CS-0 (10 ug /mL), como indicado. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de incorporação de timidina [3H

]. * Estatisticamente diferente do controlo não tratado, P 0,05. C, células HUVEC foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência (barras a branco) ou na presença de heparina (barras pretas; 10 ug /ml) com ou sem os diferentes αHS clones de anticorpos (1,25 ug /mL), como indicado. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de incorporação de timidina [3H

]. * Estatisticamente diferente do controlo não tratado, P 0,05; # Estatisticamente diferente a partir de αHS-tratados, P 0,05. D, tipo selvagem (CHO-K1) e células PG- (PgsA-745), as células de CHO deficiente foram cultivadas em meio isento de soro, na ausência ou na presença de diferentes αHS clones de anticorpos (1,25 ug /mL), como indicado. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de incorporação de timidina [3H

]. * Estatisticamente diferente do controlo não tratado, P 0,05; # Estatisticamente diferente a partir de células CHO-K1 αHS-tratados, P 0,05. E e F, artéria umbilical humano ECS (HUAECs; E) e células U-87 MG de glioblastoma (F) foram cultivadas em meio sem soro na presença de AO4B08 (αHS) nas concentrações indicadas e a proliferação foi determinada pela [

ensaio 3H] timidina. * Estatisticamente diferente de controle sem tratamento, P . 0,05

A especificidade do αHS ea dependência de HSPG por seus efeitos estimulantes foram próxima investigada utilizando tipo selvagem (CHO-K1) e mutante (pgsA- 745), células CHO geneticamente deficientes em transferase da xilosil (XT). XT catalisa o primeiro passo na montagem HSPG,

i

. a ligação de xilose em resíduos de serina específicos na proteína do núcleo PG. células PgsA expressar aproximadamente 5% HSPG em comparação com as células de tipo selvagem [33]. O tratamento de células CHO-K1 com AO4B08, EV3C3 bem como HS4E4 resultou em um aumento de quase duas vezes na proliferação, que mostra que os efeitos estimuladores de αHS não foram restritas a células HUVEC (Fig. 4D). Esta ideia foi reforçado pela verificação de que αHS induzida a proliferação de células endoteliais da artéria umbilical humana (HUAEC),

ie

outra fonte de células endoteliais primárias humanas, bem como a linha celular de glioblastoma humano U-87 MG num dose-dependente maneira e na mesma extensão como em HUVECs (Fig. 4E e F). Importante, as células mutantes deficientes PGHS-se que não responde a todos os αHS estudados (Fig. 4D), fornecendo a evidência genética de que αHS mediada por activação da proliferação das células requer função SH imperturbável.

Estimulação

αHS Dependente da Proliferação envolve p38 MAPK sinalização Ativação

a seguir, queria elucidar se αHS induzidas a proliferação de células envolveu uma via de sinalização específica. Utilizando uma matriz de tirosina quinase receptor específico da fosforilação, descobrimos que o tratamento αHS não activar os receptores de factores de crescimento de ligação SH conhecidos,

ie

FGFs, PDGFs, e VEGF, em comparação com o não tratado ECS (Fig. 5A ). Estes resultados sugerem que o mecanismo de estimulação αHS-mediada de células endoteliais não é devido um efeito de imitação directa de ligandos de HS-ligação. Curiosamente, usando uma matriz de quinase específicos de fosforilação, tratamento αHS foi encontrada para induzir de forma significativa a fosforilação da MAPK p38 (aproximadamente 2,5 vezes) em comparação com o não tratado ECS (Fig. 5B). Os dados de matriz foram confirmados por transferência de Western, que mostra dependente do tempo e da indução transiente da MAPK p38 por p-αHS (Fig. 5C). Além disso, a fosforilação de CREB, um alvo a jusante de p38 MAPK conhecido [34], pareceu ser aumentada mediante tratamento αHS (em aproximadamente 35% quando comparado com o controlo) (Fig. 5B). No entanto, a fosforilação da MAPK outro amplamente implicado na sinalização da proliferação, regulada por sinal extracelular cinase 1/2 (ERK1 /2), não foi afectada pelo tratamento αHS (Fig. 5B). O efeito de αHS sobre a activação de sinalização de p38 MAPK pareceu ser um fenómeno mais geral, como uma resposta semelhante foi encontrado em células endoteliais microvasculares isolados de rato pulmão (Fig. 5D) [35], bem como em células U-87 MG de glioblastoma (fig . S4A)

HUVEC foram incubadas em meio isento de soro com ou sem αHS (AO4B08;. 1,5 ug /ml) durante 5, 15, 45, e 60 min, e as proteínas fosforiladas de tirosina quinase do receptor foram determinadas na reunidas Os lisados ​​celulares de tirosina-cinase do receptor análise de matriz de anticorpo anti-fosfo humano, tal como descrito sob

Métodos

. São mostrados os imunoblots representativos de duas experiências independentes. áreas indicadas mostrar FGFR, coluna 1: FGFR1; 2: FGFR2; 3: FGFR3; 4: FGFR4. PDGFR, coluna 1: PDGFRα; 2: PDGFRβ; 3: SCFR; 4: Flt3. VEGFR, coluna 1: VEGFR1; 2: VEGFR2; 3: FCEVR3. B, células HUVEC foram incubadas em meio isento de soro com ou sem αHS (EV3C3; 1,5 ug /ml) durante 5, 15, 45, e 60 min, e as proteínas quinase fosforilada foi determinado em lisados ​​de células agrupados pela matriz de anticorpo-quinase anti-fosfo humano a análise, conforme descrito em

Métodos

. painéis da esquerda mostram imunoblots representativos de três experiências independentes. painel direito mostra a quantificação da MAPK p-p38, p-CREB e p-ERK1 /2 níveis nas várias condições, apresentado como intensidades relativas

vs. matriz de referência

(caixa vermelha). C, células HUVEC foram ou não tratados (Ctrl) ou incubadas com αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) durante os períodos de tempo indicados, seguido por imunotransf erência para fosfo-MAPK p38, p38 MAPK totais e α-tubulina. O painel esquerdo mostra imunoblots representativos de três experiências separadas. O painel direito mostra a quantificação dos níveis relativos fosfo-p38 MAPK (P-p38 /α-tubulina) de uma experiência representativa. D, na mesma experiência como (C) foi realizada com microvasculares de pulmão do rato ECs, que mostra a indução de p38 comparável fosforilação da MAPK por αHS como em células HUVEC. E-F, a proliferação induzida αHS-depende de p38 MAPK. A proliferação foi determinada por [

3H] timidina no rato ECS (E) e células U-87 MG de glioblastoma (F) a seguir ao tratamento com o SB203580 inibidor de p38 MAPK (1? M) e /ou αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) durante 3 h, como indicado. proliferação de células basais não foi significativamente afetada pela inibição p38 MAPK enquanto proliferação αHS induzida foi quase completamente revertidas. * Estatisticamente diferente do controlo não tratado, P 0,05; # Estatisticamente diferente a partir de αHS-tratados, P . 0,05

Vários factores de crescimento, talvez mais importante pró-angiogénico FGF, VEGF, PDGF e foram encontrados para desencadear a activação de p38 MAPK em certos tipos de células [ ,,,0],36]. Nós portanto, realizaram uma série de angiogénese e a tirosina quinase do receptor de fosforilação experiências matriz de anticorpo para elucidar se os efeitos estimuladores de células e activação de p38 MAPK por αHS pode ser secundária à indução de factores de crescimento específicos e seus respectivos receptores de sinalização. No entanto, fomos incapazes de encontrar uma indução significativa por αHS qualquer um destes factores de crescimento ou seus receptores (dados não mostrados). Para estudar directamente a importância funcional de sinalização MAPK p38 na proliferação mediada por αHS, foi utilizado o inibidor de p38 MAPK bem estabelecida SB203580 [34], [37]. Como era de esperar, o inibidor eficientemente contra-actuado activação de p38 MAPK em células HUVEC (Fig. S4B), e soro reduzida, bem como a activação de p38 MAPK a jusante de CREB alvo (Fig. S4C) αHS-mediadas. SB203580 foi demonstrado inibir a basal p-CREB (Fig. S4C) e proliferação em células HUVEC não estimuladas (dados não mostrados), mas não em células endoteliais de ratinho e células U-87 MG de glioblastoma (fig. 5E e F),

ou seja

novos estudos foram realizados nos últimos tipos de células. Curiosamente, a proliferação induzida αHS-rato de ECs (Fig. 5E), bem como células de glioblastoma (fig. 5f) foi eficientemente atenuada pela inibição de p38 MAPK. Em conjunto, estes dados indicam que a ligação de αHS aos HSPGs da superfície celular de células endoteliais, bem como células de glioblastoma desencadeia uma via de sinalização dependente de p38 MAPK resultando num aumento da proliferação.

Discussão

tumoral base de anticorpos direccionamento vascular para o tratamento do cancro baseia-se no facto de que os tumores requerem a angiogénese, a fim de expandir e metástase, e que a ECS enfrentar o lúmen dos vasos sanguíneos e, assim, são relativamente acessíveis para terapia sistémica. A lógica de terapia anti-tumoral PGHS-dirigida é a possibilidade de angiogénese tumoral multi-direccionamento de algumas proteínas pró-angiogénicos chave, mais importante do VEGF-A, FGFs, HB-EGF, PDGF, e IL-8, o que pode promover simultânea de uma forma parcialmente redundante com implicações para a resistência ao tratamento. No presente estudo, foram identificados vários clones αHS que reconhecem epitopos SH abundantemente expressos na vasculatura dos tumores de glioma maligno. Inesperadamente, descobrimos que essas αHS estimular a vários aspectos da função CE,

i.

Diferenciação, a formação do tubo, proliferação e resistência à hipóxia e inanição de morte celular dependente. Nós fornecemos evidências de que esses efeitos são especialmente dependentes αHS de ligação, e não estão relacionados com interações inespecíficas. Mais importante, os efeitos estimuladores pareceu envolver vários epitopos SH, como AO4B08, EV3C3, bem como todos HS4E4 exibido actividade estimuladora, o qual pareceu ser directamente correlacionada com a sua respectiva abundância de superfície celular em células endoteliais. Além disso, a estimulação induzida por αHS foi encontrada em três tipos diferentes de células endoteliais primárias,

ie

HUVECs, HUAECs, e microvasculares de pulmão do rato ECs, bem como em células CHO transformadas e células U-87 MG de glioblastoma humano, sugerindo . que nossos resultados têm relevância mais geral

estudos anteriores corroboram a noção de HSPG como um alvo relevante da terapia do cancro [7] – [18]. Estas estratégias têm sido principalmente focados em heparina, os seus derivados, e outros compostos polianiónicos, tais como suramina [18]. Outras estratégias para interferir com a função HSPG incluem falsos substratos para HS biossíntese,

i.

Xylosides [38], a inibição de enzimas HS-degradantes [39], e a manipulação genética da maquinaria biossintética HS [40]. Os efeitos inibitórios demonstrado destes compostos pode ser explicada principalmente por bloqueio competitivo directo de interacções ligando-HSPG atenuando, assim, a jusante do receptor de activação (compostos polianiónicos) de sinalização, ou por modular a disponibilidade biológica de HSPGs para a ligação do ligando (xylosides, enzimas, genética estratégias). Curiosamente, os nossos dados indicam que o efeito dominante de ligação de anticorpo a HSPGs celulares é promover directamente a activação de células, em vez de bloquear a activação das células dependentes do ligando HS. A um nível mecanístico, a ligação de αHS para HSPGs de ECs, bem como células de glioblastoma foi encontrado para desencadear de sinalização dependentes de p38 MAPK e a função de p38 MAPK imperturbável foi necessário para a estimulação de células mediada αHS. Neste contexto, é de notar que outros ligandos de ligação SH foram mostrados para estimular células endoteliais através da via da MAPK p38 [41]. Esta quinase intracelular foi inicialmente identificada como um importante mediador pró-inflamatório e foi encontrado mais tarde para ser envolvido em vários processos celulares e em doenças, incluindo o cancro [36]. Na verdade, a p38 MAPK tem sido implicado como um supressor de processos malignos,

por exemplo.

Senescência celular mediada pelo oncogene e inibição de contacto. Outros estudos, no entanto, têm mostrado efeitos pró-migratórias e invasivos de activação p38 MAPK em células cancerosas e células estromais [36]. Como outras MAPKs, as funções de p38 são dependentes suas quinases a jusante, incluindo cinases serina /treonina, tais como regulado por p38 /cinase activada (PRAK) e activou-MAPK muitas cinases a montante diferentes quinase-2, e, tal como MKK3 /6, MKK4, bem como sinais independentes MAPKK. específicos de células, bem como efeitos específicos de localização subcelular aumentam a complexidade da função de p38. No contexto da angiogénese do tumor é de particular interesse que a p38 foi recentemente demonstrado para activar células endoteliais de tumores através PRAK [42]. Estudos futuros terão de esclarecer se PRAK e que alternativa p38 a jusante mecanismos de sinalização estão envolvidos em efeitos pró-angiogénicos αHS-mediados. Além disso, os nossos estudos foram limitados às quinases detectados pela matriz de anticorpo,

ie

outras quinases não incluído na matriz pode ser activado por αHS além de p38.

A superfície da célula-dominante