Sumário

TAE226, um composto bis-anilino pirimidina, tem sido desenvolvido como um inibidor da quinase de adesão focal (FAK) e receptor de factor de crescimento I semelhante à insulina (IGF-IR). Neste estudo, nós investigamos o efeito de TAE226 sobre o câncer de pulmão de pequenas células não-(NSCLC), com especial incidência sobre o

estado mutacional EGFR

. TAE226 foi mais eficaz contra as células com o EGFR mutante, incluindo o mutante T790M, do que contra as células do tipo selvagem com uma. TAE226 preferencialmente inibidas seus mediadores de sinalização a jusante fosfo-EGFR e nas células com o EGFR mutante do que naqueles com um tipo selvagem. A fosforilação de FAK e o IGF-IR não foi inibida na concentração em que a proliferação de

EGFR

-mutant células foi inibida. Os resultados do

In vitro

ensaio de ligação indicaram diferenças significativas na afinidade para TAE226 entre o tipo selvagem e L858R (ou delE746_A750) mutante, e a reduzida afinidade de ATP para o L858R (ou delE746_A750) resultou em mutante boa capacidade de resposta do L858R (ou delE746_A750) células mutantes para TAE226. De interesse, o L858R /T790M ou delE746_A750 mutante /T790M reforçada a afinidade de ligação para TAE226 comparação com o L858R ou delE746_A750 mutante, resultando na eficácia da TAE226 contra células mutantes T790M apesar da mutação T790M restaurar a afinidade ATP para o EGFR mutante perto que para a de tipo selvagem. TAE226 também apresentaram maior afinidade de cerca de 15 vezes para o mutante L858R /T790M do que para a de tipo selvagem por análise de uma interacção cinética. O efeito anti-tumoral contra o

EGFR

tumores -mutant incluindo mutação T790M foi confirmado em modelos de rato, sem qualquer toxicidade significativa. Em resumo, nós mostramos que TAE226 inibiu a activação de EGFR mutante e exibiu actividade anti-proliferativa contra CPNPC transportando

EGFR

mutações, incluindo mutação T790M

Citation:. Otani H, Yamamoto H, Takaoka H, Sakaguchi H, J Soh, Jida M, et al. (2015) TAE226, um composto bis-anilino pirimidina, Inibe a EGFR-mutante Kinase Incluindo T790M Mutant para mostrar efeito anti-tumoral em

EGFR

-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0129838. doi: 10.1371 /journal.pone.0129838

Editor do Academic: Pier Giorgio Petronini, Universidade de Parma, Itália

Recebido: 19 Agosto, 2014; Aceito: 13 de maio de 2015; Publicação: 19 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Otani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (número de concessão : 18790993 para ST), https://www.mext.go.jp/english/. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Novartis Pharma AG forneceu apoio sob a forma de salários para os autores SH e EK, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Embora os autores deste manuscrito (SH e EK) são funcionários da Novartis Pharma AG, isso não altera os autores adesão a PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Novartis Pharma AG forneceu apoio sob a forma de salários para os autores SH e EK, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘.

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. O cancro do pulmão é dividida em duas categorias principais histológicos, cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) e cancro do pulmão de células pequenas. Apesar dos grandes esforços para melhorar a sobrevida de pacientes com câncer de pulmão, uma taxa de sobrevivência satisfatória ainda não foi alcançado porque a maioria dos pacientes apresentam um estágio avançado da doença e seus tumores apresentam uma resistência inerente à quimioterapia convencional [2]. Para melhorar o prognóstico de pacientes com câncer de pulmão, muitas investigações clínicas e básicas, incluindo a investigação translacional, foram realizadas [3, 4].

Molecular de metas para a terapia baseada em alterações moleculares no câncer é uma estratégia promissora para o tratamento dos cancros do pulmão, assim como outros tumores malignos. Por exemplo inibidores, 4-anilinoquinazolina, tais como gefitinib e erlotinib, foram concebidos para inibir o domínio de tirosina-quinase de receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), o qual é sobre-expresso em NSCLC; esses inibidores estão actualmente a ser utilizados para o tratamento de NSCLC [5-8]. De particular interesse, estes inibidores EGFR de tirosina-quinase (EGFR-TKI) produzem efeitos drásticos anti-tumorais contra CPNPC transportando comum

EGFR

mutações, pequenas deleções no exão 19 e mutação L858R no exão 21. Além destes EGFR-TKI mutações sensíveis ao, mutação T790M no exão 20 é conhecida como o EGFR-TKI resistente à mutação [9, 10]. Estudos anteriores relataram que comum

EGFR

mutações no domínio de tirosina quinase são mais freqüentes em pacientes com histologia de adenocarcinoma, uma história nunca ter fumado, e um Etnia asiática [11-13]. A frequência de comum

EGFR

mutação no adenocarcinoma, que depende no fundo dos pacientes, varia de 15 a 45%, sugerindo que o comum

EGFR

mutação é um evento frequente e importante de pulmão adenocarcinomas [11, 13, 14]. Em contraste, as mutações T790M inerentes são muito raros [15]. No entanto, as mutações T790M são encontrados em cerca de 50% dos casos entre CPNPC que adquiriram resistência a EGFR-TKI [16].

EGFR-TKI Além segmentação proteína EGFR, vários tipos de compostos de moléculas pequenas têm sido desenvolvidos para alvejar o cancro alterações moleculares espec�icos. TAE226, um composto bis-anilino pirimidina, compete com o ATP para a quinase de adesão focal (FAK) e receptor de factor de crescimento I semelhante à insulina (IGF-IR). Este composto alegadamente inibe a proliferação celular, a migração e a invasão de diversos cancros, tais como gliomas, adenocarcinoma esofágico de Barrett, do ovário, colo-rectal e os cancros da mama [17-22].

FAK é uma tirosina-quinase não receptora que transduz sinais do receptor de integrina e participa em várias funções celulares necessárias para a proliferação celular, sobrevivência, motilidade, invasão e [23]. IGF-IR é um receptor tirosina-quinase transmembrana que participa na cascata de sinalização que conduzem à activação de ambos AKT e cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK) [24]. Estas quinases de tirosina são conhecidos por ser sobre-expressos em muitos tumores malignos, incluindo alguns CPNPC e desempenhar um papel oncogénica em células cancerosas [25-27]. Estes fatos e fundo encorajou-nos a examinar o efeito anti-tumoral de TAE226 em NSCLC, e nós, inesperadamente, que TAE226 inibe preferencialmente a proliferação de

EGFR

-mutant linhas de células NSCLC, incluindo o mutante T790M, em comparação com

EGFR

-wild do tipo linhas de células NSCLC.

neste estudo, descrevemos o efeito anti-tumoral de TAE226 em

EGFR

-mutant células

in vitro

e

in vivo

e investigou o mecanismo anti-tumoral de TAE226 em

EGFR

-mutant células.

Materiais e Métodos

h3> Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade de Okayama (Permit Number: Oku-2007232). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia cetamina e xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Reagentes

NVP-TAE226 foi gentilmente cedido pela Novartis Pharma AG (Basileia, Suíça). ZD1839 (gefitinib) foi gentilmente cedido pela AstraZeneca (Wilmington, DE). A solução estoque destes compostos foi reconstituído respectivamente na concentração de 20 mM e 10 mM com dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e guardada a -20 ° C até ser utilizado para

In vitro

experimentos

os anticorpos

foram utilizados os anticorpos primários para os seguintes proteínas de transferência de western:. policlonal anti-EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), IGF-IRβ, fosfo-IGF -IRβ (Tyr1131), AKT, fosfo-AKT (Ser473), p44 /p42 cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK), e fosfo-p44 /p42 MAPK os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Monoclonal anti-quinase de adesão focal (FAK), anticorpos fosfo-FAK (pY397) foram adquiridos da Biosource (Berkeley, CA), e anticorpo anti-actina, utilizadas como controlos de carga iguais, foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich.

linhas de células e cultura de células

Para avaliar o efeito da TAE226, os seguintes 17 linhas de células NSCLC, linha de células de câncer de uma mama (SK-BR-3), uma linha de células de câncer gástrico (MKN45) e HEK linha de células -293T foram utilizados para

in vitro Comprar e

in vivo

experimentos. HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820, NCI-H1819, NCI-H1666, NCI-H1395, NCI-H2228, NCI-H1648, NCI-H1993, NCI-H838 e NCI-H1299 linhas celulares foram gentilmente cedido pelo Dr. Adi F. Gazdar (University of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Dallas, TX, EUA), que estabeleceu as linhas de células NSCLC com Dr. John D. Minna [28-30], exceto para NCI-H3255, que foi estabelecido pelo Dr. Bruce E. Johnson [11, 31]. Estas linhas celulares foram provados ter origens genéticas individuais pelo sistema PowerPlex 1,2 (Promega, Madison, WI), da Universidade do Texas Southwestern Medical Center em Dallas, antes que obteve estas linhas de células [29]. (Número de catálogo: 37012) PC-9 foi adquirido da Immuno-Biological Laboratories (Takasaki, Japão). MKN45 (número de catálogo: JCRB0254) foi adquirida da coleção japonesa dos recursos biológicos de Pesquisa Cell Bank, National Institute of Biomedical Inovação (Ibaraki, Japão). SK-BR-3 (número de catálogo: HTB-30), A549 (número de catálogo: CCL-185), Calu-3 (número de catálogo: HTB-55) e HEK-293T (número de catálogo: CRL-3216) foram adquiridos a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA). A linha de células PC-9 resistentes a gefitinib (RPC-9) foi criado por um dos autores (K.K.) [32]. PC-9, HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820 e RPC-9 têm mutações EGFR-TKI-sensíveis. Além disso, NCI-H1975, NCI-H820 e RPC-9 linhas celulares também tem T790M mutação resistente ao EGFR-TKI. Os detalhes de uma alteração genética nestas linhas celulares excepto para HCC4006 (delL747_A750, P ins) e NCI-H820 (delE746_E749 /T790M) são mostrados na Tabela 1.

NCI-H3255 foi cultivado em LTA 4 forma [33, 34] suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e as outras linhas celulares de cancro foram mantidas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com FBS a 10%, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). A linha celular HEK-293T foi mantida em meio de Dulbecco modificado de Eagle (Sigma-Aldrich) suplementado com FBS a 10%. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera totalmente humidi ficada de 5% de CO

2 no ar. Todos

in vitro

experimentos foram realizados com cerca de 80% culturas confluentes.

O efeito da TAE226 no IGF-IR depois de soro-inanição

Para avaliar o efeito da TAE226 em IGF-IR sob condição isenta de ligando, analisou-se a fosforilação de RI-FCI induzida após soro-inanição TAE226 seguido por tratamento. Após as linhas de células foram de três horas e tratou-se com o aumento da concentração de TAE226 durante duas horas privadas de soro, que foram estimuladas por 100 ng /ml de IGF-I recombinante (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos e depois foram analisados ​​por transferência de Western.

Determinação da sensibilidade à droga TAE226 e gefitinib em várias linhas celulares

sensibilidade ao fármaco foi determinada por um ensaio MTS modificado com CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI). As células foram semeadas em geral em placas de 96 poços a uma densidade que produziria 80% de confluência com a conclusão da experiência, variando de acordo com cada linha de células de 3.000-4.000 por poço. Depois disso, a forma das cavidades foi substituído com o meio contendo soluções de fármacos diluídos de TAE226 ou gefitinib num intervalo de 4 log ou meio completo, que foram distribuídos em 8-cavidades replicadas. As células foram incubadas na presença de cada concentração de TAE226 durante 48 horas e de gefitinib durante 72 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar. Depois disso, foi adicionado MTS corante a cada cavidade. As culturas foram incubadas durante mais 1 hora a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. As densidades ópticas das amostras foram medidas a 490 nm utilizando Immuno NJ Mini-2300 (Nalge Nunc Internacional KK, Rochester, NY). densidade óptica média para cada concentração da droga foi calculado após descartar os menores valores mais altos e. Os efeitos anti-tumorais de TAE226 e gefitinib para cada linha celular foram apresentadas em termos de concentração inibitória a 50% (IC

50), a qual foi determinada representando graficamente o gráfico da percentagem de inibição do crescimento de células (eixo dos Y) versus concentração de droga (eixo X). IC

50 valores foram expressos como média e desvio padrão. Os ensaios foram repetidos até que o desvio padrão foi menor do que a média.

Western blot análise

As células foram cultivadas em placas de 60 mm durante a noite, e, em seguida, tratada com DMSO ou cada concentração de TAE226 e gefitinib. Em seguida, elas foram lavadas com PBS frio e lisadas em 1 × tampão de lise celular [Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na 1 mM de

2EDTA, EGTA 1 mM, 1% Triton, 2,5 mM pirofosfato de sódio, beta-glicerofosfato a 1 mM, Na 1 mM

3VO

4, 1 ug /mL de leupeptina] (tecnologia de sinalização celular) suplementado com completa, Mini (Roche, Basileia, Suíça) para extrair a proteína. Após a concentração de proteína foi medida, quantidades iguais de proteína total (30 ug) foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. As proteínas de membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários. Foram utilizados os anticorpos secundários seguintes: anti-coelho de cabra anti-rato ou de IgG peroxidase conjugada de rábano silvestre (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para detectar sinais específicos, as membranas foram incubadas por ECL além de transferência de Western reagentes de detecção (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido).

ensaio in vitro da variante domínios EGFR-TK ligação

A capacidade de ligação de TAE 226 para domínios EGFR-TK variante foi examinada com ensaio de ligação

in vitro

. domínios da TK EGFR variante consistiu de tipo selvagem, delE746_A750, L858R, delE746_A750 /T790M, e L858R /T790M. O método detalhado é descrito no Método S1.

A análise cinética interação de TAE226 e gefitinib contra EGFR de tipo selvagem e L858R /T790M EGFR mutante

Para caracterizar o mecanismo da ação de TAE226 em EGFR , foi realizada a análise cinética interacção de TAE226 e gefitinib (como controlo) contra o EGFR de tipo selvagem e L858R /T790M EGFR mutante por Proteros Repórter Deslocamento Ensaio (Proteros biostructures GmbH, Munique, Alemanha), o qual foi utilizado para determinar os parâmetros seguintes: K

d,

k

em

k

off e tempo de residência. O Proteros Repórter Deslocamento ensaio foi realizado como descrito anteriormente [35, 36]. método detalhado foi descrito no Método S1.

Animal xenoenxerto mouse modelo

Neste experimento, foi utilizado BALB /c-nu /nu nu feminino em 4-6 semanas de idade que foram comprados a partir de Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japão). Eles foram mantidos sob condições específicas de cada isentos de agentes patogénicos, de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Animal da Universidade de Okayama. linhas de PC-9 e RPC-9 de células (4,0 x 10

6/100 ul) misturado com 100 ul de Matrigel (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) foram inoculados subcutaneamente em ratinhos nus 24 [4 grupos experimentais (n = 6 em cada grupo), por a concentração de TAE226], que tinha cerca de 20 g de peso corporal. TAE226 foi diluída por metilcelulose na concentração de 0 mg /kg (veículo), 30 mg /kg, 60 mg /kg e 90 mg /kg. Depois de o volume do tumor atingiu 200-400 mm

3, TAE226 foi administrado oralmente a cada ratinho nu uma vez ao dia durante 14 dias em série. De três em três dias, o peso corporal dos ratinhos e o eixo maior e o eixo menor de cada tumor foram medidos e o volume do tumor calculado utilizando a seguinte fórmula; (Eixo maior) x (eixo menor)

2 × 1/2 [37, 38]. Para os 14 dias, o volume do tumor, a taxa de crescimento do tumor e do peso corporal foram analisadas como uma média da cada grupo.

A análise estatística

foi utilizado t

Student para comparar os dados entre os dois grupos. Os dados foram representados como média desvio ± padrão (SD).

P Art 0,05 foi considerado como sendo estatisticamente significativo.

Resultados

Efeito anti-proliferativo das TAE226 em linhas de células NSCLC

Foi avaliado o efeito anti-tumoral de TAE226 usando um ensaio MTS em 15 linhas celulares de NSCLC, uma célula de cancro da mama linha e uma linha celular de cancro gástrico (Tabela 1). Número de ensaios realizados e cada MTS

valor de IC 50 obtidos a partir de ensaios independentes são apresentados na Tabela S2. Três linhas de células NSCLC (PC-9, HCC827, e NCI-H3255), com apenas EGFR-TKI sensível

EGFR

mutações e duas linhas de células NSCLC (RPC-9 e NCI-H1975) com ambos TKI-sensitive e resistente à TKI

EGFR

mutações mostrou IC semelhante

50 valores, que vão 0,086-0,31? M. Em contraste, o IC

50 valores para

EGFR de tipo selvagem

linhas celulares de NSCLC (N = 10: variou 0,28-6,2 uM) foram superiores aos de

EGFR mutante

NSCLC linhas celulares embora dois

BRAF

linhas e células mutantes um

EML4 Restaurant –

ALK

linha de células translocado mostrou nível intermediário de valores de IC 50

(variação de 0,28 a 0,48 uM). Estes resultados sugerem que TAE226 foi mais eficaz na

EGFR

linhas celulares -mutant, independentemente da presença do TKI resistente

EGFR

T790M mutação, que em

EGFR

selvagem -tipo linhas celulares, especialmente que não têm

BRAF

ou

EML4 Restaurant -.

ALK

alterações

Nós também examinou o efeito anti-tumoral de gefitinib contra 14 linhas de células NSCLC (Tabela 1). Três linhas de células NSCLC ancorando única EGFR-TKI sensível

EGFR

mutação foram sensíveis a gefitinib (IC

50 valores foram variou 0,0014-0,0028 mM), enquanto que outras linhagens de células NSCLC abrigar do tipo selvagem

EGFR

(n = 9) ou resistentes-TKI

EGFR

mutação (n = 2) foram resistentes (IC

50 foram variou 5,3-32,6 mM). Estes dados foram consistentes com os dos relatórios anteriores [10, 28].

A desregulamentação da FAK, IGF-IR, e as proteínas relacionadas com o EGFR após o tratamento TAE226 em linhas celulares de NSCLC

Nós investigamos a efeito de TAE226 sobre FAK, IGF-IR, e proteínas relacionadas com EGFR usando 6 (linhas celulares PC-9, HCC827, NCI-H1975, RPC-9, NCI-H1299, NCI-H1819 e). A fosforilação de FAK (Thy397) e o IGF-IR (Tyr1131), que são alvos de TAE226, não foi significativamente inibida até uma concentração de 5 uM em todas as linhas celulares testadas 6 (figura 1). Para FAK, fosforilação foi inibido a uma concentração de 20 uM (dados não apresentados). Para o IGF-IR, a fosforilação foi completamente inibida pelo soro após TAE226-inanição em todas as 4 linhas de células testadas (PC-9, 9-RPC, NCI-H1299, NCI-H1819 e), independentemente da estimulação do ligando (Fig S1). Este resultado indicou que TAE226 inibida fosforilação de IGF-IR como o esperado.

As linhas celulares de NSCLC com mutação do EGFR-TKI-sensível (exão 19 deleções) (PC-9 e HCC827), linhas de células com EGFR tanto -resistentes e TKI-sensível (T790M) mutações (NCI-H1975 e de RPC-9), e linhas de células com EGFR de tipo selvagem (NCI-H1299 e NCI-H1819) foram tratados com TAE226 a várias concentrações e análise de transferência de western foi realizada . As fosforilações de FAK e o IGF-IR não foram abolidos em todas as linhas celulares testadas com NSCLC. Em contraste, os fosfolarização de EGFR e suas proteínas a jusante, AKT e MAPK, foram reprimidas com menor concentração de TAE226 em

EGFR

linhas celulares -mutant independentemente da presença de mutação T790M comparação com

EGFR

linhas de células do tipo -wild. Nós incubadas a membrana para actina (42 kDa) depois incubadas MAPK (42 e 44 kDa) e o buffer de separação foi usado para que a membrana.

De particular interesse, a fosforilação de EGFR foi predominantemente inibido TAE226 por em todos os quatro

EGFR

linhas celulares -mutant (PC-9, HCC827, NCI-H1975, e de RPC-9), independentemente da presença de mutações resistentes a TKI. Além disso, as fosforilações de AKT e MAPK, que são moléculas a jusante de EGFR, foram também inibidas nestas

EGFR

linhas celulares -mutant. Em contraste, as fosforilações de EGFR, AKT e MAPK não foram inibidas em linhas de células com o tipo selvagem

EGFR

(NCI-H1299 e NCI-H1819) (Figura 1). Estes dados sugerem que TAE226 pode ter um efeito mais forte sobre o EGFR mutante de EGFR de tipo selvagem.

confirmou o nível de FAK, p-FAK, o IGF-IR expressão, e p-IGF-IR em linhas celulares sem exposição à droga utilizando dez linhas celulares de NSCLC (

EGFR

linhas celulares -mutant, PC-9, HCC827, NCI-H3255, HCC4006, NCI-H1975, NCI-H820 e RPC-9;

linhas de células do tipo selvagem, NCI-H1819, NCI-H1299 e A549). Não se observou qualquer diferença significativa no nível de cada uma das proteínas de expressão entre as linhas celulares (Fig S2).

Efeito do TAE226 na linha celular HEK-293T transfectadas com o EGFR mutante

Examinámos o efeito anti-proliferativo de TAE226 em duas linhas de células HEK-293T transfectadas de forma estável com o EGFR de tipo selvagem ou mutante de EGFR (L858R) que tinha previamente estabelecida [39]. O HEK-293T com o EGFR mutante foi mais sensível do que o a gefitinib HEK-293T com EGFR de tipo selvagem (IC

50 valores foram de 0,38 ± 0,087 e 18,2 ± 3,9 pM, respectivamente) (Tabela 1). TAE226 exercido um efeito anti-tumoral mais elevada na HEK-293T com o EGFR mutante do que na HEK-293T com o EGFR de tipo selvagem (IC

50 valores foram de 0,41 ± 0,06 e 3,0 ± 0,11 pM, respectivamente) ( Tabela 1). TAE226 inibiu as fosforilações de EGFR e de AKT na célula HEK-293T com o EGFR mutante, mas não na célula HEK-293T com o EGFR de tipo selvagem (Fig S3). Estes resultados também indicaram que TAE226 inibiu o crescimento celular ou sobrevivência de

células -mutant EGFR

por suprimir a proteína EGFR mutante.

A afinidade de ligação de TAE226 ao mutante EGFR

Para avaliar a afinidade de ligação TAE226 para cinases EGFR, foi realizada uma

in vitro

ensaio das cinases variante EGFR (Fig 2) vinculativo. A fracção sobrenadante continha cinase de EGFR que não se ligou ao ATP modificada-grânulo devido a interferência de TAE226 (ou ATP exógeno). A fracção precipitada contida cinase EGFR que tinham ligado a ATP modificada-grânulo, indicando que TAE226 (ou exógeno ATP) não interferir com a ligação do ATP. Assim, a intensidade da banda em cada TAE226 (ou exógeno ATP) concentração reflecte a capacidade de TAE226 (ou exógeno ATP) para competir com o ATP modificada-grânulo para as cinases de EGFR.

A) cinases mutantes de EGFR e B comum ) contendo EGFR T790M cinases mutantes. Os cinco tipos de quinases EGFR, do tipo selvagem, de exão 21 L858R mutação (L858R) ou exão 19 de deleção (delE746_A750), T790M em conjunto com a mutação L858R (L858R /T790M), e T790M em conjunto com delE746_A750 (delE746_A750 /T790M) , que se ligam competitivamente ao ATP ou TAE226, foram extraídos e foram incubados com ATP grânulos-modificados. TAE226 ou o ATP recombinante foi adicionado para competir com ATP grânulos-modificados para a ligação de cinases de EGFR. A quinase EGFR binging com o ATP esferas modificado estava presente na precipitação, eo EGFR ligação com TAE226 (ou ATP recombinante) quinase estava presente no sobrenadante. Western blotting foi realizado para detectar cinases de EGFR em cada componente usando um anticorpo HA. *, Na concentração de 10 uM para o ATP; **, Na concentração de 0,005 uM para TAE226.

Entre as quinases variante de EGFR que foram testados (de tipo selvagem, L858R, delE746_A750, L858R /T790M e delE746_A750 /T790M), não houve diferença na as quantidades de cinases de EGFR que se ligam ao ATP modificada-grânulo foi observado sob a condição de controle (Fig 2A e 2B). ATP exógeno fracamente ligado a cinases de EGFR a uma concentração de 1,000 uM em todas as variantes estudadas (Figura 2A). Em contraste, TAE226 começou a ligar-se a EGFR de tipo selvagem quinase a uma concentração de 0,1 uM e em concentrações mais baixas para os EGFR mutantes, indicando que TAE226 possuem uma maior afinidade para cinases de EGFR do que o ATP. Estimou-se a afinidade de ligação de TAE226 para variantes de EGFR através da comparação do rácio da intensidade da banda semi-quantificados entre a fracção de sobrenadante e a fracção precipitada a 0,1 uM de TAE226 entre os do tipo selvagem, L858R, ou delE746_A750 (Fig S4A). Quantificação utilizando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) mostrou que a afinidade de ligação de TAE226 foi de aproximadamente 7,5 vezes mais elevada para ambos os EGFR mutantes do que a EGFR de tipo selvagem (Fig S4A). O efeito da mutação T790M adquirida na afinidade de ligação para a TAE226 quinases EGFR mutantes comuns (L858R ou delE746_A750) também foi avaliado na concentração de 0,005 uM para TAE226 e 10 uM para o ATP (Fig 2B). Curiosamente, a afinidade de ligação para TAE226 foi maior no T790M contendo EGFR cinases mutantes (L858R /T790M ou delE746_A750 /T790M) do que em EGFR comum cinases mutantes (L858R ou delE746_A750) (S4B Fig).

cinética de interação de TAE226 e gefitinib com EGFR de tipo selvagem e L858R /T790M EGFR mutante

IC

50 e K

d valores para TAE226 e gefitinib contra EGFR de tipo selvagem e L858R /T790M EGFR mutante foram apresentados na Tabela 2. IC

50 e K

d valores para TAE226 foram 0,326 uM e 0,163 uM em EGFR de tipo selvagem, e 0,0193