Abstract

A imunoterapia abordagens utilizando bloqueio checkpoint, por si só, ou em combinação com a vacinação antígeno tumoral, ou célula adotiva transferência, estão a emergir como abordagens promissoras para o tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em preparação para futuras abordagens de imunoterapia combinados em NSCLC, aqui, nós avaliamos as respostas imunitárias espontâneas para Xage-1b, um antigénio específico de tumor do grupo Cancer Testículo Antigen que foi previamente relatado para ser espontaneamente imunogênica na população japonesa, em uma coorte de pacientes caucasianos com NSCLC. Nós encontramos respostas sorológicas espontâneas para Xage-1b em 9% dos pacientes. É importante ressaltar que estas respostas foram limitadas a, e representou 13% do, pacientes com tumores de adenocarcinoma, o subtipo histológico mais frequente, para os quais abordagens de imunoterapia estão em desenvolvimento. Usando um conjunto de péptidos sobrepostos que abrangem toda a proteína Xage-1b, e em apoio aos dados sorológicos, detectamos

+ respostas de células significativa Xage-1b específicos CD4 T em todos os pacientes soropositivos Xage-1b e identificou vários CD4

+ epítopos de células T. Ao todo, os nossos resultados apoiam a relevância do antígeno Xage-1b em pacientes caucasianos com NSCLC com adenocarcinoma, ea implementação de imunoterapias futuros explorando a alta imunogenicidade do antígeno nesta população de doentes

Citation:. Saito K, Nakayama E, Valmori D (2016) respostas imunes ao cancro do testículo Antigen Xage-1b em não pequenas células do câncer pulmonar caucasianos pacientes. PLoS ONE 11 (3): e0150623. doi: 10.1371 /journal.pone.0150623

editor: Takuma Kato, Mie University Graduate School of Medicine, JAPÃO

Recebido: 11 de dezembro de 2015; Aceito: 17 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Saito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (EUA), o Instituto de Pesquisa do Câncer (EUA), Ligue contre le Cancer (França) e Labex IGO (França) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), correspondendo a aproximadamente 85% de todos os casos de câncer de pulmão [1]. Apesar das recentes melhorias em estratégias terapêuticas, NSCLC constitui, portanto, um dos principais problemas de saúde pública. Na maioria dos casos, os sintomas aparecem geralmente em fase avançada da doença, nos estágios avançados metastáticos ou localmente, tornando assim difícil o tratamento de [2]. Após o diagnóstico inicial, estadiamento preciso é crucial para determinar uma terapia apropriada. A ressecção cirúrgica do tumor ainda é o padrão de atendimento, mas, infelizmente, é aplicável e pode ser considerada uma opção consistente e bem sucedida para a cura, apenas em pacientes com tumores ressecáveis ​​e capaz de tolerar a ressecção. No entanto, aproximadamente 70% dos pacientes com cancro do pulmão com presentes localmente avançado ou doença metastática no momento do diagnóstico [2]. Para estes doentes, a primeira linha de tratamento é a quimioterapia à base de platina, que mostrou ser benéfica como tratamento paliativo e representa o padrão de cuidado. A radioterapia também é freqüentemente usado como uma primeira linha de tratamento para NSCLC e administração de quimioterapia concomitante e radiação é indicado para câncer de pulmão em estágio III [2]. No entanto, mesmo com estes tratamentos, as taxas de sobrevida global em pacientes com NSCLC são ainda extremamente baixo, com uma taxa média de 5 anos de sobrevivência de 17% em pacientes com doença precoce e 4% em pacientes com doença metastática [3]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias terapêuticas para induzir respostas clínicas mais eficazes e prolongar a sobrevivência global nesta população de pacientes. Na última década, novos conhecimentos na biologia do câncer, abriu novas abordagens terapêuticas potenciais, incluindo terapias direcionadas e imunoterapias. terapias específicas, tais como aqueles que utilizam inibidores de angiogénese, inibidores do receptor do factor de crescimento da epiderme (EGFRi) ou inibidores da tirosina cinase (TKI) podem ser combinados para as principais modalidades de tratamento em pacientes que apresentavam mutações específicas [4-6]. No entanto, a proporção de doentes que expressam estas mutações é relativamente pequena (por exemplo, apenas 10-15% de NSCLC abrigar mutações de EGFR). Além disso, os efeitos clínicos destes tratamentos não são frequentemente de longa duração, devido ao desenvolvimento de resistência [7,8].

Por outro lado, as estratégias de imunoterapia têm o potencial para reforçar a resposta imunitária do paciente, para induzir respostas clínicas estáveis ​​e prolongar a sobrevivência [1]. Emergentes estratégias imunoterapêuticas são os que utilizam anticorpos específicos de bloqueio de ponto de verificação, que têm demonstrado a eficácia clínica no subgrupo de pacientes. Dados recentes sugerem que estes pacientes respondem são aqueles que abrigam as respostas imunitárias espontâneas para o tumor autólogo. Outras estratégias baseadas em NSCLC imunes incluem a vacinação cancro abordagens utilizando antigénios do cancro /Testis (ATC) [1,9], proteínas codificadas por genes normalmente expressos em células germinativas em testículo e ovário fetal e, em alguns casos, nos trofoblastos da placenta, silenciados em tecidos adultos normais, mas de forma aberrante re-expressos em vários tipos de cancro [10,11]. CTA são largamente expresso em cancros de diferentes subtipos histológicos, são muitas vezes altamente imunogênica e, portanto, são considerados entre os alvos mais atraentes para o desenvolvimento de vacinas contra o câncer [11]. vacinas contra o câncer como monoterapia estão em fase de avaliação em NSCLC e poderia ser eficaz em pacientes com doença residual mínima [9]. Apesar dos primeiros testes clínicos que aplicam este tipo de estratégia não ter cumprido a endpoint clínico [12], combinação de vacinação com terapias de bloqueio de ponto de verificação são muito promissores [1]. No entanto, a utilização destas estratégias requer a identificação de antigénios tumorais específicos expressos por uma fracção significativa de NSCLC, bem como das características dos tumores que os expressam. Vários CTA foram mostrados para ser expresso em NSCLC. Xage-1b é codificada pelo gene Xage-1, localizado na região de Xp11.22 do cromossoma X [13,14]. Quatro variantes de transcritos, Xage-1a a d, foram identificados [14-16]. Um transcrito expresso em tumores, Xage-1b, codifica uma proteína de comprimento 81 aminoácidos [14,17]. Xage-1b foi relatado para ser transcrito predominante expressa em NSCLC. expressão Xage-1b foi observada em 45% dos adenocarcinomas de pacientes japoneses [18]. Xage-1b foi mostrado para induzir respostas de anticorpos e de células T em doentes com NSCLC japoneses. A frequência de resposta de anticorpo foi relatado para ser maior em pacientes de adenocarcinoma (14%) do que em pacientes SCC (2%) [19]. O objetivo deste estudo foi estender estes resultados à população caucasiana, para avaliar o potencial da imunoterapia baseada em Xage-1b em caucasianos.

Materiais e Métodos

amostras dos pacientes e purificação de células

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram coletadas amostras de uma coorte de 141 pacientes com NSCLC (Institut de cancerologie de l’Ouest (OIC), Saint-Herblain, França), após aprovação pelo Conselho de Administração do Institutional Review ICO. PBMC de 60 doadores saudáveis ​​foram obtidos a partir do Etablissement Français du Sang (EFS) Pays de la Loire, após aprovação pelo Conselho de Revisão Institucional do Etablissement Français du Sang Pays de la Loire (Nantes, França). Um termo de consentimento assinado foi obtido de todos os doadores que participaram do estudo. O estudo incluiu 91 adenocarcinomas, 40 carcinomas de células escamosas (SCC) e 10 tumores NSCLC de outros subtipos. As PBMC foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. CD4

+ e CD8

+ células T foram enriquecidas a partir de PBMC por célula magnética triagem usando MicroBeads (Tecnologia de separação de células MACS, Miltenyi Biotec).

proteínas e peptídeos

A série de péptidos 17-mer 16-1b Xage sobrepostas (LPO, Tabela 1) foram sintetizados num sintetizador de péptidos múltiplo, AMS422, ABINED na Universidade de Okayama. A proteína recombinante NY-ESO-1 foi produzido em

Escherichia coli como descrito previamente [20]. A proteína Xage-1b (GAGED2a) (81 aminoácidos de comprimento) foi sintetizado utilizando um sintetizador de péptidos pela GL Bioquímica.

In vitro a estimulação das células T CD4

+ e CD8

+ células T

purificada CD4

+ e CD8

+ células T foram estimulados com células autólogas irradiadas apresentadoras de antigénio (APCs), na presença de uma mistura de 17 péptidos que se sobrepõem 16-mer (LPO, 2 uM ) (Tabela 1) que abrange a sequência de aminoácidos completa da proteína Xage-1b, rhIL-2 (50 UI /ml) e rhIL-7 (10 ng /ml). As células foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços a 37 ° C (CO

2 5%) em de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM, Gibco) suplementado com 8% de soro de humano inactivado (SH), GlutaMAX (Gibco), HEPES (Gibco), aminoácidos não essenciais (MEM NEAA, Gibco), ciprofloxacina e penicilina /estreptomicina.

intracelular de citocinas coloração (ICS)

na sequência

in vitro

estimulação , CD4

+ e CD8

+ T células foram cultivadas durante 14 dias e então avaliadas para respostas de células T específicas Xage-1B. As culturas foram recolhidos e estimulados na presença ou na ausência do conjunto de peptídeos Xage-1b (2 uM) e testadas em um 4hr coloração de citocinas intracelulares padrão (ICS), usando anticorpos específicos para a citocina fluorescentes conjugados αCD4 (BD Biosciences), αCD8 (BD Biosciences), αIL-17A (eBioscience) e alFN-γ (BD Biosciences). O perfil de expressão de citocinas foi então avaliada por citometria de fluxo (FACSAria II, BD Biosciences).

ensaio de captura de IFN-γ e estabelecimento de CD4

+ e CD8

+ T clones de células

T CD4

+ e CD8

+ T foram recolhidos e estimulados na presença ou ausência de péptido piscina Xage-1b (2 uM). As amostras estimuladas foram incubadas com uma CD45-bi específica e o anticorpo de IFN-γ (reagente de captura de IFN-γ, Miltenyi Biotec) e incubou-se durante 5 minutos em gelo. As células foram então colocados num dispositivo rotativo lento (Miltenyi Biotec) durante 45 minutos a 37 ° C, para permitir a secreção de citocina. Após este período, as células foram lavadas em tampão frio e incubado com o reagente de detecção de IFN-γ APC conjugada (Miltenyi Biotec), durante 15 minutos em gelo, na presença de anticorpo específico de citocina αCD4 (conjugado com FITC). As células foram adicionalmente lavadas com tampão frio e analisadas por FACS.

+ células T CD4 que segregaram IFN-γ especificamente em resposta à reunião de péptidos Xage-1b foram classificadas por citometria de fluxo de células, utilizando um FACSAria II. O CD4 isolado

+ IFN-γ produção de células T foram clonados em condições de diluição limitantes, em placas de 96 poços, por estimulação com fito-hemaglutinina (PHA-L, 1 ug /ml) na presença de alogénico de células PBMC e de EBV irradiados linhas (EBV-HV, EBV-LAZ) e rhIL-2 (150 UI /ml).

+ clones das células T CD4 foram mantidas em IMDM suplementado com 8% HS por re-estimulação a cada 2-3 semanas.

avaliação das respostas sorológicas

Respostas sorológicas foram avaliadas por ELISA, utilizando placas de 96 poços revestidas com a proteína Xage-1b (2 ug /ml) ou a proteína NY-ESO-1 (1 ng /ml) durante a noite a 4 ° C. Os soros foram avaliados numa gama de diluições de 1/100 a 1 /100.000. Os títulos de anticorpos foram calculados como a diluição de soro correspondendo a 50% da resposta máxima densidade óptica.

A avaliação da produção de IFN-γ por ELISA

Para avaliar a produção de antigénio específico de IFN-γ, XAGE- 1b clones específicos foram estimuladas na presença ou na ausência do conjunto de peptídeos (50 × 10

3 por poço, em placas de 96 poços de cultura de fundo redondo). IFN-γ foi medida por ELISA em sobrenadantes de 24 h de cultura, utilizando placas Nunc Maxisorp de fundo plano de 96 poços. Para o ensaio da especificidade fina, as células (50 x 10

3 por cavidade) foram estimuladas na presença ou na ausência de péptidos Xage-1b individuais (300 | iM), e concentração de IFN-γ foi medida como descrito acima. Para as experiências de bloqueio de anticorpos, αDP (1 ug /ml), αDQ (1 ug /ml), αDR (1 ug /ml) e αDR52b (ascite, diluição 1:10) anticorpos foram adicionados à cultura teste. Os alelos HLA-DR que restringem foram igualmente avaliadas por ELISA de IFN-y, utilizando uma estrutura molecular definida APC. LDR1, gentilmente fornecida pelo Dr. M. Hassan Zarour (Universidade de Pittsburgh, EUA), foram mantidas em meio RPMI completo e verificado para a expressão de HLA-DR. EBV149 e EBV156, (vírus Epstein-Barr transformada linhagens de células linfoblastóides) foram derivadas de pacientes que expressam HLA-DRB1 * 13.

Resultados

Respostas sorológicas para Xage-1b e NY-ESO-1 em NSCLC pacientes

Foram triados uma coorte de 141 pacientes com NSCLC de respostas sorológicas para Xage-1b e NY-ESO-1, como controle interno, por ELISA. Os resultados do rastreio encontram-se resumidos na Figura 1. Em primeiro lugar avaliado a soros de pacientes, juntamente com os dadores saudáveis ​​de 60 a uma diluição de 1: 100. Detectamos respostas sorológicas significativas para Xage-1b em 12 pacientes (Fig 1A). Em contraste, as respostas de anticorpos para o NY-ESO-1 foi detectada em 9 pacientes. Em seguida, avaliou os soros de pacientes seropositivos 12 Xage-1B em uma curva de titulação e calculou-se a título de anticorpo, definido como a diluição de soro que origina 50% da resposta máxima. Os títulos obtidos foram variáveis ​​entre os pacientes soropositivos e variou de 1: 250 a 1:. 40000 (Fig 1B)

(A) Resumo do ELISA para os 141 pacientes com NSCLC e 60 dadores saudáveis ​​(HD). A densidade óptica (OD) de corte entre respondedores e não-respondedores foi determinado como a média OD obtido com os soros a partir dos desvios de 60 + 5 HD padrão (SD) (linha a tracejado). (B) O soro de titulação de pacientes seropositivos 12 Xage-1B e de um HD foi realizada numa gama de diluições, de 1/100 a 1 /100.000. Os títulos de anticorpos foram determinados como a diluição de soro correspondendo a 50% da resposta OD máximo.

Na coorte, 91 tumores eram adenocarcinomas, 40 eram carcinomas de células escamosas (SCC) e 10 pertenciam a outros subtipos . pacientes seropositivos Xage-1b foram encontrados exclusivamente no subgrupo adenocarcinoma, e representou 13% do sub-grupo (Tabela 2). Em contraste, o NY-ESO-1 em pacientes seropositivos pertencia ao subgrupo principalmente SCC, e representou 13% do subgrupo enquanto apenas 3% dos doentes com adenocarcinoma apresentaram respostas serológicas significativas para o NY-ESO-1 (Tabela 2). Assim, confirmou-se que Xage-1b é espontaneamente imunogénica em NSCLC, principalmente em adenocarcinomas, e demonstraram que este é o caso, não apenas na população japonesa como descrito anteriormente, mas também em caucasianos. A correlação entre as respostas sorológicas para Xage-1b e adenocarcinoma subtipo histológico alcançou significância estatística (teste exato de Fisher, P = 0,0176). Em contraste, os nossos resultados indicam que as respostas de anticorpos para o NY-ESO-1 são mais frequentes em pacientes SCC, com dados perto, mas ainda não atingiu significância estatística (teste exato de Fisher, P = 0,0563). Estes resultados estão em linha com dados publicados anteriormente que soropositividade de NY-ESO-1 foi observada em 29% e 15% dos pacientes SCC e adenocarcinoma, respectivamente [21].

Avaliação da Xage-1b espec�ico CD4

+ e CD8

+ respostas de células T

com base nos resultados da triagem sorológica, foram avaliados os pacientes 12 anticorpo de resposta para CD4

+ e CD8

+ respostas de células T para Xage-1B. Para este fim, enriquecido CD4

+ e CD8

+ células T a partir de PBMC dos pacientes por célula magnética triagem e estimulou-los na presença de um conjunto de 17 péptidos que se sobrepõem 16-mero, que mede o 81 amino completa sequência de ácido da proteína Xage-1b (Tabela 1) e cultivaram-durante 14 dias na presença de APC autólogas irradiadas, rhIL-2 e rhIL-7. No final do período de cultura, que estimularam alíquotas das culturas derivadas de cada paciente, na ausência ou na presença do conjunto de peptídeos Xage-1b e avaliaram a capacidade de resposta para Xage-1b em um ensaio de coloração de citocinas intracelulares 4hr padrão, utilizando anticorpos específico para o IFN-γ e IL-17. Analisou-se as amostras por citometria de fluxo (Fig 2A e 2C) e comparados a proporção de IFN-γ produzir células obtidas para cada cultura, em relação à sua própria resposta de linha de base (na ausência de péptidos) para confirmar a resposta especifica para o antigénio. respostas de células T CD4 +

+ T foram consideradas significativas quando a proporção de células T CD4

+ células T produtoras de IFN-γ na presença do conjunto de peptídeos foi pelo menos três vezes maior do que a observada na linha de base. Com base nestes critérios, foram detectados

+ respostas de células significativas T CD4 para Xage-1b em todos os pacientes soropositivos (Fig 2B), Em contraste, apenas no caso de um paciente, que detectou uma Xage-1b CD8 específica

+ resposta de células T (Figura 2D). No entanto, não conseguimos detectar a produção específica de IL-17 em resposta a Xage-1b em qualquer das culturas.

(A, C) A presença de Xage-1b específico de CD4

+ (A) e CD8

+ (C), as respostas de células T foi avaliada em conjunto de peptídeos culturas estimuladas por coloração de citocinas intracelulares, com anticorpos específicos de citocinas alFN-γ e αIL-17, após estimulação, na ausência ou na presença do péptido Xage-1b piscina. As percentagens de células produtoras de IFN-y são mostrados nos quadrantes superior esquerdo de cada gráfico de pontos, que mostra o aumento da produção de IFN-γ em amostras de péptidos estimulada. Os dados mostrados são um exemplo de um CD4

+ e CD8

celular + T responder paciente. (B, D) Síntese da CD4

+ e CD8

respostas de células T + são mostradas para todos os 12 pacientes seropositivos. Como mostrado em (B), CD4

+ respostas são detectados em todos os pacientes seropositivos, enquanto que uma significativa CD8

+ resposta foi identificada apenas em um paciente, NA703 (D). Valores, pelo menos, 3 vezes maior do que linha de base (sem péptido) foram considerados significativos.

Geração de CD4

+ T clones de células, a avaliação dos peptídeos ativos e restrição HLA

Isolamos Xage-1b reactivo CD4

+ células T a partir de um dos pacientes seropositivos Xage-1B, NA555, enriquecendo a fracção de células que secretada IFN-γ especificamente em resposta à reunião de péptidos Xage-1b, por Miltenyi ensaio de captura de IFN-γ (Fig 3A). Para obter clones específicos, que cultivaram as células isoladas sob condições de diluição limitantes, expandidos e em seguida avaliou-los-los, na ausência ou na presença do péptido piscina Xage-1b (Figura 3B). Obtivemos específica CD4

+ clones de células 14 Xage-1b T, que caracterizado pela sua especificidade fina avaliando a reatividade para os 17 peptídeos individuais sobrepostas que compõem o conjunto de peptídeos Xage-1b. Nós inicialmente testados os péptidos individuais em sub-reuniões de péptidos 3 e cada determinaram que os péptidos reactivos foram localizadas nos primeiros 2 subcombina�es incluindo péptidos C1-C3 e C4-C6 (Tabela 1). Em seguida, avaliou a resposta aos péptidos individuais incluídos nessas regiões. Figura 3C (painel da esquerda) mostra um exemplo desta análise para um Xage-1b

+ clone de células T CD4 reactivas (clone A8C7) que reconhecido C3 péptido. Um resumo da avaliação da especificidade fina do 14 CD4 + clones de células T

é mostrada na Fig 3C (painel da direita). 10/14 clones foram reagentes ao C3 peptídeo, 1 clone reconhecido peptídeos C3 e C4, um clone reconhecido C4 peptídeo, e 2 clones reconhecidos C5 peptídeo. Ao todo, encontramos 4 diferentes especificidades finas. Com base nesta reactividade, determinou-se a MHC de classe II moléculas que restringem o reconhecimento do antigénio de clones individuais representativos dos 4 especificidades finas. Para este fim, foram avaliados o reconhecimento do antigénio, na presença de anticorpos específicos αDP, αDQ, αDR e αDR52b, no contexto de um ensaio de secreção de IFN-γ, onde cada clone foi testado na presença ou na ausência do péptido reactivo. Figura 4A mostra um exemplo de um ensaio de restrição de MHC de classe II realizadas com o B2F8 clone de células T CD4, que reconhecido C3 péptido. Como mostrado, determinou-se que o reconhecimento do antigénio pelo clone foi especificamente inibida pelo anticorpo αDR, enquanto nenhuma inibição foi detectada com anticorpos αDP e αDQ bloqueio, indicando que este clone foi restrito por HLA-DR. Foram obtidos resultados semelhantes para os outros clones. Em seguida, teve como objetivo identificar os alelos que restringem HLA-DR. HLA-DR tipagem molecular revelou que NA555 expressou o DRB1 * 01 e DRB1 * 13 alelos. Para determinar qual destas moléculas foi o alelo restringindo, que estimulou os clones + de células T

CD4, na presença de células LDR1 (fibroblastos de ratinho transfectadas com o HLA-DR1) ou linhas de células B transformadas por EBV (EBV 149, EBV 156) que expressa o alelo DR13. Nós pré-incubadas com os péptidos APC reactivos e avaliada a sua capacidade para apresentar o péptido Xage-1b correspondente aos clones de células T CD4. As respostas foram determinadas medindo-se a quantidade de IFN-γ em sobrenadantes de cultura de 24 horas, por ELISA. Para todos os clones, foram detectados reconhecimento de péptido na presença das linhas celulares de EBV-B (EBV 149, 156) de EBV que expressam DRB1 * 13, mas não na presença de células LDR1 (Fig 4B).

(A ) células Xage-1b específico de CD4

+ T foram isolados por ensaio de captura de IFN-γ. Os números indicados na região superior direito de gráficos de pontos mostram as percentagens de IFN-γ células produtoras de entre o CD4

+ células T, após estimulação, na ausência ou na presença do péptido piscina. IFN-y foram classificados células produtoras e clonados em condições de diluição limitante. clones (B) CD4

+ de células T foram obtidos e selecionados para avaliar a reatividade para Xage-1b. Os clones foram estimulados na presença ou a ausência do conjunto de peptídeos e especificidade para Xage-1b foi determinada por ELISA. As respostas foram consideradas significativas quando o valor de IFN-γ detectado na presença de péptido foi, pelo menos, três vezes maior do que o detectado na ausência de péptido. (C) Alíquotas de Xage-1b + clones de células T específicos de CD4

foram estimuladas na ausência ou na presença do conjunto de peptídeos ou de péptidos isolados individuais e a quantidade de IFN-γ foi medida em sobrenadantes de cultura de 24 horas pela ELISA. (D) Reatividade aos péptidos individuais Xage-1b foi avaliada em 14 clones e foram identificados 4 especificidades finas.

(A) Identificação de moléculas que restringem MHC II. O painel esquerdo mostra um exemplo de um clone de ensaio de restrição HLA-II, B2F8. reconhecimento de péptido foi avaliado por ELISA, incubando Xage-1b específico de CD4

+ clones de células T que apresentam cada um dos 4 especificidades finas quer na ausência ou na presença de anticorpos específicos αDP, αDQ, αDR e αDR52b. reconhecimento de péptido foi restrito por HLA-DR em todos os casos, como resumido em B. O alelo HLA-DR restrição foi identificado por incubação Xage-1b clones específicos

+ de células T CD4 + com diferentes incluindo APC não transfectadas (3T3) ou DR1 fibroblastos -transfected rato (LDR1) e linhas de células EBV-expressando DR13 (EBV149, EBV 156). Cada APC foi pré-incubado com os péptidos reactivos e o alelo restrição foi determinada por avaliação da sua capacidade para apresentar os péptidos aos correspondentes CD4

+ clones de células T. reconhecimento de péptido foi avaliado por medição da secreção de IFN-γ em sobrenadantes de cultura, na presença de cada APC. Conforme resumido, descobrimos que o reconhecimento do péptido foi restringido por HLA-DR13 em todos os casos.

Discussão

Neste estudo, nós investigamos anticorpo espontânea e respostas de células T ao CTA Xage -1-B em uma coorte de 141 pacientes caucasianos com NSCLC. Nossas descobertas demonstram que as respostas sorológicas para Xage-1b são em grande parte restrita a adenocarcinomas como eles são encontrados em cerca de 13% deles, mas não são detectados no SCC. Tendo em conta que Xage-1b foi relatado para ser expresso em cerca de 45% dos adenocarcinomas [18] (mas apenas 7% de CAA), as respostas serológicas parecem bastante frequente neste grupo de pacientes, sendo encontrada em cerca de um terço delas . Estes resultados estão em linha com dados publicados anteriormente na população japonesa, relatando respostas sorológicas para Xage-1b em 14% dos adenocarcinomas, mas em apenas 2% dos pacientes SCC [19]. Nossos dados também indicam que as respostas sorológicas para NY-ESO-1 em vez disso são mais frequentes em SCC do que no adenocarcinoma, como eles são encontrados em 13% dos SCC mas apenas em 3% dos adenocarcinomas de caucasianos. Novamente, isto está de acordo com os resultados de estudos anteriores que relataram respostas sorológicas espontâneas mais frequentes para NY-ESO-1 em SCC do que no adenocarcinoma [21]. Semelhante a NY-ESO-1, que têm relatado recentemente que os antigénios MAGE-A, que também pertencem ao grupo de CTA, foram mais frequentemente expressos na SCC, em relação ao adenocarcinoma [22]. Juntos, nossos resultados confirmam a imunogenicidade Xage-1b no adenocarcinoma pulmonar, destacando a importância deste CTA como um alvo promissor para imunoterapia contra este subtipo de tumor.

Em nosso estudo, detectamos significativa Xage-1b-específica CD4

+ respostas de células T em todos os pacientes soropositivos, novamente em linha com os dados anteriores da população japonesa [19]. Nós estabelecemos populações clonais a partir de uma alta resposta, determinou que a reactividade dos clones foi em direcção sequências situadas em péptidos C3-C5, que correspondem à região do ácido 9-32 amino da proteína, e identificado 4 finas especificidades de reconhecimento do antigénio. Demonstramos que, para todas as especificidades finas, o reconhecimento peptídeo foi restringido por HLA-DR. Ao avaliar a apresentação de antigénio usando APC que compartilham alelos HLA-DR individuais com os do paciente, determinou-se que o reconhecimento do antígeno pelos clones foi restringido pelo DRB1 * 13 alelo. É de salientar que, enquanto outra Xage-1b MHC classe II epitopos restritos por outros alelos têm sido relatados [19,23,24], DRB1 * 13 epitopo restrito descrito aqui não tem sido relatado previamente.

Alguns dos nossos resultados estão em desacordo com os relatados na literatura [19,25]. Por um lado, tanto em nosso estudo e em estudos prévios na literatura [19] Xage-1b específica CD4

+ células T respostas foram detectados em praticamente todos os pacientes soropositivos NSCLC Xage-1b. No entanto, em desacordo com os resultados de um estudo recentemente relatada [25] no nosso estudo, Xage-1b específico de CD4

+ células T produziram IFN-γ mas não de IL-17, e, assim, exibiu um perfil Th1 claro. Além disso, foi detectada uma

+ resposta significativa T CD8 células em apenas um dos 12 pacientes soropositivos, o que é muito menos frequente do que a frequência de 6/9 pacientes soropositivos reportados anteriormente na coorte japonesa [19]. Essa discrepância pode ser pelo menos parcialmente explicada pelas diferentes metodologias utilizadas que podem diferir significativamente em termos de sensibilidade e especificidade de detecção. Com efeito, ao passo que foram avaliados CD8

+ T respostas de células num ensaio de 4 h padrão citoquina intracelular coloração (ICS), no estudo japonesa, CD8

+ T respostas de células para Xage-1b foi avaliada por captação a secreção de IFN-γ ensaio [19]. Assim, tanto a frequência de Xage-1b CD8 específica

+ respostas de células T em pacientes soropositivos tem sido subestimada em nosso estudo, por causa da menor sensibilidade do método utilizado, ou superestimado no estudo de Ohue Y et al. por causa da menor especificidade do ensaio de captura de IFN-γ, duas hipóteses, que não são mutuamente exclusivas. No entanto, a favor de uma sobre-estimativa do número de verdadeiro Xage-1b CD8

+ T respostas de células no estudo japonesa, é o facto de que os níveis de secreção de IFN-γ obtidas nesse estudo na maior parte dos CD8

+ culturas de células T após estimulação com peptídeos Xage-1b foi muito baixa, perto de níveis de fundo [19].

em conclusão, em conjunto, nossos resultados reforçam a relevância do antígeno Xage-1b em pacientes caucasianos com adenocarcinoma de pulmão e incentivar a implementação de imunoterapias futuros explorando a alta imunogênica deste antígeno em nesta população de pacientes.

Além disso, é de salientar que, porque a expressão XAGE1b é conhecido por ser regulada por metilação do DNA, inibidores da metiltransferase de ADN pode aumentar o potencial população de pacientes elegíveis para imunoterapias dirigidas Xage-1b, como previamente relatado no caso de NY-ESO-1 [26]. Explorando esta possibilidade poderia ser objecto de futuros estudos.