Abstract

GAIP interagindo proteína C terminal (GIPC) é conhecida por desempenhar um papel importante em uma variedade de fisiológica e estados de doença. No presente estudo, nós identificamos um novo papel para GIPC como um regulador mestre da autofagia e as vias exocitótica em câncer. Mostramos que a depleção de autofagia induzida GIPC em células de câncer de pâncreas, como é evidente a partir da sobre-regulação da LC3II autofagia marcador. Relatamos ainda que GIPC regula vias de tráfego celular através da modulação da secreção, biogénese, e composição molecular de exossomas. Nós também identificou o envolvimento de GIPC em vias de estresse metabólicas que regulam a autofagia e derramamento microvesicular, e observou que o estado GIPC determina o carregamento da carga celular no exosome. Além disso, demonstrámos a sobre-expressão do gene de resistência à droga ABCG2 em exossomas a partir de células de cancro do pâncreas GIPC-empobrecido. Também demonstramos que a depleção de GIPC a partir de células cancerosas sensibilizados-los ao tratamento gemcitabina, uma avenida que pode ser explorada como um potencial estratégia terapêutica para superar a resistência aos medicamentos em câncer

Citation:. Bhattacharya S, Pal K, Sharma AK , Dutta SK, Lau JS, Yan IK, et al. (2014) GAIP de interação proteína C-Terminus Regula Autophagy e exossomo Biogenesis de cancro do pâncreas através de Vias Metabólicas. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10.1371 /journal.pone.0114409

editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Abril de 2014; Aceito: 07 de novembro de 2014; Publicação: 03 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Bhattacharya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede CA78383 e CA150190 (DM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

macroautofagia, vulgarmente denominado como autofagia, é um processo catabólico essencial que as células implementar em diversas actividades biológicas e fisiológicas [1], [2]. Sob condições celulares normais, este processo mantém a homeostase celular e do tecido de modo a proteger por reciclagem e componentes celulares durante a morte celular degradantes [2] – [5]. Anteriormente, acreditava-se que o autophagosome, uma vesícula de duplo membranados, engole organelos aleatoriamente [1], [2], [5]; No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a selecção de organelos é dirigido por factores específicos de carga [6]. Além disso, autofagia desempenha um papel importante em muitos processos de doença, incluindo o cancro [7]. Em vários tipos de câncer, a autofagia pode influenciar o início e progressão da doença [8], [9] e promover o desenvolvimento do tumor sob o estresse metabólico da hipóxia. Porque as mutações de genes relacionados com a autofagia têm sido relatados em cancros humanos [10], [11], estudos têm-se centrado na inibição química e genética de autofagia como uma estratégia terapêutica [12].

GAIP interagindo proteína C- terminal (GIPC) foi inicialmente identificada como um parceiro de interacção da proteína de activação de GTPase RGS-GAIP para a proteína G de receptores acoplados a subunidade alfa GI [13]. O domínio PDZ de GIPC estabiliza muitas proteínas de transmembrana, incluindo o transportador Glut1, Semaforina-F, neuropilina-1, proteína virai IMPOSTO, dopamina D2 e ​​D3, e IGF1R [14] – [19]. Embora a maioria dos ligandos de ligação ao domínio PDZ para GIPC são proteínas transmembranares, muitos deles são proteínas citosólicas, tais como APPL1 RGS19 e [13], [20]. Funcionalmente, a região N-terminal de GIPC está envolvido na dimerização e a região C-terminal da GIPC interage com miosina VI (MYO6) [21], [22], realçando o seu papel como uma molécula adaptadora para cargas alvo no domio do carregamento PDZ para a proteína motora MYO6 para o transporte. GIPC também está envolvido no tráfico de várias proteínas de transmembrana para as vesículas endocíticas e essencial para o tráfico de integrinas internalizado durante a migração celular, angiogénese, e citocinese [23] – [25]. Os níveis elevados de expressão GIPC são relatados em vários cancros, incluindo o cancro da mama e do pâncreas, promovendo a sua proliferação e sobrevivência celular [19], [26] – [30]. Por outro lado, o empobrecimento de células cancerosas em GIPC inibe a proliferação e promove a apoptose. Knockdown de resultados GIPC em G

2 paragem do ciclo celular e diminui a mortalidade em células MDA-MB231, sugerindo ainda mais o papel da GIPC na citocinese e a migração de células [23], [31].

são exossomas vesículas intracelulares (40-100 nm) necessária para a comunicação intercelular em organismos multicelulares [23]. A maquinaria molecular envolvidos na biogênese exosome inclui quatro complexos multiprotein conhecido como o endossomal triagem complexa responsável pelo transporte (ESCRT) -0, -I, -II e -III e proteínas acessórias, tais como Alix e VPS4. O ESCRT-0, -I e -II complexos de reconhecer e sequestram proteínas de membrana ubiquitinados na membrana endossomal restrição, enquanto que o complexo ESCRT-III é responsável pela membrana de brotamento e a remoção real de vesículas intraluminais (ILVs) [32]. Recentemente, Alix (também conhecido como PDCD6IP) foi funcionalmente ligada a biogénese exossomo através da sua interacção com as proteínas e TSG101 CHMP4 [33] – [35]. Um estudo recente sugere que a formação ea libertação das microvesículas arrestina proteínas contendo domínio 1-mediada (ARMMs) na membrana plasmática depende do recrutamento de proteína TSG101 [36].

Existem evidências de que as peças GIPC um papel importante no tráfico celular. Em particular, GIPC actua como um andaime para controlar o tráfico mediada pelo receptor [20], [22], [37] e após internalização do receptor, GIPC transitoriamente se associa com uma piscina de vesículas endocíticas perto da membrana do plasma [15]. biogénese exossomo, bem como a formação de vesículas autophagosome envolve endocitose. No entanto, não há nenhuma evidência clara de que estes dois mecanismos de formação de vesículas interferência um com o outro [38]. No presente estudo, nós revelamos um papel único regulador da GIPC na autofagia através de vias metabólicas ea modulação da secreção exosome. Nós também demonstram que a depleção de GIPC a partir de células cancerosas sensibiliza-los para agentes quimioterapêuticos como a gemcitabina, uma avenida que pode ser mais explorada como um potencial estratégia terapêutica contra a resistência aos medicamentos.

Materiais e Métodos

cultura celular linhas de células knockdown GIPC

linhas celulares de cancro do pâncreas ASPC-1 e PANC-1 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). As linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (para AsPC-1) ou alta DMEM de glicose (por PANC-1) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS), 5% de L-glutamina, e 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera contendo 95% de ar-5% de CO

2 (v /v). As linhas celulares estáveis ​​knockdown GIPC foram gerados utilizando lentivírus shRNA. As partículas foram preparadas utilizando lentivírus células 293T co-transfectado com o plasmídeo de expressão gag-pol pCMVΔ8.91, o envelope VSVG expressão plasmídeo pmd-G, e o plasmídeo vector que codifica pLKO.1 ADNc para a expressão de GIPC /Synectin shRNA (5 ‘-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3’). GIPC /Synectin shRNA em pLKO.1 foi comprado de Abertas Biosystems. O sobrenadante foi recolhido 48 h após a transfecção e congeladas a -80 ° C. células PANC-1 ou AsPC-1 foram, então, infectadas durante a noite a 37 ° C e as colónias estáveis ​​foram isolados após a selecção de puromicina (1 jag /ml). Para assegurar a eficiência do knockdown GIPC /Synectin, os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransferência de GIPC /Synectin. As células de controlo foram transduzidas com um vector vazio proteína. Retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B plasmídeo de Addgene (Addgene plasmídeo 22418) foi utilizado para preparar as partículas retrovirais utilizando células 293T seguinte procedimento padrão. células AsPC-1 ou PANC-1 foram infectadas com partículas de retrovírus e as colónias estáveis ​​foram isolados após a selecção de puromicina (1 jag /ml). As experiências foram efectuadas em confluência celular de 70-80% e confirmada em pelo menos três experiências independentes.

interferência de ARN, transfecção

Após uma incubação de 24 horas com meio sem antibiótico, as células foram transfectadas com anti-GIPC pequeno ARN interferente (siRNA) usando o Reagente de Transfecção DharmaFECT 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Setenta e duas a 96 horas após a transfecção, GIPC knockdown foi confirmada por análise de Western blot. Uma abordagem siRNA semelhante foi adoptada para anti-Atg7 e Beclin1 anti-knockdown. Para as experiências de inanição de glucose, ambas as células de controlo e de ARNip GIPC siRNA tratados AsPC-1 foram mantidas em meio RPMI isento de glucose suplementado com 10% FBS durante 16 h finais de 96 h a experiência. Para as experiências de fluxo autofágicos, tanto ARNsi de controlo e ARNsi GIPC tratada AsPC-1 e PANC-1 As células foram tratadas com as concentrações indicadas de pepstatina-A e E-64D para Final 24 h a 96 h da experiência.

Anticorpos e análise de imunotransferência

lisados ​​celulares totais foram preparados em NP-40 tampão de lise, suplementado com um cocktail inibidor de protease (Sigma, St. Louis, MO) e cocktail de inibidores de fosfatase Halt (Thermo Scientific, Waltham, MA). O sobrenadante foi recolhido após centrifugação a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C e separados por SDS-PAGE. Anti-GIPC, anti-PLCy, e os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos contra ABCG2, mTOR, fosfo-mTOR, p70S6K, fosfo-p70S6K, Atg7, Beclin1, AMPK-α, e-fosfo-AMPK α foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies. Anti-CHMP4b e anti-TSG101 foi comprado de Abcam; anti-β-actina foi adquirido de Sigma; e o anticorpo Alix foi adquirido a partir de Thermo Scientific. Western blots foram desenvolvidos usando o substrato SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) e as imunoprecipitações foram realizados como previamente descrito [19].

Imunofluorescência

As células (2 x 10

4) foram semeadas sobre uma lamela em meio isento de antibiótico durante 24 h. As células foram então transfectadas com ARNsi GIPC ou mexidos siRNA (Dharmacon) e o meio foi mudado 48 h pós-transfecção. Após 96 h, as células foram lavadas e fixadas com paraformaldeído a 4%. Após bloqueio com soro de cabra a 10% durante 15 min, as células foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 5 min. As lâminas foram então coradas com anticorpos primários contra LC3 durante 2 h em soro de cabra a 1%. Após a incubação as lâminas com anticorpos secundários conjugados com AlexaFluor 488 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY) durante 1 h, as lâminas foram montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) contendo 4 ‘, 6-diamidino-2 -phenylindole (DAPI) e microscopia confocal foi realizada. Num outro conjunto de experiências, as células que expressam EGFP-mCherry-LC3B foram semeadas em lamelas e transfectadas com ARNsi GIPC ou mexidos siARN. Após 96 h, as células foram lavadas e fixadas com paraformaldeído a 4%. As lâminas foram montadas com Vectashield contendo DAPI como anteriormente descrito. As células estáveis ​​

captação de glicose e medição de glicose intracelular ensaio

, quer transfectadas com GIPC shRNA ou o vector de controlo, foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 48 h. captação de glicose foi medida utilizando o Kit de captação de glicose com base em célula de ensaio (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) utilizando um análogo desoxiglucose marcada fluorescentemente. Para obter uma medição da concentração de glucose intracelular, o Vermelho Amplex Glucose Assay Kit (Life Technologies) foi usado com uma ligeira modificação com o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente [39]. As células foram recolhidas por centrifugação e o sedimento celular resultante foi lavada duas vezes em PBS e dispersa em tampão de reacção 1X do kit. As células foram lisadas por sonicação com sonda com três ciclos de 10 segundos ligado, 30 segundos desligado com a potência de 20%, enquanto continuamente mantido em gelo. Cinquenta ul de solução de reacção (10 mM de Amplex Red, 10 U /ml de HRP, 100 U /ml de glucose-oxidase, tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4) foi adicionado a 50 ul de ligado de células em uma placa de 96 poços e incubadas em no escuro a 37 ° C durante 30 min. A fluorescência (excitação: 544, Emissão: 590). Foi então medida utilizando um leitor de placas SpectraMax e os valores foram expressos como unidades relativas de fluorescência (RFU) /mg de proteína

isolamento exossomo

exossomas foram isolado a partir de meio condicionado de células PANC-1 e AsPC-1 por centrifugação diferencial. As células foram cultivadas até 70-80% de confluência e o meio foi substituído com meio contendo soro fetal bovino a 10% privados de micropartículas através de centrifugação (60 min a 100000 ×

g

). Após 72 h de incubação, os sobrenadantes foram recolhidos e limpos de restos celulares e de células mortas com duas rotações sequenciais a 4 ° C, 3000 ×

g

durante 10 min. Límpido sobrenadantes foram então adicionalmente centrifugado a 4 ° C, 60000 ×

g

durante 70 min. Os peletes de exossoma resultantes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e em seguida centrifugou-se de novo a 4 ° C, 100000 ×

g

durante 70 min. Os peletes de exossoma finais foram re-suspensas em PBS ou água, dependendo da experiência.

Microscopia electrónica

exossomas recentemente preparados re-suspensas em água foram posteriormente dispersos na solução fixadora de Trump, composto por quatro % (v) de formaldeído e 1% (v) de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,2. Os exossomas foram então lavadas com tampão de fosfato 0,1 M, 1% de tetróxido de ósmio em tampão fosfato 0,1 M, água destilada, 2% (v) de acetato de uranilo, água destilada, etanol, e acetona absoluta em sequência. Finalmente, exosomes foram colocados em uma grade TEM para exame usando um

Philips technai

T12.

Proteomics análise

identificação de proteínas foi realizada por meio de digestão com tripsina in-gel usando nanoLC- MS /MS com espectrometria de massa ion trap híbrido Orbitrap /linear. Resumidamente, a proteína a partir dos exossomas de linhas celulares estáveis ​​GIPC deficientes foi resolvido num gel de NuPage 4-12% (tampão MOPS) com 20 ul de tampão de amostra de SDS-PAGE contendo DTT 50 mM. Os géis foram corados com corante azul BioSafe coloidal (BioRad) e as faixas desejadas foram excisadas do gel para análise por espectrometria de massa usando os seguintes procedimentos. azul bandas de gel corado coloidais foram descoradas em 50% de acetonitrilo /50 mM de Tris pH 8,1 até ficar límpida. As bandas foram em seguida reduzidos com Tris 50 mM TCEP /50, pH 8,1 a 55 ° C durante 40 min e alquiladas com iodoacetamida 20 mM de Tris /50 mM de pH 8,1 à temperatura ambiente durante 60 min no escuro. As proteínas foram digeridas

em

situ com 30 ul (0,005 ug /uL) de tripsina (Promega Corporation, Madison, WI) em 20 mM de Tris pH 8,1 /0,0002% de Zwittergent 3-16, a 55 ° C durante 2 h, seguido por extracção com péptido com 10 ul de ácido trif luoroacético a 2% e depois 60 ul de acetonitrilo. Os extractos combinados foram concentrados para menos de 5 ul sobre um concentrador Speed-Vac (Savant Instruments, Holbrook, NY) e depois levada para cima em ácido trifluoroacético a 0,2% para a identificação das proteínas por espectrometria de massa de cromatografia líquida de nano-fluxo electropulverização em tandem (nanoLC-ESI -MS /MS) usando um ThermoFinnigan Orbitrap Elite híbrido Espectrómetro de Massa (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha) acoplado a um sistema de Eksigent nanoLC 2D-HPLC (Eksigent, Dublin, CA). A mistura de péptido digerido foi carregado em um 250 nl OPTI-PAK armadilha (Optimize Technologies, Oregon City, OR), costume-embalados com fase sólida Michrom Magia C8 (Michrom Bioresources, Auburn, CA). A cromatograf ia foi realizada usando 0,2% de ácido fórmico em ambos o solvente A (98% água /acetonitrilo a 2%) e o solvente B (80% de acetonitrilo /10% de isopropanol /10% de água), e um 2% de B ao gradiente 45% de B ao longo 70 min a 300 nl /min através de uma mão-embalados PicoFrit (Objetivo Novo, Woburn, MA) de 75 mm x 200 mm coluna (Michrom Magia C18, 3 mm). O experimento espectrômetro de massa Orbitrap Elite foi criado para executar uma varredura completa FT entre 340-1500 m /z com a resolução estabelecida em 120.000 (a 400 m /z), seguido de ion trap linear scans CID MS /MS sobre os quinze principais íons. exclusão dinâmica foi definido como 1 e íons selecionados foram colocados em uma lista de exclusão de 30 segundos

Banco de Dados procura

espectros de massa

Tandem foram extraídos por msconvert (versão 3.0.4019; ProteoWizard). e todos amostras de MS /MS foram analisados ​​utilizando Mascot (Matrix Ciência, Londres, Reino Unido; versão 2.4.0), Sequest (Thermo Fisher Scientific, versão 27, rev. 12) e X1 Tandem (O GPM, thegpm.org; versão de ciclone (2010.12 .01.1)). Mascot, Sequest, e X1 Tandem foram criados para procurar o banco de dados Swissprot fevereiro de 2012, restrita a humana com um banco de dados inversa chamariz, e assumindo a enzima tripsina digestão. Mascot e X1 Tandem foram pesquisados ​​com uma tolerância de massa fragmento de iões de 0,60 Da e uma tolerância ion pai de 10,0 PPM. Sequest foi procurado, com uma tolerância de massa fragmento de iões de 0,60 e uma tolerância ion pai de 0,01 Da. A oxidação de metionina e derivado de iodoacetamida de cisteína foram especificadas em Mascot, Sequest, e X1 em tandem como modificações variáveis.

Isolamento de ARN e análise de PCR quantitativa

O ARN total foi isolado a partir de linhas celulares e utilizando exossomas o Kit miRCURY RNA Isolation – Cell Planta (Exiqon, Woburn, MA) seguido com espectrofotometria (NanoDrop, Thermo Scientific) para a quantificação e análise qualitativa. Quantidades iguais de RNA total foi transcrito reverso-por oligo (dT) de escorva usando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) seguindo as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando o sistema de tempo real ABI 7500 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a PCR Master Mix SYBR Green (Applied Biosystems), como descrito anteriormente [40]. GLUT1 e β-actina iniciadores foram adquiridos a SABiosciences (Frederick, MD).

sensibilidade ao fármaco de ensaio

Resumidamente, 5 x 10

3 células foram semeadas por poço, em triplicado, em 96 -bem placas de fundo plano com 100 uL de meio. Após 24 h, adicionaram-se concentrações variáveis ​​de gemcitabina (ug /ml) e as células foram incubadas durante um adicional de 72 h. No final do período de tratamento, 20 ul de solução contendo MTS PMS (MTS:. PMS = 20:01 vol rácio) foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas a 37 ° C durante 1 a 2 h. A absorvância a 490 nm foi registada usando um Spectrafluor Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e os valores de semi máximas concentração inibitória (IC50) foram calculados como concentrações que corresponde a uma redução de 50% do crescimento celular. Antes do teste de sensibilidade ao fármaco, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS (Promega, Madison, WI).

A análise estatística

Os dados nos gráficos de barras representam a média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes, cada uma realizada com amostras em triplicado. As análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste t de Student, com um valor de duas caudas de P 0,05 para serem considerados significativos

Resultados

esgotamento GIPC induz a autofagia em células pancreáticas cancerosas

Utilizando as linhas de células pancreáticas GIPC-empobrecido AsPC-1 e PANC-1, foi investigado se o GIPC autofagia modulado através da avaliação da cadeia leve da proteína microtubular-associada relacionados com autofagia 3 conversões (LC3) (LC3-I lc3-II) através da análise de Western blot. É bem sabido que a conversão da cadeia leve de 3-l (LC3-I), após conjugação com f osf atidiletanolamina (PE), constitui a cadeia leve conjugado 3-II (LC3-II), que é então recrutados para as membranas de autofagossomas [13], [20]. LC3 expressão tem sido amplamente utilizado para monitorizar e determinar o estado de autofagia como a quantidade de LC3II correlaciona-se com o número de autofagossomas [41]. Depois de uma investigação exaustiva do nível LC3-II nas linhas celulares estáveis ​​pancreáticas, observou-se um nível elevado LC3-II em células deficientes para GIPC, indicando a activação da autofagia (Figura 1A). Observou-se também um aumento na formação LC3-II (verde) puncta nas células GIPC-empobrecido por estudo de imunofluorescência (Figura 1B). GIPC knockdown na presença de inibidores de proteases lisossomais, pepstatina-A e E-64D, aumentou ainda mais os níveis LC3-II de um modo dependente da dose em comparação com GIPC knockdown sozinho, indicando aumento de fluxo autophagic (Figura S1A). Além disso, utilizou-se uma proteína de fusão em tandem mCherry-EGFP-LC3B contendo insensível-ácido mCherry e ácido-sensível EGFP como um sistema repórter fluxo autophagic [42], [43]. Durante a formação autophagosome, tanto EGFP e mCherry são detectados em autofagossomas que aparecem como puncta amarelo. No entanto, uma vez autofagossomas fusível com lisossomos, a fluorescência verde é perdido por causa da degradação da EGFP por proteases lisossomais ácido resultante única puncta vermelho. Portanto, a presença de ambos puncta amarelo e vermelho indica um processo de fluxo autofágica funcional. Aqui temos usado ambas as linhas celulares AsPC-1 e PANC-1 expressando estavelmente mCherry-EGFP-LC3B para mostrar o aumento tanto puncta amarelo e vermelho em cima GIPC knockdown que também indicou um aumento no fluxo autofágica (Figura S1B). Estas descobertas sugerem que GIPC knockdown induz a formação de autofagossomas em células de cancro do pâncreas.

A) As células AsPC-1 e PANC-1 foram infectadas com lentivírus expressando a shRNAs scrambled GIPC e controlo. Uma quantidade igual de lisados ​​de células inteiras a partir de AsPC-1 e PANC-1 GIPC empobrecido células foram analisadas por imunotransferência (IB) com os anticorpos para GIPC e LC3II. β-actina é utilizado como controlo de carga. B) A análise de imunofluorescência representativos de células PANC-1 para expressão de LC3 II (verde) em células GIPC empobrecido PANC-1 em comparação com as células de controlo. As células foram contrastadas com DAPI (azul).

Além disso, investigamos o efeito de dois genes relacionados à autofagia, Atg7 e Beclin1, sobre a regulação autofágica GIPC mediada. Para avaliar a interacção de Atg7 e Beclin1, que reduziu o nível de Atg7 e Beclin1 por interferência de RNA (RNAi) em ambas as células PANC-1 e AsPC-1. Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, não observamos nenhuma mudança significativa na expressão Atg7 ou Beclin1 após a depleção GIPC tanto em células de câncer de pâncreas. Como Atg7 e Beclin1 são dois componentes essenciais para a biogênese autophagosome, também observamos uma diminuição na conversão LC3 II da LC3 I em cima do knockdown de Atg7 e Beclin1 em ambas as células de câncer de pâncreas. Em células ASPC-1, observou-se que a indução de autofagia com esgotamento de GIPC foi significativamente entravada pela redução de Atg7 e Beclin1. Pelo contrário, em células PANC-1, Atg7 e Beclin1 pode não afectar a conversão LC3II sujeitas a depleção de GIPC. Nós explorada a associação de GIPC com Atg7 e Beclin1 por experiências de co-imunoprecipitação e encontrou Beclin1 para estar no mesmo complexo com GIPC (Figuras 2C), mas não obteve resultado conclusivo para Atg7 (dados não mostrados).

Uma análise) de imunotransferência da expressão da Atg7 em lisados ​​celulares AsPC-1 e PANC-1 transfectadas com ARNsi de GIPC, Atg7 e mexidos controlo. β-actina é utilizado como controlo de carga. B) Análise de imunotransferência da expressão Beclin1 em AsPC-1 e os lisados ​​de células PANC-1 transfectadas com ARNsi de GIPC, Beclin1, e mexidos controlo. β-actina é utilizado como controlo de carga. C) Co-imunoprecipitação (IP) dos lisados ​​de células PANC-1 transfectadas com ARNsi de GIPC, e mexidos de controlo utilizando anticorpo de GIPC. Imunocomplexos foram analisados ​​por immunoblotting (IB) com anticorpos para Beclin1 e GIPC.

GIPC medeia autofagia por estresse metabólico vias

GLUT1 está associada com a captação de glicose nas células cancerosas e GIPC é conhecida para estabilizar GLUT1 na membrana celular como um parceiro de interacção contendo o domínio PDZ [14]. A este respeito, examinamos se derrubando GIPC em células de câncer de pâncreas desestabilizaria GLUT1 e interromper a captação de glicose nestas células. Como esperado, verificou-se uma diminuição significativa na expressão de Glut1 em ambos os mRNA e o nível de proteína sobre GIPC knockdown no AsPC-1 e células PANC-1 (Figura 3A 3B). Além disso, verificou-se que a absorção relativa de glucose para AsPC-1 e células PANC-1 foi significativamente reduzida na ausência de GIPC, em comparação com a das células de controlo (Figura 3C). Para determinar se os níveis intracelulares de glucose foram também depende do estado de GIPC, que monitorizado o nível de glicose intracelular após GIPC knockdown nas mesmas linhas celulares do cancro do pâncreas e encontrou níveis para ser significativamente reduzido quando comparado com células de tipo selvagem (Figura 3D). Importante, sob condições de estresse, AMP celular normalmente regula o nível de glicose intracelular. os níveis de AMP foram elevados em jejum de glucose, o que, por sua vez, activadas ainda mais a actividade de quinase de AMPK-α através de fosforilação [44], [45]. Para investigar este mecanismo em linhas celulares de cancro do pâncreas, examinou-se o estado da AMPK-α por imunotransferência em células knockdown estável GIPC. Nossos resultados mostraram um alto nível de fosforilada AMPK-α sobre GIPC esgotamento (Figura 4A), sugerindo que GIPC pode modular as vias AMPK.

A) Quantitative PCR e B) Análise de Western blot de GLUT1 analisar o efeito de GIPC-esgotamento na expressão GLUT1. β-actina é utilizado como controlo de carga. Ambos GLUT1 mRNA e os níveis de proteína diminuiu significativamente após o esgotamento GIPC em AsPC-1 e células PANC-1. C) A absorção de glucose foi significativamente diminuída em células GIPC empobrecido em comparação com as células de controlo em AsPC-1 e células PANC-1 (** indica P 0,01). D) os níveis de glicose intracelular foram também diminuiu significativamente no GIPC empobrecido AsPC-1 e linhas de células PANC-1, confirmando o papel GIPC no metabolismo da glicose (** indica p 0,01)

A) Immunoblot. dos lisados ​​de células de GIPC empobrecido e controlar AsPC-1 e PANC-1, células estão a ser sondados com p-AMPK-α, total de AMPK-α. β-actina é utilizado como controlo de carga. B) Além disso, immunoblot de lisados ​​celulares de cima condição estavam sendo sondadas com p-mTOR, mTOR total, o p-p70S6K e p70S6K total. β-actina é utilizado como controlo de carga.

investigado o mecanismo molecular de autofagia examinando moléculas jusante da via de AMPK-α. Observamos diminuição dos níveis de fosforilação mTOR após GIPC knockdown no AsPC-1 e PANC-1 células; No entanto, a expressão total de mTOR não se alterou. Além disso, observou-se um decréscimo em um efector a jusante de mTOR conhecido, a fosfo-p70S6K a p70S6K proporção, em lisados ​​celulares GIPC-empobrecido em comparação com as células parentais de controlo (Figura 4B). A remoção de glucose extracelular reforçada fosforilação AMPK-α e reduziu a fosforilação de mTOR, bem como a fosforilação p70S6K (Figura S2). No entanto, os níveis LC3 foram reduzidos após a remoção do extracelular glucose que corrobora com os relatórios anteriores [46] sugerindo remoção da glicose extracelular mata as células, quer por apoptose ou necrose em vez de induzir a autofagia como um efeito prosurvival. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que GIPC controla autofagia através da regulação de vias metabólicas em células de adenocarcinoma do pâncreas.

GIPC influencia a secreção exosome e biogênese

Com os exossomos recolhidas a partir dos transfectantes estáveis, realizamos Os ensaios enzimáticos para a actividade da acetilcolina-esterase, tal como descrito anteriormente [14]. Este ensaio revelou uma maior abundância de exossomas no meio condicionado de linhagens de células deficientes em GIPC. Um aumento de 3,5 vezes ou superior na produção de exossoma foi observada em meio condicionado recolhido a partir de GIPC-empobrecido AsPC-1 de células comparado com o controlo (Figura 5A). Foram obtidos resultados semelhantes com células PANC-1-GIPC esgotados, bem como (dados não mostrados). Nós também determinou a concentração de RNA total nestes exossomos como outra medida de abundância exosome e encontrou resultados semelhantes (Figuras 5B 5C). Nanoparticle tracking análise usando o NanoSight LM10 confirmou a distribuição do tamanho da nossa preparação de exossoma. Com um modo de aproximadamente 100 nm, o seu tamanho é consistente com a definição actual exossomo (Figura 5D).

exossomas foram isolados a partir de meios de cultura de AsPC-1 e PANC-1 GIPC empobrecido e cultura de células de controlo. Para a medição qualitativa mesma quantidade de células foram semeadas em placas de cultura. A) Uma comparação da atividade da acetilcolinesterase é representado por exossomos coletados de GIPC empobrecido e controlar linha de células AsPC-1. B C) Uma comparação entre o conteúdo de RNA total da preparação de exossoma AsPC-1 e de cultura de células PANC-1 é apresentada. D) Um perfil de distribuição de tamanhos representativa de exossoma a preparação é obtida utilizando Nanosight. E) Uma micrografia de transmissão electrónica representativa (TEM) de exossomas é apresentado nesta figura. barra de escala é de 500 nm. Uma imagem TEM maior ampliação de exossomas F) é apresentada. A barra de escala é de 200 nm. G) de imunotransferência realizada com células lisados ​​obtidos a partir de células de knockdown GIPC, bem como as células de controlo foram sendo sondado com TSG 101, Alix, e CHMP 4B. PLC γ é utilizado como controle de carga.

Nós, então, realizada a caracterização morfológica da preparação exosome com uma análise ultra-estrutural das pelotas exossomo por microscopia eletrônica de transmissão de coloração e negativo heavy metal (TEM). Análise das imagens TEM confirmou as dimensões exossomo em nossas amostras. Figura 5E representa a morfologia típica da população total exosome em uma ampliação TEM inferior. Uma análise mais aprofundada das imagens TEM em maior ampliação confirmou a estrutura em forma de concha forma típica de exossomos (Figura 5F). Estas análises confirmaram que a presença ou ausência de GIPC não afectou a morfologia exossoma.

Para confirmar se o aumento das células em exossomas GIPC-empobrecido correlacionados com a activação da máquina exossomo biossíntese, fizemos a expressão de genes-chave ( Alix, TSG101, CHMP4B) envolvidos na biogênese exosome por immunoblot. Observou-se um aumento da expressão de Alix, TSG101 e CHMP4B em células knockdown GIPC quando comparado com células de controlo (Figura 5G).

GIPC influencia o conteúdo exosome e sensibiliza linhas celulares do cancro do pâncreas quimioterápicos

Para comparar o conteúdo exosome em GIPC knockdown e células de tipo selvagem, foi realizada proteômica análises sobre os exossomos recolhidas a partir das linhas de células estáveis ​​PANC-1. Para a análise do proteoma, a proteína foi extraído das exossomos secretados e descobrimos que o conteúdo de exossomos variaram muito, dependendo do estado GIPC. Em apoio da robustez e sensibilidade dos nossos métodos de análise, os dados proteómica confirmou a ausência de proteína GIPC em exossomas isolados a partir das células deficientes GIPC mas não nas amostras de controlo. Isto também demonstraram, pela primeira vez, a presença de GIPC em exossomas. Além disso, a análise proteomic dos exossomas isolados a partir das células estáveis ​​PANC-1 revelou um enriquecimento significativo de genes envolvidos na resistência à droga (dados não mostrados).