Abstract

Fundo

Evidência implicado o significado diagnóstico de microRNAs em sedimentos de urina /urina total no carcinoma urotelial da bexiga (UCB). No entanto, as células de sangue contaminado em pacientes com haematouria alterou significativamente o perfil de microRNA urinária de expressão, influenciando a precisão do teste.

Métodos

perfis de microRNA dos sobrenadantes de urina de pacientes e controles UCB, sem qualquer malignidade e perfis de tecidos normais e malignos da mucosa correspondentes dos pacientes foram determinados por microARN microarray e comparados para identificar microARNs expressos diferencialmente. A expressão diferencial foi verificada nos tecidos de um doente coorte independente por RT-qPCR. O significado diagnóstico de microRNAs selecionados como biomarcadores no sobrenadante de urina foi investigada nas coortes expandidas.

Resultados

MicroRNA-99a e microRNA-125b foram regulados negativamente nos sobrenadantes de urina de pacientes UCB . O grau de diminuição da regulação foi associada com o grau do tumor. Um modelo de diagnóstico foi desenvolvido usando um índice combinado dos níveis de microARN-99A e microARN-125b no sobrenadante de urina, com uma sensibilidade de 86,7%, uma especificidade de 81,1% e um valor previsto positivo (PPV) de 91,8%. Discriminando entre alta e baixa qualidade UCB, o modelo usando o nível de microRNA-125b sozinho exibiu uma sensibilidade de 81,4%, uma especificidade de 87,0% e VPP de 93,4%.

Conclusões

os resultados revelaram uma assinatura de expressão microARN única nos sobrenadantes de urina de pacientes de SCU para o desenvolvimento de testes de diagnóstico molecular. Um modelo baseado em microRNA urinário livre de células eficaz foi desenvolvido utilizando um índice combinado dos níveis de microRNA-99a e microRNA-125b para detectar UCB com bom poder de discriminação, alta sensibilidade e especificidade

Citation:. Zhang DZ, Lau KM, Chan ESY, Wang L, Szeto CC, K Wong, et ai. (2014)-Free Cell urinária MicroRNA-99a e MicroRNA-125b são marcadores de diagnóstico para o rastreio não-invasiva de cancro da bexiga. PLoS ONE 9 (7): e100793. doi: 10.1371 /journal.pone.0100793

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de fevereiro de 2014; Aceito: 29 de maio de 2014; Publicação: 11 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela subvenção directa para a Investigação (2009.1.096), da Universidade chinesa de Hong Kong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma urotelial da bexiga (UCB) é o segundo tumor maligno mais comum no sistema urinário [1]. Devido à sua alta incidência e recorrência frequente, ferramentas de monitoramento de diagnóstico e doenças eficazes são essenciais para a gestão clínica dos pacientes. Cistoscopia é atualmente o teste clínico padrão para o diagnóstico e vigilância de câncer. No entanto, o procedimento é invasivo e desagradável, e tem várias limitações práticas. Por exemplo, pode não ser capaz de detectar pequenos tumores e /ou planas como carcinoma

in situ

. Portanto, é necessária uma abordagem alternativa não invasiva que exibe elevada especificidade e sensibilidade. Embora muitos biomarcadores Sangue e baseados em urina foram identificadas e avaliadas na literatura, nenhum foi ideal e poderoso o suficiente para substituir cistoscopia [2].

Os microRNAs, que são pequenos RNAs não-codificantes, tem recentemente demonstraram um valor de diagnóstico e de prognóstico significativo em vários tipos de cancro [3] – [5]. MicroRNAs apresentam uma elevada estabilidade e fácil detectabilidade mesmo a baixos níveis em vários tipos de amostras clínicas [6] – [8]. Considera-se um excelente biomarcador doença para a detecção e monitorização. Um estudo demonstrou que uma série de microRNAs foram expressas de forma aberrante em tecidos tumorais UCB e que estas aberrações poderiam estar envolvidos no diagnóstico e estadiamento de biópsias de câncer de bexiga [9]. Além disso, a avaliação dos níveis desses microRNAs expressos de maneira aberrante que mostram assinaturas únicas na urina total ou células de urina esfoliada é ainda mais promissor para o diagnóstico e doença vigilância da UCB [10] – [11]. No entanto, os resultados são por vezes pouco fiáveis ​​no estudo de pacientes com hematúria, nos quais as células do sangue contaminados alterar significativamente os perfis de microRNA urinário e, assim, mascarar as assinaturas. De facto, 85% dos pacientes apresentam diferentes graus de hematúria [12] – [13]. Como resultado, é necessária uma abordagem alternativa para microARNs medição. As evidências têm sugerido que os ácidos nucleicos livres, tais como biomarcadores de ADN em sobrenadantes de urina, proporcionam uma taxa de detecção mais alta e uma maior sensibilidade do que os sedimentos para o diagnóstico UCB [14] – [16]. Assim, a avaliação dos níveis de microARNs em sobrenadante de urina pode melhorar a utilização de microARNs como biomarcadores de diagnóstico para a detecção de UCB, especialmente em pacientes com hematúria. Neste estudo, a viabilidade do uso microRNAs urinário livre de células para o diagnóstico da UCB foi determinada e modelos para diagnosticar UCB e graus tumorais discriminantes foram desenvolvidos.

Métodos

Pacientes e amostras

Uma visão geral deste estudo é mostrado na Figura S1. Com o consentimento por escrito dos doadores e a aprovação da Universidade Joint Chinesa de Hong Kong – Comitê de Ética em Pesquisa Clínica New Cluster Territórios Oriente, amostras de tecido e de urina foram coletadas na Unidade de Urologia do Departamento de Cirurgia, Hospital Príncipe de Gales, Hong Kong . Mid-stream urina foi coletada de pacientes com cancro da bexiga antes da cirurgia. Tanto o tecido tumoral e normal de mucosa da bexiga localizado 3 cm de distância a partir do bordo do tumor foram obtidas por cistoscopia. O diagnóstico 1973 OMS e sistema de classificação de cancro da bexiga [17] foi utilizado para o diagnóstico. Para os controles normais, amostras de urina foram coletadas de pacientes que tiveram resultados cistoscópicas normais, ausência de doenças malignas com a 6 meses de acompanhamento e hematúria. Todas as amostras de urina foram centrif usadas a 2500 r.c.f. durante 20 minutos e os sobrenadantes de urina foram colhidas.

MicroRNA microarray

O ARN total dos sobrenadantes de urina e tecido congelado foi extraído utilizando o Kit MirVanaPARIS (Ambion) de acordo com protocolos recomendados pelo fabricante . O Agilent humano miARN Microarray Chip (Release 13,0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, E.U.A.), que engloba 866 microARNs humanos e 89 microARNs virais, foi utilizado para o perfil de expressão destas microARNs nos sobrenadantes de urina e tecidos de cancro e de controlo. O conjunto de dados foi depositado ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) e o número de acesso é E-MTAB-2573. A intensidade do sinal de cada mancha foi mediana normalizada e ainda normalizado por regressão linear.

Inverter reacção em cadeia da polimerase de transcrição-quantitativa (RT-qPCR)

O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir do ARN total dos sobrenadantes de urina e amostras de tecido utilizando um estojo de síntese de ADNc universal (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O cDNA resultante foi sujeito a uma reacção de polimerase quantitativa cadeia (qPCR) com SYBR Green Master Mix e iniciador microARN LNA PCR (Exiqon) que especificamente reconhecido microRNA alvo de um jejum de um máquina de RT-qPCR ABI 7900HT (Applied Biosystem /Life Technologies, Grand Island , Nova Iorque, EUA). RNU6B foi utilizado como o controlo de referência. Todas as amostras foram testadas em duplicado. O nível relativo de microRNA foi determinada utilizando o

método q ΔΔC.

Métodos estatísticos

Os dados de microarranjos foram analisados ​​utilizando o software 11,0 Gene da Primavera (Agilent) para normalizar e identificar a diferencialmente microARNs expressas. ABI SDS 2.3 software (ABI /Life Technologies) foi usado para analisar os dados de RT-qPCR. Os dados quantitativos foram submetidos a um teste de Mann-Whitney U e o teste de Wilcoxon-Rank assinado utilizando o programa SPSS 16.0 (IBM Co, Armonk, Nova Iorque, E.U.A.). Na análise post-hoc subsequente, uma análise de regressão logística bivariada foi realizada para determinar o índice combinado (CI) para a combinação de dois níveis de expressão de microRNAs. Um receiver operating characteristic (ROC) análise da curva foi realizada utilizando o software SPSS 16.0. A sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, e razões de probabilidade positivas e negativas foram calculados.

Resultados

Identificação de microRNAs diferencialmente expressos entre os sobrenadantes de urina de pacientes UCB e controles e entre o câncer e tecidos normais por microRNA microarray

sobrenadantes de urina de seis pacientes UCB e três controles normais, juntamente com quatro pares de tecidos UCB e seus correspondentes tecidos da mucosa da bexiga normal foram submetidos à análise de microarray microRNA. As características dos pacientes são mostradas na Tabela 1. Para determinar a presença e a ausência de microARNs nas amostras, um sinal de limiar foi definido como o fundo média mais três desvios padrão. Os sinais acima deste limiar foram consideradas um “presença” e os sinais abaixo do limiar foram consideradas um “ausência”. Após a normalização global, 117 ± 63,8 para fora de 866 microARNs humanos foram detectadas nos sobrenadantes de urina e 314 ± 83,4 microARNs foram detectados na bexiga tecidos. Não houve diferença significativa no número total de microARNs detectados entre os sobrenadantes de urina de pacientes e controlos cancerosas e entre os tecidos de cancro e de controlo. Comparando os perfis nos sobrenadantes de urina dos pacientes de SCU com os dos controlos normais, 39 microARNs mostraram expressão diferencial (teste de Mann-Whitney, P 0,05; dobrar diferenças 1,60). Havia 78 microARNs diferencialmente expressos entre o cancro e tecidos normais (emparelhado teste de Mann-Whitney, P 0,05; dobram diferenças 2,0). Dez microARNs foram comumente desregulado em ambos os sobrenadantes de urina e amostras de tecido (Figura 1 e Figura S1). Destes, os níveis de microARN-1, microARN-99a, microARN-125b, 133a-microARN, microARN-133b, microRNA-143 e microARN-1207-5p diminuiu significativamente e os de microARN-16, 96 e microARN-microRNA- 183 aumentado nas amostras de SCU (Figura 1).

(a) mapa de calor dos níveis de 10 microARNs seleccionados em nove amostras de sobrenadante de urina e quatro pares de amostras de tecido. O ARN total foi extraído e submetido a análise de microarray utilizando um microARN microARN Microarray Chip Agilent humano. A intensidade do sinal de cada mancha foi mediana normalizada e ainda normalizado por regressão linear. As intensidades de sinal normalizado para cada microARN no sobrenadante de urina e amostras de tecido de pacientes e controles são apresentados UCB. parcelas (B) de dispersão das sensibilidades sinal normalizado dos 10 microRNAs selecionados. Um teste de Mann-Whitney foi conduzida para comparar os níveis de microARNs no sobrenadante de urina de pacientes de SCU (TU) (n = 6) e controlos (TG) (n = 3), e foi conduzida uma emparelhado teste de Mann-Whitney U. comparar os tumores (TT) (n = 4) e os seus tecidos de mucosa normal correspondente (NT) (n = 4) em pacientes UCB. Um nível de significância de 0,01 foi usado para todas as comparações. Asteriscos (*) indicam uma diferença estatisticamente significativa (p 0,01).

Validação dos 10 microRNAs selecionados em coortes independentes de amostras de tecido e sobrenadante de urina

Para validar os resultados de microarray, os níveis dos 10 microARNs seleccionados foram quantificados por RT-qPCR em mais de 18 pares de cancro da bexiga e tecidos de mucosa normal correspondente (Tabela 1). Destes, a expressão diferencial de seis microARNs entre o cancro e tecidos normais foi validado (Wilcoxon Signed Rank Test dois-amostras relacionadas, p 0,05) (Figura 2). MicroRNA-1 foi regulada para baixo em todos os 18 pares de tecidos de câncer (p 0,01) e 17 dos 18 pares mostrou a regulação negativa (p 0,01) nos restantes cinco microRNAs (microRNA-99A, microRNA-125b, microRNA- 133a, microRNA-133b e microRNA-143). MicroRNA-1, microRNA-99a, microRNA-125b, microRNA-133a, microRNA-133b e microRNA-143 foram regulados negativamente 266,87 ± 2,06, 130,69 ± 2,30, 49,52 ± 3,39, 263,20 ± 1,99, 261,38 ± 2,11 e 67,18 ± 1,83 vezes nos tecidos de câncer, respectivamente.

O RNA total foi extraído de 18 pares de tecidos de cancro da bexiga e seus correspondentes tecidos mucosa normal adjacente. Os níveis destes microARNs foram quantificados por RT-qPCR em duplicado. Os níveis de expressão relativos (2-ΔCq) são apresentados. Um emparelhado teste de Mann-Whitney foi conduzida para comparar os tumores e os seus tecidos de mucosa normal correspondente em pacientes UCB. Colunas, meios; Bares, D.P. .; n = 18. ** indica p . 0.001

O poder de discriminação dos seis microRNAs validados nos sobrenadantes de urina foi então avaliada utilizando 71 amostras de urina sobrenadante, incluindo 50 amostras de pacientes com cancro da bexiga (15 casos de câncer de baixo grau e 35 casos de câncer de alto grau) e 21 amostras de controles (Tabela 1). Neste expandido conjunto de amostras, os sobrenadantes de urina dos pacientes de SCU possuíam níveis inferiores de microARN-99a (p 0,01), microARN-125b (p 0,01), microARN-133b (p 0,05) e microARN-143 (p . 0,01) do que a dos controlos (Figura 3A), mas não de microARN-133a e microARN-1