Abstract

As células cancerosas apresentam alterações notáveis ​​no metabolismo celular, particularmente em sua preferência substrato nutriente. Concebemos vários métodos experimentais que analisar rapidamente o fluxo metabólico substrato em células cancerosas: a glicólise e a oxidação da glicose grande substratos de combustível, glutamina, e ácidos gordos. Usando o analisador XF Extracelular Flux, estes métodos de medida, em tempo real, a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) de células vivas em uma microplaca, como eles respondem a substratos e agentes de perturbação metabólicas. Em experiências de prova de princípio, analisamos fluxo substrato e bioenergética mitocondrial de duas linhas de células de glioblastoma humanas, e SF188s SF188f, que foram derivados a partir da mesma linha de células parental, mas proliferam a taxas lentas e rápidas, respectivamente. Estas análises levaram a três observações interessantes: 1) ambas as linhas celulares respirado eficazmente com substancial respiração substrato endógeno; 2) células SF188f sofreu uma mudança significativa de glicolítico para metabolismo oxidativo, juntamente com uma elevada taxa de oxidação em relação a células glutamina SF188s; e 3) a respiração de protões vazamento ligada mitocondrial de células SF188f aumentou significativamente em comparação com as células SF188s. É plausível que o vazamento de protões das células SF188f pode desempenhar um papel na permitindo TCA anaplerotic fluxo ciclo alimentada-glutamina contínua de desacoplamento parcial do ciclo do TCA da fosforilação oxidativa. Tomados em conjunto, estes métodos de análise rápido, sensível e fluxo de substrato de alto rendimento introduzir abordagens altamente valiosas para o desenvolvimento de uma maior compreensão das vias genéticas e epigenéticas que regulam o metabolismo celular, e o desenvolvimento de terapias que visem metabolismo do câncer.

citação: Pike Winer LS, Wu M (2014) análise rápida de Glicosidases e oxidativo Substrato Flux de células cancerosas em uma microplaca. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10.1371 /journal.pone.0109916

editor: Robert W. Sobol, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de agosto de 2013; Aceito: 01 de setembro de 2014; Publicação: 31 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pike Winer, Wu. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi realizado em e financiado pela Seahorse Bioscience. LSPW é um empregado e MW era um empregado no momento do trabalho na empresa. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Lisa S. Pike Winer é um funcionário em Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, EUA. Min Wu era um funcionário da Seahorse Bioscience no momento deste trabalho, North Billerica, MA, EUA. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

As células cancerosas reprogramar significativamente o seu metabolismo para impulsionar o crescimento do tumor e sobrevivência. Otto Warburg observada pela primeira vez que, sob condições aeróbias, os tumores tinham taxas elevadas de glicólise comparada com a do tecido circundante, um fenómeno conhecido como o efeito de Warburg, ou glicólise aeróbica [1]. Ele postulou que o aumento da glicólise e respiração mitocôndrias prejudicada é a principal causa de câncer [2]. Mais recentemente, um grande corpo de evidência indica que as células de cancro submetidos a reprogramação metabólica, levando a extensa utilização de dependência e glucose ou glutamina para o seu crescimento e sobrevivência [3] – [9]. Esta reprogramação metabólica foi demonstrado que é o resultado da activação e /ou perda das funções supressoras de tumor oncogene, bem como em resposta a sugestões ambientais, todos os quais regulam a absorção de nutrientes e metabolismo de substrato [10] – [14]. Dependendo das combinações desses fatores e um determinado contexto celular, as células cancerosas podem se manifestar uma variedade de fenótipos metabólicos [15], o que pode afetar tanto a seleção do tratamento ou resposta ao tratamento.

Na opinião de numerosos tipos de geneticamente e as células cancerosas metabolicamente diferentes, um rápido, informativo, relativamente fácil de executar e análise de alto rendimento substrato fluxo pode facilitar uma maior compreensão dos caminhos genéticos e epigenéticos que regulam o metabolismo da célula cancerosa, determinar se existe um número finito de fenótipos metabólicos . Entre todos os tipos de células cancerosas, independente da origem do tecido e agentes descobrem que têm como alvo vias metabólicas específicas para o tratamento do câncer

células produzir ATP através de duas vias principais produtores de energia: a glicólise e fosforilação oxidativa. A via glicolítica converte a glicose em piruvato. Um destino do piruvato em lactato é a redução no citosol de uma reacção bioquímica independente de oxigénio resultando na produção de ATP e produção de protões líquido. Os protões são bombeados para fora da célula através de vários mecanismos para manter o pH intracelular [16] e o efluxo dos protões para o espaço extracelular ou meio que circunda as células provoca a acidificação extracelular [17] – [21]. A principal substratos nutrientes glicose, glutamina e ácidos graxos pode ser completamente oxidado a em CO

2 e H

2O através do ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo TCA), que exige a cadeia de transporte de elétrons (ETC) nas mitocôndrias usando oxigénio como aceitador terminal de electrões, e que é acoplado a produção de ATP pela fosforilação oxidativa. O CO

2 produzido pode ser convertido em bicarbonato e protões como catalisada por anidrase carbólico [16], outra fonte de protões que causam uma acidificação do meio. Em muitas células diferenciadas não transformadas, tais como neurónios, fosforilação oxidativa produz a maior parte do ATP celular. Em contraste, as células cancerígenas dependem fortemente de glicólise, além de fosforilação oxidativa para a sua produção de ATP [22]. Como bem como fomentadoras da produção do ATP, glucose e glutamina são fontes de carbono essenciais que proporcionam precursores anabólicos, alguns dos quais (por exemplo, citrato e oxaloacetato) são produzidos através de um ciclo de TCA truncada para a biossíntese de lípidos, ácidos nucleicos e aminoácidos.

Uma vez que as células vivas não armazenar ATP, eles produzi-lo continuamente e sob demanda, e, portanto, constantemente consumir substratos oxigênio e combustível. Assim, a procura de ATP nas células (isto é, a disponibilidade ADP) controla a taxa de consumo de oxigénio. Elétrons (energia) armazenados em substratos nutrientes são extraídos através das reações de ciclo TCA mitocondriais e levado pelos transportadores de elétrons reduzidas NADH e FADH

2 ao ETC. À medida que os electrões fluem para baixo ao ETC, a energia libertada é usado para bombear protões a partir da matriz para dentro do espaço intramembranar, formando um gradiente de protões electroquímico transmembranar através da membrana interna mitocondrial. No final da ETC, os electrões são transferidos para o oxigénio molecular, reduzindo-o a água através do terminal da oxidase do citocromo C. Como protões retornar para a matriz mitocondrial por meio do complexo de ATP sintase, a energia armazenada no gradiente de protões, em seguida, dirige a fosforilação de ADP em ATP acoplamento respiração (transporte de electrões) com a produção de ATP. A fosforilação oxidativa, no entanto, não é completamente acoplada à respiração. Protões também pode voltar a introduzir a matriz por meio de canais de protões tais como desacoplamento proteínas (UCP), que estão localizados na membrana interna, contornando ATP sintase e dissipa o gradiente de energia, sem a produção de ATP, num processo conhecido como vazamento de protões. espécies de oxigénio parcialmente reduzido (ROS), tais como o anião superóxido pode ser produzida em diferentes locais do ETC dependendo das condições de [23]; o vazamento de prótons tem sido considerada um importante mecanismo celular para proteger as células dos danos oxidativos através da redução ROS produzidos pela ETC [24].

Dada a ligação entre o consumo de oxigênio ea acidificação extracelular com o metabolismo do substrato nutriente, aumento do consumo de oxigênio é uma medida da oxidação do substrato quando um substrato é adicionado às células. Da mesma forma, um aumento na taxa de acidificação extracelular após a adição de glicose é uma medida de fluxo glicolítico.

Vários métodos experimentais tradicionais que analisam o metabolismo substrato têm contribuído para a compreensão atual do metabolismo celular. Estes incluem a medição da acumulação de produtos finais de radiomarcadores, tais como H

2O e CO

2 metabolizado a partir de substratos, tais como ácidos gordos marcados

3H, glicose marcada e

14C. Outros métodos anteriormente utilizados (e mais recentemente desenvolvidos) para quantificar os metabolitos são marcadores de isótopos estáveis ​​em conjunto com espectrometria de massa e análise de RMN, ambos os quais produziram a informação detalhada sobre o metabolismo do substrato. Estas técnicas, no entanto, pode no entanto ser trabalhoso e complicado, e /ou relativamente inacessível para muitos laboratórios.

Este estudo teve dois objetivos principais. O primeiro foi a aplicar os princípios descritos acima para estabelecer uma série de métodos rápidos e fáceis de analisar o fluxo e oxidativa fluxo substrato glycolytic das células cancerosas. Isto foi conseguido medindo a taxa de consumo de oxigénio celular e acidificação extracelular utilizando o analisador XF Extracelular Fluxo [22]. O segundo foi a realização de prova de princípio experiências através da aplicação desses métodos de fluxo de substrato, juntamente com a análise bioenergética mitocondrial em células de glioblastoma SF188s humanos e SF188f para interrogar suas redes metabólicas.

Materiais e Métodos

Reagentes

carbonílico cianeto de 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP), mixotiazol, antimicina A, rotenona, 2-desoxiglucose, oxamato, aminooxyacetate, glucose, piruvato de sódio e palmitato de sódio foram obtidos de Sigma (St. Louis , MO, EUA). L-glutamina foi obtido a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). A oligomicina foi obtido da Merck (San Diego, CA, EUA). Albumina de Soro Bovino fracção V (ácido gordo de ultra-livre) foi obtido a partir de Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, EUA). Todos os compostos e o meio foram preparados de acordo com as instruções dos fabricantes a menos que indicado de outra forma.

linhas de células e cultura de células

células SF188 de glioblastoma humano foram obtidos a partir da Universidade da Califórnia em São Francisco Cérebro Banco de Tecidos . Estas células foram originalmente mantida, tal como recomendado pelo originador, num meio MEM contendo glicose 5,5 mM e 2 mM de L-glutamina. Eles foram adaptados passo a passo para meio DMEM contendo glucose 25 mM e 6 mM de L-glutamina como um sistema modelo para o estudo do metabolismo de glutamina como relatado [6]. Como um controlo, as células parentais foram também adaptados em paralelo com meio DMEM contendo glucose 5,5 mM e 2 mM de L-glutamina. O ex adquiriu uma taxa de crescimento muito mais rápido após 4 semanas de cultura no meio e foi nomeado SF188f (rápido). Este último, no entanto, manteve as taxas de crescimento semelhantes às células parentais mantidas em MEM e foram nomeados SF188s (lento). Para manter o seu fenótipo de crescimento distinta, células SF188s e SF188f foram sempre cultivadas em DMEM contendo 5,5 mM de glucose e 2 mM de L-glutamina e 25 mM de glicose e 6 mM de L-glutamina, respectivamente a 37 ° C num incubador Forma com 10% de CO

2 e 100% de umidade em ~ 80% de confluência em 175 cm

2 frascos-T (Corning). células HeLa humanas do cancro da próstata PC-3 e de cancro do colo do útero foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), e foram mantidas em RMPI1640. Todos os meios de cultura celular foram suplementados com 10% de albumina de bovino fetal (FBS, Hyclone, Logan, UT, EUA).

meio de ensaio

XF

Um meio de base foi utilizada para os ensaios descritos no presente estudo directamente ou suplementado com substratos e cofactores, tal como especificado em cada um dos ensaios específicos (ver abaixo) e para cada experimento. O meio de ensaio de base foi preparado como se segue. Médium (DMEM) pó de Eagle Modificado por Dulbecco (Sigma, número de catálogo D5030) foi o material de partida. Não contém glucose, L-glutamina, piruvato de sódio, bicarbonato de sódio, ou vermelho de fenol, e tem um baixo fosfato (ver Materiais S1 no ficheiro S1for detalhes de preparação). Além disso, um tampão modificado de Krebs-bicarbonato Henseleit- (KHB) que não contém bicarbonato e fosfato inferior também podem ser utilizados (Materiais S2 no ficheiro S1) como um meio de ensaio alternativo para a oxidação dos ácidos gordos. A utilização de tampão livre de aminoácido, em oposição ao meio de base para outros ensaios é possível, mas, pode resultar em resultados experimentais diferentes, que podem exigir diferentes interpretações de dados. Todos os ensaios aqui descritos foram realizados exclusivamente no meio de base com a suplementação indicado, com a excepção de a oxidação dos ácidos gordos, que foi realizada em forma tanto de base e KHB, obtendo-se resultados semelhantes.

Preparação de palmitato de BSA-conjugado

palmitato de sódio foi solubilizado aquecendo-a a 68 ° C em solução de cloreto de sódio 150 mM. Ele foi, em seguida, ligado a BSA em solução, a proporção molar de 6:01. O protocolo completo é descrito no material S3 em S1 Arquivo.

A medição da taxa de consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular

OCR e eCar medições foram realizadas utilizando o analisador XF24 ou XF96 Extracelular Flux (Seahorse Bioscience , North Billerica, MA) como descrito [22]. Resumidamente, as células foram plaqueadas em XF24 (V7) ou placas de cultura de células XF96 (V3) de poliestireno (cavalo marinho Bioscience, North Billerica). SF188s células foram semeadas a 30.000 /poço (placa XF24) ou 20.000 /poço (placa XF96) e células SF188f a 20.000 /poço (placa XF24) ou 15.000 /poço (placa XF96), respectivamente. As células PC-3 e HeLa foram plaqueadas a 25.000 e 30.000 células por poço, respectivamente, em placas de cultura de células XF24. As células foram incubadas durante 24 a 28 horas numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora com 10% de CO

2 (meio DMEM) ou 5% de CO

2 (meio MEM e RMPI1640), respectivamente. Uma vez que as duas linhas de células proliferam em diferentes taxas durante o período de incubação de 24-28 horas, as células SF188s e SF188f foram tratadas com tripsina e, em seguida, contadas para determinar o número de células em cada poço após um ensaio. Estas contagens de células foram usadas para normalizar qualquer OCR ou ECAR. As viabilidades, tal como determinado após ensaios, foram quase indistinguíveis independentemente da presença ou ausência de substratos exógenos ou inibidores metabólicos no meio de ensaio. Antes da realização de um ensaio, o meio de crescimento nas cavidades de uma placa de células XF foi trocado com o meio de ensaio adequado para conseguir um mínimo de 1:1000 diluição de meio de crescimento. 600 uL (XF24) ou 150 ul (XF96) no meio de ensaio foi adicionado às células por um ensaio XF. Enquanto sensores cartuchos foram calibrados, placas de células foram incubadas num

2 incubadora a 37 ° C /não-CO durante 60 minutos antes do início de um ensaio. Todas as experiências foram realizadas a 37 ° C. Cada ciclo consistiu de medição de um tempo de mistura de 3 minutos e um período de aquisição de dados de 3 minutos (13 pontos de dados) para o XF24, e 2 min e 4 min para o XF96. OCR e eCar pontos de dados referem-se às taxas médias durante os ciclos de medição. Todos os compostos foram preparadas em concentrações apropriadas em meio de ensaio desejada e ajustada a pH 7,4. Um volume de 75 uL para XF24 (25 uL para XF96) do composto foi adicionado a cada orifício de injecção. Numa experiência típica, 3 medições da linha de base foram realizadas antes da adição de qualquer composto, e 3 medições de resposta foram tomadas após a adição de cada composto. OCR e ECAR foram relatados como taxas absolutas (pmol /min para o OCR e mph /min para ECAR) ou normalizado contra as contagens de células, ou expressos como uma percentagem do consumo de oxigénio basal. Neste estudo, a linha de base ou OCR ECAR (um termo técnico) refere-se as taxas de partida antes da adição de um agente, que podem ser utilizados para comparações com essas taxas após a adição. Em contraste, o OCR basal ou ECAR (um termo biológico) refere-se a OCR ou ECAR que ocorrem em células em repouso, a fim de manter a função da célula base. A menos que especificado de outro modo, a terceira medição de linha de base ou após a adição de cada substrato ou composto foi utilizado para gerar valores de OCR ou ECAR absolutos. Assim, a porcentagem dos valores de OCR de linha de base foi calculada como OCR na terceira medição após uma injeção do agente dividido pelo OCR imediatamente antes da injeção. Cada dado foi determinado minimamente em triplicado.

XF Substrato Condições ensaio de fluxo

fluxo glicolítico e capacidade glicolítica.

O meio de ensaio consiste no meio base suplementado com mM L 2 -glutamina. A glutamina é necessária para atingir a taxa máxima glicólise para algumas, mas não todas as linhas celulares. O mesmo meio foi usado para determinar a capacidade glicolítica. A concentração de glucose adicionado para iniciar a glicólise e medir a capacidade glicolítica foi de 10 mM, maior do que o ponto de saturação em ambas as condições.

oxidação da glicose.

O meio de ensaio foi o meio de base sem qualquer exógena suplementação de substrato de combustível. A concentração de glicose adicionada para iniciar a oxidação da glucose foi de 10 mM, que foi determinada em experiências preliminares para estar acima da saturação.

oxidação Glutamina.

O meio de ensaio foi o meio de base, sem qualquer combustível exógeno substrato. A concentração de glutamina adicionada às células para iniciar a oxidação foi glutamina 4 mM, que foi também pré-determinada para ser acima da saturação.

gordos oxidação de ácidos.

O meio de ensaio foi o meio de base (ou KHB) suplementado com glucose 5,5 mM e 50 pM carnitina (necessário para o transporte de ácidos gordos de cadeia longa para as mitocôndrias). ácidos graxos testados incluem cadeia longa palmitato de ácido graxo, médio octanoato de ácidos graxos de cadeia e cadeia curta butirato de ácidos graxos. Eles foram tituladas para as concentrações de estimulação da resposta máxima de OCR. A concentração de trabalho de palmitato conjugado com BSA foi de 150 mM, e octanoato de 1 mM, que também foram acima da saturação.

É fundamental que as condições de ensaio acima são rigorosamente respeitados. Qualquer variação na composição do meio de ensaio pode resultar em diferentes interpretações e insights sobre rede metabólica celular. Concentrações de saturação do substrato e concentrações do composto óptimos foram determinados através da realização de experiências de titulação como descrito em Materiais S4 e S5 S1 no ficheiro. O efeito das condições de ensaio sobre a interpretação dos resultados experimentais será descrita em outro lugar.

contagem de células

células

SF188s e SF188f foram destacadas com tripsina-EDTA e colhidas imediatamente após um ensaio XF. O número de células em cada poço foi determinada utilizando um contador de azul de tripano ViCell automatizado (Beckman-Coulter, Fullerton, CA), e foi utilizado para normalizar OCR e ECAR como indicado nas legendas das figuras.

A análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão, com pelo menos três replicados utilizados para cada ponto de dados. Salvo indicação em contrário, uma emparelhado

t

teste foi realizado para cada grupo experimental para avaliar a significância estatística contra respectivos controles.

Resultados

glicólise e glycolytic capacidade

de Student

Demonstrámos previamente que as contas de glicólise para ~ 80% de ECAR total num número de células de cancro, tal como determinado através de dois métodos: a) a remoção de glucose a partir do meio de ensaio e b) adição de inibidores da via glicolítica tal como hexoquinase inibidor 2- DG e lactato desidrogenase (LDH) inibidor oxamato [22]. Os restantes 20% da ECAR pode ser atribuído a outros processos metabólicos, tais como o co ciclo TCA

2 evolução. A fim de medir a glicólise usando ECAR com mais precisão e facilidade, tomamos a seguinte abordagem. A glucose é adicionada às células que são incubadas num meio sem glucose, mas suplementado com glutamina (ver Materiais e Métodos). O aumento ECAR após a adição de glucose estabelece a taxa de glicólise. Uma adição subsequente de um inibidor da glicólise elimina o aumento ECAR induzida pela glicose. Qualquer acidificação devido a outros processos metabólicos, como o CO ciclo TCA

2 liberação (de qualquer substrato, mas glucose) é detectado como ECAR antes da glicose disso. A resposta à glicose OCR, monitorizado simultaneamente com ECAR, serve como um indicador do facto de glicose é também catabolizados pela respiração mitocondrial (Figura 1A).

. Ilustração esquemática da via glicolítica. NADH produzido no citosol como a glicose é convertida em piruvato e é regenerada por LDH no citosol. B. resposta cinética das células ECAR SF188s em glucose (10 mM) e 2-DG (100 mM) ou oxamato (100 mM), respectivamente. SF188s células foram colocadas em placas a 30.000 células /poço em placas de cultura de XF24 V7 celular 24-28 horas antes dos ensaios. O meio de ensaio era meio de base livre de substrato (tal como descrito em Material e Métodos) suplementado com glutamina 2 mM. O valor ECAR não foi normalizado. Uma experiência representativa de pelo menos três é mostrado aqui. Cada ponto de dados representa a média ± DP, n = 4. C. ECAR resposta de células HeLa em glucose (10 mM), 2-DG (100 mM) e antimicina (1 uM). Inserção: a resposta OCR nas mesmas experiências que mostram o efeito de Crabtree e que a glicose não aumentou OCR. As células HeLa foram plaqueadas a 30.000 /poço em placas de cultura de células XF24 24-28 horas antes dos ensaios. valores ECAR ou OCR não foram normalizados. O meio de ensaio era meio de base livre de substrato (tal como descrito em Material e Métodos) suplementado com glutamina 2 mM. Uma experiência representativa de pelo menos três é mostrado aqui. Cada ponto de dados representa a média ± SD, n = 5.

Foi realizado o experimento usando SF188s e células HeLa. Como mostrado na Figura 1B, a adição de glucose para células SF188s desencadeou um aumento instantâneo ECAR, 38 ± 4 mph /min (ECAR de medição 6 menos que de medição 3), o qual foi subsequentemente abolida pela adição de inibidores de glicólise, quer 2-DG ou oxamato. Esta experiência indicou que exogenamente adicionada de glucose foi dividido em lactato (LDH por causa inibição oxamato ECAR reduz de modo semelhante a 2-DG), causando um aumento ECAR e validando assim a concepção experimental. Resultados semelhantes foram obtidos em células HeLa (Fig 1C.), que eram consistentes com o nosso estudo anterior [22], bem como com um número de relatórios recentes que mostram que a resposta ECAR paralelo ao da produção de lactato [25] – [27]. Antes da adição de glucose para as células, bem como após a adição de 2-DG ou oxamato, novamente observada uma pequena ECAR, 6 ± 1 mph /min e 10 ± 2 mph /min (a medição 3), respectivamente, em SF188s e células HeLa (Figura 1B e C). Referimo-nos a esta pequena, mas mensurável ECAR como a acidificação não glycolytic. A resposta OCR indicou que a injecção de glicose não só não conseguiu desencadear um aumento, mas, de facto, causou uma ligeira diminuição em OCR (Figura 1C), o qual é semelhante ao efeito de Crabtree, observada pela primeira vez em células tumorais por Crabtree em 1920 [ ,,,0],28].

as duas fontes de protões mais significativos que podem contribuir para a acidificação não glycolytic são o ciclo TCA e quebra do glicogênio intracelular, ou seja, a glicogenólise [20]. Para determinar a contribuição do CO ciclo TCA evolução

2, foi utilizado um complexo antimicina inibidor III para parar o fluxo de elétrons e, portanto, o fluxo ciclo TCA em células HeLa. Glucose foi adicionado primeiro a iniciar a glicólise, seguido por 2-DG aboli-la, deixando para trás ECAR não glycolytic. A adição final de antimicina parou o ciclo TCA de produção de CO

2. Embora um resíduo permaneceu, 4 ± 1,4 mph /min, antimicina eliminado cerca de metade do ECAR não glicolítica (Figura 1C), confirmando a contribuição de CO ciclo TCA de protões

2-derivado para a acidificação não glicolítica. Testou-se a ECAR antimicina-resistente foi devido a glicogenólise usando CP91149, um inibidor da fosforilase de glicogênio (a primeira enzima da quebra de glicogênio), mas não se observou nenhum efeito significativo de CP91149 na acidificação não glycolytic (dados não mostrados) , levando-nos a concluir que o ECAR não glicolítica residual teve de ser explicados por outros processos metabólicos, tais como reacções de descarboxilação catalisada pela glucose-6-fosfato desidrogenase e /ou piruvato desidrogenase. Em conjunto, esses resultados novamente confirmado que as contas glicólise para a maioria dos ECAR observado em células cancerosas, e estabeleceu que derivados do TCA CO

2 é um contribuinte principal da acidificação não glycolytic.

fluxo glicolítico determinada

in vitro

em níveis de oxigênio ambiente reflete taxa de glicólise basal. Quando as células experimentam perda de produção de ATP mitocondrial devido à inibição da fosforilação oxidativa, tanto a baixa tensão de oxigénio ou por oligomicina, eles aumentam o seu fluxo glicolítico e tornar mais ATP a partir de vias glicolíticas para manter a homeostase celular de ATP [22]. Referimo-nos a este aumento do fluxo glicolítico em resposta à deficiência na produção de ATP mitocondrial como capacidade glicolítica. Experimentalmente, definimos capacidade glicolítica como a ECAR induzida por glicose pelo oligomicina inibidor da ATP sintase mitocondrial.

Para determinar tanto fluxo glicolítico e capacidade glicolítica da mesma população de células em um experimento, medimos ECAR enquanto consecutivamente injecção de glicose, oligomicina, e 2-DG. Como mostrado na Figura 2A, a adição de glucose para células HeLa, tal como esperado, provocou um fluxo glicolítico de 19 ± 0,9 mph /min (EACR na medição 6 que pelo menos três medições) em células HeLa. A adição subsequente de oligomicina causou um aumento adicional em ECAR a 44 ± 3,8 mph /min (ECAR em medição 9 em que menos de medição 3), indicando um elevado fluxo de glucose em relação lactato e revelando a capacidade glicolítica de células HeLa. A adição final da glicólise inibidor 2-DG aboliu a glicólise global (Figura 2A). O fluxo glicolítico calculada e capacidade glicolítica do experimento glicólise são apresentados na Figura 2B.

. ECAR resposta cinética das células HeLa em glucose (10 mM), oligomicina (2 uM), e 2-DG (100 mM). Inserir mostra a resposta de OCR em resposta à glicose e oligomicina. As células HeLa foram plaqueadas a 30.000 /poço em placas de cultura de XF24 V7 celular 24-28 horas antes dos ensaios. O meio de ensaio foi o meio de base livre de substrato suplementado com glutamina 2 mM. valores ECAR ou OCR não foram normalizados. Uma experiência representativa de pelo 5 é mostrada aqui. Cada ponto de dados representa a média ± DP, n = 4. B. Calculado fluxo glicolítico, capacidade glicolítica. fluxo glicolítico é a diferença entre as eCars de medição 6 e medição 3. Da mesma forma, capacidade glicolítica descreve a diferença entre a ECAR de medição 9 e que de medição 3. * p . 0,05

Dois experimental condições devem ser atendidas no experimento acima. Em primeiro lugar, a concentração deve oligomicina maximamente inibem a respiração. Este objectivo foi alcançado seleccionando a concentração oligomicina que resultou na inibição OCR máxima num ensaio de titulação. Por exemplo, 0,5 uM oligomicina foi encontrado para ser suficiente para se conseguir uma inibição máxima de OCR em células HeLa (dados não mostrados). Em segundo lugar, é essencial para assegurar que o fornecimento de glucose exógena é saturação, permitindo que a maquinaria glicolítico para ser o factor limitante. A concentração de saturação de glucose para atingir a resposta ECAR máxima foi determinada numa experiência de titulação de concentração de glicose, em que as concentrações crescentes de glicose foram adicionados às células, seguindo-se a adição de controle ou oligomicina na concentração máxima que inibe a respiração. Em células HeLa, por exemplo, verificou-se que ECAR aumentou continuamente até que a concentração de glucose atingiu os 5 mM, após o que não houve mais aumento ECAR (Figura S1). Resultados semelhantes foram obtidos com uma dúzia de linhas celulares transformadas e não transformadas (dados não mostrados). Nós escolhemos uma concentração mais elevada do que a saturação de 10 mM como a concentração padrão para determinar tanto fluxo glicolítico e capacidade glicolítica.

oxidação da glicose

piruvato também pode entrar na mitocôndria, onde derivados de Glucose ele é convertido em acetil CoA desidrogenase de piruvato e entra no ciclo do TCA através da citrato sintase (ou como o oxaloacetato através piruvato carboxilase [29]. o radical acetilo é eventualmente oxidado a CO

2 e H

2O (Figura 3A) . O processo consumidor de oxigénio de oxidação de glicose para piruvato primeiro e, em seguida, a CO

2 e H

2O é referida aqui como a oxidação da glicose.

. ilustração esquemática do caminho bioquímico para a oxidação da glicose . o NADH produzido no citoplasma como a glicose é convertida em piruvato é importado para a mitocôndria através do shuttle malato-aspartato e regenerado através da ETC para manter a oxidação da glicose contínua. resposta B. Kinetic OCR de células PC-3 à glicose (10 mM ); C. OCR resposta à glucose (10 mM), oligomicina (1 uM) e FCCP (0,3 uM). Células PC-3 foram plaqueadas a 25.000 /poço em placas de cultura de XF24 V7. O meio de ensaio foi o meio de base livre de substrato. Os valores de OCR não foram normalizados. A experiência representativa em cada três é mostrado aqui. Cada ponto de dados representa a média ± SD, n = 4.

Experimentalmente, foi utilizado o OCR induzida pela glicose para medir a oxidação da glicose. A fim de estabelecer o ensaio de oxidação de glicose, escolhemos as células PC-3 que oxidam activamente glicose. Para determinar a oxidação da glucose, 10 mM de glucose foi adicionado às células em meio de ensaio não contendo qualquer glucose ou glutamina (ver Materiais e Métodos). Tal como mostrado na Figura 3B, a adição de glucose para células PC-3 causou um aumento imediato no OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR na medição 6 menor que a medição 3), indicando o fluxo de glucose no ciclo do TCA, e em última análise, , o ETC para a oxidação completa. Este projeto experimental proporcionou uma medição quantitativa da oxidação da glicose sob esta condição experimental. Em um design variante, as células PC-3 foram expostos à glicose, oligomicina e FCCP consecutivamente, com 3 medições antes de cada adição composto e após cada adição composto. FCCP desacopla a fosforilação oxidativa, o que permite a oxidação de qualquer substrato oxidável presente no meio de ensaio para ocorrer. Como mostrado na Figura 3C, FCCP estimulou um aumento nos OCR a seguir à adição de glucose, mas não o controlo, ainda confirmando que as vias bioquímicas para a oxidação da glucose eram activos em células PC-3. A resposta OCR para FCCP confirma e fornece uma avaliação semi-quantitativa da capacidade das células para oxidar glicose. Neste desenho experimental, as células foram pré-incubadas em meio base livre de substrato durante 60 minutos antes de um ensaio, para que haja uma possibilidade de que possam ter sido alterados e salientou a sua resposta à glucose de adição.