Abstract

Fundo

Fatores genéticos podem afetar o risco de progressão da infecção papilomavírus cancerígenos humanos (HPV), o agente etiológico para o cancro do colo do útero, a infecção persistente por HPV, e, portanto, a pré-câncer do colo do útero e câncer.

Metodologia /principais conclusões

Foram avaliados 18.310 tag polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) a partir de 1113 genes em 416 neoplasia intra-epitelial cervical 3 (CIN3) casos /câncer, 356 mulheres com infecção persistente cancerígeno HPV (persistência média de 25 meses) e 425 mulheres selecionadas aleatoriamente (não-casos e não-HPV persistente) do 10,049 mulheres da Guanacaste, Costa Rica HPV história natural coorte. Para gene e associações SNP, calculamos odds ratio ajustada por idade e p-tendência. Três comparações foram feitas: 1) associação com CIN3 /câncer (CIN3 comparação /casos de câncer aos controlos aleatórios), 2) associação com persistência (persistência do HPV em comparação com controlos aleatórios), e 3) progressão (CIN3 /cânceres em comparação com HPV-persistente grupo). Regiões estatisticamente significativamente associada com CIN3 /câncer incluídos genes para peroxiredoxina 3

PRDX3

, e proteína ribossômica S19

RPS19

. Os únicos SNPs mais significativos de cada gene associados com CIN3 /câncer foram

PRDX3

rs7082598 (

P

tendência 0,0001) e

RPS19

rs2305809 (

P

tendência = 0,0007), respectivamente. Ambos os SNPs também foram associados com a progressão.

Conclusões /Significado

Estes dados sugerem o envolvimento de dois genes,

RSP19

e

PRDX3

, ou outro SNPs em desequilíbrio de ligação, com o risco de câncer cervical. Outras investigações mostraram que eles podem ser envolvidos em ambas as fases de transição de persistência e de progressão. Nossos resultados requerem replicação, mas, se for verdade, sugerem um papel para a disfunção dos ribossomas, processos mitocondriais e /ou estresse oxidativo, ou outra função desconhecida desses genes na carcinogênese cervical

Citation:. Safaeian M, Hildesheim A, Gonzalez P, K Yu, Porras C, Q Li, et ai. (2012) Polimorfismos de Nucleotídeo Único no

PRDX3

e

RPS19 Comprar e Risco de HPV Persistência e do colo do útero pré-câncer /câncer. PLoS ONE 7 (4): e33619. doi: 10.1371 /journal.pone.0033619

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 06 de outubro de 2011; Aceito: 14 de fevereiro de 2012; Publicação: 09 de abril de 2012

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O estudo foi financiado pelo NCI intramural e do Gabinete NIH de Investigação em Saúde da Mulher. Os autores são gratos a Sabrina Chen do Serviços de Gestão da Informação, Inc. (IMS) para a gestão de dados e suporte de programação. Eles também são gratos a Amy Hutchinson e Belynda Hicks para a sua gestão desse esforço genotipagem no Centro de NCI Núcleo Genotipagem e por suas contribuições científicas para os esforços de investigação dos autores. Q. Li é parcialmente suportado pelo National Science Foundation Jovem da China No. 10901155. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses.: Laurie Burdette e Stephen J. Chanock são empregados pelo núcleo Genotipagem Facility (CGF), que está dentro da Division of Cancer Epidemiology and Genetics (DCEG) do Instituto Nacional do Câncer (NCI) e apoiado pela SAIC-Frederick Inc. Information Services Gestão, Inc. também apoiou este estudo, juntamente com Amy Hutchinson e Belynda Hicks com a sua gestão desse esforço genotipagem no Centro de NCI Núcleo genotipagem e por suas contribuições científicas para os esforços de investigação dos autores. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Embora seja bem conhecido que papilomavírus humano cancerígenos (HPVs) são os agentes causais de o cancro do colo do útero, infecções por HPV são extremamente comuns em relação à incidência de câncer raro, indicando que muitas infecções resolver espontaneamente [1], ou persistir sem progressão. Fatores genéticos podem desempenhar um papel na carcinogênese cervical e são pensados ​​para influenciar quem desenvolve a infecção persistente por HPV e, talvez, que ainda evolui para câncer [2] – [7]

O papel dos fatores genéticos do hospedeiro e outras co. -factors associados a cancro cervical são particularmente interessantes porque a patogénese gradual da doença tem sido extensivamente estudada. Desde o seu início através de infecção por HPV na zona de transformação do colo do útero, e os passos subsequentes relacionadas com persistência virai, a progressão para a pré-cancro, invasão e [1], as mesmas ou diferentes factores pode ser associada a cada passo para a patogénese. O papel dos co-fatores não-genéticos na persistência e progressão tem sido bem estudado, mas há menos estudos sobre o papel da genética do hospedeiro na patogênese do câncer cervical. Assim, os estudos genéticos de comparações suplemento do câncer do colo do útero de casos de câncer de não-câncer ou controles não infectados, investigando cada passo intermediário causal, infecção ou seja persistente e progressão para CIN3 /câncer.

Foram utilizados dados do bem- estudo de coorte caracterizada, longitudinal sobre HPV história natural (NHS) em Guanacaste, Costa Rica, e recentemente relataram resultados de um painel de 7.140 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) candidatos. Estes polimorfismos foram escolhidos para representar variação de 305 genes com base em

a priori

hipóteses de associação com a infecção pelo HPV e câncer cervical (reparo do DNA, infecção viral e vias de entrada da célula). Esse esforço identificou 8 genes potenciais associados com o cancro do colo do útero, incluindo os genes do sistema imunológico 2 ‘, 5’ de genes oligoadenilato sintetase 3 (

OAS3

) e sulfatase 1 (

SULF1

), ea displasia epidérmica verruciforme (EV) -associated

EVER1

e

EVER2

genes,

TMC6

e

TMC8

[

8

]. Temos agora relatar nossas descobertas sobre os 18,310 SNPs restantes (que cobrem 1.113 genes) que foram genotipados no mesmo chip iSelect. Estes SNPs adicionais foram selecionados com base em sua

a priori

relação hipotética com uma vasta gama de cancros, mas não especificamente com a persistência do HPV e câncer cervical. Estes genes foram seleccionados com base no esforço colectivo de numerosos investigadores do cancro e incluem genes em vários imune, citocinas e resposta inflamatória, a replicação do ADN e a diferenciação, a diferenciação de macrófagos, a sinalização do receptor de tipo Toll, e receptor de células T vias de sinalização, para citar alguns e, presumivelmente, têm menores probabilidades anteriores de associação com o câncer cervical do que aqueles estudados no relatório de Wang et al. [8]

Resultados

associações de base região do gene

A Tabela 1 mostra os resultados para 14 genes /regiões com p . 0,005 para a associação com qualquer doença (CIN3 /câncer versus controlos), a progressão da doença (CIN3 /câncer contra a persistência do HPV), ou infecção persistente (persistência do HPV versus controlos) (providenciado pelo valor de p para associações de doenças). Esta análise identificou 9 regiões de genes como estatisticamente significativamente associada com CIN3 /câncer em um p-valor de ≤0.005 (

PRDX3

valor-p 0,00015;

RPS1

9 p-valor 0,00045;

DDX1

p-valor 0,0006;

TELO2

p-valor 0,0009;

C1RL

valor-p 0,00165;

ILDR1

valor-p 0,00285;

THRAP4

p-valor 0,0037;

GDF10

valor-p 0,004; e

GDF2

valor-p 0,004). Duas regiões de genes foram identificados como estatisticamente significativamente associada com a progressão da doença em p-valor de ≤0.005 (

GC

p-valor 0,0004; e

IL2RA

valor-p 0,00115). Além disso, foram identificados 2 regiões de genes como significativamente associada com a persistência do HPV de tipo específico (

Tyms

p-valor 0,0015; e

EVPL

p-valor 0,0018). Dos genes identificados, a ser associado com CIN3 /cancro

RPS19

foi também associado com a progressão para CIN3 /cancro (p-valor 0,006). Da mesma forma, os genes associados com CIN3 /câncer,

C1RL

,

GDF10

, e

GDF2

também foram associados com persistência (P-valores de 0,00875, 0,0423, e 0,04080, respectivamente). Apenas dois dos genes –

PRDX3

e

RPS19, foram notáveis ​​com um FDR≤0.2 comparando CIN3 /cânceres de controlos aleatórios. Todos os resultados baseadas em genes são apresentados na Tabela S1.

associações baseadas em SNP

Seis SNPs em 6 genes identificados pela análise baseada em gene foram significativamente associados com CIN3 /câncer, progressão da doença, ou infecção por HPV oncogénico persistente (Tabela 2) na análise baseada no SNP. O

PRDX3

rs7082598 variantes alélicas menores foi estatisticamente associada a significativa diminuição do risco de câncer cervical em relação aos controles (OR

CT /TT = 0,41, 95% CI 0,30-0,58,

P

tendência foi observada 0,0001), e este efeito protector tanto para progressão (CIN3 + em comparação com o HPV-persistência) e HPV-persistência (persistentes em comparação com os controlos) (OU

CT /TT = CI 0,58, 95% 0,40 -0.83

P

tendência = 0,008 e 0,71, 95% CI 0,52-0,97,

P

tendência = 0,02, respectivamente). O

RPS19

rs2305809 T alelo também foi associado à diminuição do risco estatisticamente significativo de câncer cervical (OR

CT = 0,66, 95% CI 0,48-0,91; OR

TT = 0,43, 95% CI 0,28 -0,66,

P

tendência = 0,00007). Novo exame por etapas intermediárias mostrou que este efeito permaneceu por progressão de persistência para CIN3 + (OR

CT = 0,83, 95% CI 0,59-1,15; OR

TT = 0,51, 95% CI 0,33-0,78,

P

tendência = 0,003). Por último, o

IL2RA

rs2476491 T variante foi também associada a redução significativa do risco de câncer cervical (OR

AT /TT = 0,69, 95% CI 0,51-0,92,

P

tendência = 0,02). Esta associação foi mais forte para progressão de HPV-persistência para CIN3 + (OR

AT /TT = 0,53, 95% CI 0,39-0,71,

P

tendência = 0,00002).

alelos variantes em

TELO2

rs4786772 (OR

AG = 1,54, 95% CI 1,14-2,09; OR

GG = 2,51, 95% CI 1,59-3,94,

P

tendência = 0,00002),

C1RL

rs12227050 (OR

AG /GG = 2,85, 95% CI 1,71-4,74,

P

tendência = 0,0001 ), e

Tyms

rs2342700 (OR

CG = 1,56, 95% CI 1,17-2,09; OR

GG = 2,18, 95% CI 1,30-3,64,

P

tendência = 0,0002) foram associados com aumento significativo do risco de câncer cervical (Tabela 2). O aumento do risco de variantes para

TELO2

permaneceu por progressão de persistência para CIN3 +, enquanto que o aumento do risco de

C1RL

e

Tyms

permaneceram por persistência em relação aos controles aleatórios.

também foi realizada uma única análise estatística, incluindo todos os SNPs, e constatou que o SNP RS7082598 (

PRDX3

gene) apresentou significância nesta análise ao comparar CIN3 + vs. controlos aleatórios (p comparação múltipla ajustado -valor 0,011).

Discussão

Nesta análise dos genes e SNPs identificados a ser amplamente relevantes para a etiologia do câncer, mas não especificamente para carcinogênese cervical, encontramos 14 genes /regiões que foram significativamente associado com CIN3 /câncer em p 0,005. Dois desses genes –

RPS19

e

PRDX3 viajantes – foram notáveis ​​em um FDR≤0.2. Replicação destes resultados é garantido para eliminar o papel da descoberta casual.

Efeitos de fatores etiológicos genéticos putativos para o cancro do colo do útero pode ser mapeado para estados de transição específicos da infecção por HPV da zona de transformação cervical, progressão da cervical persistentemente infectados células pré-cancerosas e câncer invasivo. Neste estudo, tivemos a oportunidade de investigar e identificar genes que podem influenciar alguns desses estágios da carcinogênese cervical. Notamos que os efeitos protetores observados para

PRDX3

e

RPS19

SNPs permaneceu tanto para a progressão da doença (de infecção por HPV persistente com CIN3 +) e para HPV-persistência.

mutações do gene ribossomal

RPS19

têm sido associadas com anemia de Diamond-Blackfan (DBA), a qual é uma eritroblastopenia constitucional caracterizado por precursores eritróides ausentes ou diminuídos, num subconjunto de pacientes. Pacientes com DBA têm maior risco de osteossarcoma. Esta associação com DBA sugere uma possível função extra-ribossómico para este gene na diferenciação eritropoiética e a proliferação, em adição à sua função ribossómica. Em alguns carcinomas do cólon primários, maiores níveis de expressão deste gene tem sido observada em comparação com tecidos normais do cólon combinados [9].

PRDX3

está na família peroxiredoxina que codifica uma proteína com função antioxidante, está localizada na mitocôndria, e pode funcionar para proteger a mitocôndria de stress oxidativo. As comparações de sequências com os homólogos de mamífero clonados recentemente sugerem que estes genes consistem de uma família que é responsável pela regulação da proliferação celular, a diferenciação e as funções antioxidantes [10], [11]. Nenhum desses genes tem uma relação óbvia com os processos cancerígenos conhecidos que levam ao câncer cervical.

Existem várias limitações do estudo a serem considerados. Nós combinamos o CIN3 + casos a partir do estudo de base coorte NHS com as CIN3 + casos suplementares provenientes da comunidade ao mesmo período de maior poder analítico. Houve uma maior proporção de CIN3 (um corolário de detecção por despistagem no NHS, em vez de sintomas) nos casos NHS que casos suplementares; adicionalmente casos suplementares eram mais velhos, principalmente por causa da maior proporção de cancros em comparação com os casos de coorte NHS onde havia maior proporção de CIN3. Os testes de associações entre SNS e populações suplementares para 94,2% (17.149 /18.208) das SNPs não foram significativas ao nível de 5%, mais importante, todos os SNPs associados com os dois genes de interesse (

PRDX3 Comprar e

RPS19

) foram igualmente distribuídos entre SNS e casos suplementares, justificando que combina as duas coortes. Além disso, este estudo foi desenvolvido em um ponto final combinado de CIN3 e câncer; 95,5% (17.394 /18.208) do SNPs não foram estatisticamente diferentes entre os casos CIN3 e câncer. É importante ressaltar que nenhum dos SNPs associados com os dois genes de interesse (

PRDX3

e

RPS19

) foram estatisticamente significativamente diferente entre CIN3 e cânceres. Porque SNPs foram escolhidos como marcadores de marcação para regiões genéticas, em vez de função, as associações observadas com SNPs pode ser devido ao desequilíbrio de ligação com outros SNPs não medidos causais. Estávamos de fraca potência para realizar análises restritas a tipos de HPV cancerígenas devido ao pequeno tamanho da amostra, como só as mulheres inscritos no SNS original tinha dados de tipagem de HPV. Estudos futuros devem considerar, portanto, genótipos de HPV em análise. Nós também não foram capazes de avaliar os fatores genéticos associados a câncer cervical invasivo em separado. Estudos futuros com grande número de casos será necessária para avaliar se certos genes estão associados à transição do in situ ao câncer cervical invasivo. Embora Foram realizadas análises de haplótipos com base em (definida por blocos de desequilíbrio de ligação); resultados foram geralmente consistentes com a região do gene e resultados baseados em SNP. Sem novas regiões de interesse foram identificadas na análise de haplótipos utilizando a abordagem de janela deslizante, de 3 SNPs. Os genes avaliados aqui também não foram selecionados com base em sua relatado anteriormente associações com câncer cervical, mas por análise agnóstico, abrangendo um esforço global para identificar genes envolvidos com uma gama de cancros infecção e não-infecção relacionados.

em resumo, estes dados sugerem o envolvimento de dois genes,

RSP19

e

PRDX3

ou outros SNPs em desequilíbrio de ligação, com o risco de câncer cervical. Outras investigações mostraram que eles podem ser envolvidos em ambas as fases de transição de persistência e de progressão. Se replicado, estes resultados podem sugerir um papel para a disfunção dos ribossomas, processos mitocondriais e /ou estresse oxidativo ou função ainda desconhecida na patogênese do câncer cervical.

Materiais e Métodos

População do estudo

os dados são do Guanacaste HPV Natural History Study (NHS), um estudo de coorte de base populacional em Guanacaste, Costa Rica. Os detalhes dos métodos de estudo de coorte [12], [13] e da sub-população selecionada para análises genéticas [14], [15] foram relatados em outros lugares. Resumidamente, NHS é uma coorte de base populacional de 10,049 mulheres recrutadas durante um período de 18 meses, em 1993-4 e seguidos por sete anos. O principal objectivo do NHS foi estudar a história natural da infecção pelo HPV e neoplasia intra-epitelial cervical (NIC). células cervicais estavam disponíveis para testes de DNA do HPV, e amostras de revestimento buffy estavam disponíveis para estudos de polimorfismo do gene host.

A genética sub-estudo de acolhimento foi aninhada dentro de NHS, como descrito anteriormente [14], [15]. Resumidamente, os indivíduos selecionados para a genética sub-estudo incluiu: (i) todas as mulheres da coorte confirmado histologicamente ter CIN3 ou câncer prevalente ou incidente (CIN3 +: CIN3 = 140, câncer = 45); (Ii) todas as mulheres da coorte que no momento da seleção para o estudo tinham evidências de persistência do HPV, definida como as mulheres positivas para o mesmo tipo de HPV (ou cancerígeno ou não) em duas visitas consecutivas, pelo menos, 12 meses de intervalo (n = 432) (mediana do tempo de persistência observada de 25 meses); e (iii) uma selecção aleatória de participantes sem CIN3, ou cancro da coorte da linha de base (n = 492). Para aumentar o poder para estudos de genética do hospedeiro, realizamos um sub-estudo suplementar que capturou todos CIN3 (n = 240) e casos de câncer (n = 87) que não eram participantes de NHS, mas foram diagnosticados de forma independente com CIN3 ou câncer em clínicas de Segurança Social de a mesma área de estudo e durante o mesmo período em que NHS foi realizado [15]. O estudo foi aprovado por ambos os EUA NCI e Costa Rica Institucionais Review Boards e todos os sujeitos assinaram o consentimento informado.

métodos laboratoriais

extração de DNA a partir de sangue.

O DNA foi extraído a partir de crostas inflamatórias com kits de purificação de PureGene /protocolo Autopure (Gentra Systems) a SeraCare (Frederick, MD). Para os casos suplementares a extração do DNA foi feito na Universidade da Costa Rica, usando o mesmo kit.

teste de HPV.

HPV teste de DNA baseada em PCR foi realizado utilizando o consenso L1 MY09 /MY11 métodos de primers [12], [16], [17] em células cervicais armazenados em meios de transporte de espécimes (Qiagen, USA) somente do estudo da história natural. Como as células cervicais não foram obtidas a partir dos casos suplementares, os resultados de HPV são restritas a mulheres dentro da coorte original.

genotipagem anfitrião.

Um painel foi projetado como parte de um esforço de inúmeros investigadores baseados na sua experiência em cânceres específicos. Genotipagem de SNPs tag de 990 regiões de genes candidatos a hipótese de estar envolvido em grande número de cancros, tais como cólon, osteosarcoma, esôfago e estômago, biliar, anemia de Fanconi, bexiga, mama e outros cânceres, foi realizada nas instalações do NCI Núcleo genotipagem (Advanced Centro de tecnologia, Gaithersburg, MD; https://snp500cancer.nci.nih.gov) [18] usando um ensaio iSelect Infinium design personalizado (Illumina, www.illumina.com). A Infinium incluiu um total de 27,904 tag SNPs. SNPs tag dos genes foram escolhidos a partir do conjunto designable de SNPs comuns (menor freqüência do alelo (MAF 5%) genotipados utilizando as todas as três populações HapMap para marcar dependente da população de interesse para o investigador sugerindo o gene candidato (Data Release 20 /Fase II, NCBI construir 36,1 montagem, dbSNPb126) usando o software Tagzilla (https://tagzilla.nci.nih.gov/), que implementa um algoritmo de codificação com base no método de criação de faixas aos pares de Carlson

et ai

. [19]. para cada gene alvo original, SNPs dentro da região que abrange 20 kb 5 ‘do início da transcrição (exão 1) e 10 kb de 3’ do final do último exão foram agrupados utilizando um limiar criação de faixas de r

2 … 0.8 para definir uma região do gene Quando houve múltiplas transcrições disponíveis para genes, apenas o transcrito primário foi avaliada

controle de qualidade (QC)

tag SNPs que falhou fabricação (ordenado, mas não conseguiu desenvolvimento do ensaio), falha na validação (sem amplificação ou agrupamento) e ensaios que tinha menos de 80% de conclusão ou 80% de concordância com as 270 amostras HapMap utilizados para a validação foram excluídos (n = 269). SNPs com baixa taxa de conclusão ( 90% de amostras) foram ainda excluída (N = 482). SNPs com discordância QC entre os nossos 100 duplicatas QC e entre amostras HapMap 98% foram excluídos (n = 1.703). Também foram excluídos amostras com uma taxa de conclusão 90% (n = 7). Hardy-Weinberg foi avaliada entre os controles, 49 SNPs mostraram evidências de desvio de proporções Hardy-Weinberg. Nossos dados QC não sugeriu qualquer erro genotipagem óbvia nestes 49 anos, e seus resultados são, portanto, apresentadas. Dos 20.764 SNPs, 18,310 SNPs de 1113 genes foram incluídos na nossa análise presente.

população analítica final.

Foram avaliados um total de 416 mulheres diagnosticadas com CIN3 ou câncer, 356 mulheres com HPV a infecção persistente, e 425 controles aleatórios para quem validado resultados de genotipagem foram obtidos.

Análise estatística

análises baseadas em genes.

Obtivemos um resumo de nível gene de associação usando a combinação de adaptação dos valores de p [20], que combina provas de associação em nível de gene através da classificação truncado método do produto adaptável. Destacamos resultados dos genes que foram significativos em valor de p 0,005. Porque alguns de nossos resultados poderiam ser devido a resultados falso-positivos, calculamos a taxa de descoberta de falsas (FDR) entre as associações considerados significativos usando o método de Benjamini e Hochberg [21] para os testes de genes baseados em região

19. Nós considerado um valor FDR de 0,2 como notável

associações baseadas em SNP

rácios calculados odds (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC 95%) para cada genótipo com.. cada resultado da doença (CIN3 /cânceres vs. controlos aleatórios; HPV-persistência vs. CIN3 /cânceres; HPV-persistência vs. controlos aleatórios), usando o tipo selvagem homozigoto genótipo (WT) como o grupo de referência. Em primeiro lugar, em comparação casos CIN3 /câncer para controlos aleatórios. Nós ainda avaliadas as suas associações para a progressão HPV e /ou persistência através da comparação: o grupo de casos de CIN3 /câncer (n = 415) para persistentes do HPV (n = 356) para avaliação de SNPs relevantes para a progressão e (ii) persistentes do HPV (n = 356) para controlos aleatórios (n = 425) para avaliar SNPs relevantes para persistência. Notamos que a persistência não sempre preceder CIN3, pois pode ser um resultado de uma lesão CIN3

Realizamos brutas e ajustadas por idade. ( 30, 30-49, 50+ anos) analisa. Para cada resultado, foi calculado o

P

tendência com base na variável ordinal de três níveis (0, 1 e 2) do tipo selvagem homozigoto, heterozigoto e homozigoto variante em um modelo de regressão logística. Por causa do tamanho das células pequenas examinar alguns dos SNPs (menos do que 5%), que também mostram efeito combinado de genótipos variantes heterozigotos e homozigotos; Assim, os resultados dos modelos de dois níveis são discutidos. Todos os modelos de regressão logística foram incondicional e conduzida usando SAS versão 9.1 (SAS Institute, Cary, NC).

Informações de Apoio

Tabela S1.

Resultados para todos os testes de genes com base quer para uma associação com (i) cervical pré-câncer /cancro, (ii) a progressão para cervical pré-câncer /cancro, ou (iii) a persistência do HPV

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0033619.s001

(XLS)