Abstract

O desenvolvimento de tumores é acompanhada por uma resposta sistêmica acolhimento complexo, que inclui reações inflamatórias e angiogênicos. Ambas as proteínas derivadas de tumor e resposta sistémica são detectados no plasma de doentes com cancro. No entanto, dada a sua natureza não específica, proteínas resposta sistêmica podem confundir a detecção ou diagnóstico de neoplasia. Aqui, temos aplicado uma abordagem proteômica quantitativa em profundidade para analisar as mudanças proteínas plasmáticas em modelos de ratos com subaguda inflamação impulsionado-irritante, inflamação autoreactive, e matriz de angiogênese associada e compararam os resultados com os achados descritos anteriormente a partir de modelos do rato do polioma meio T-driven câncer de mama e Pdx1-Cre Kras

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LOX /lox induzida por câncer no pâncreas. Entre os modelos de confusão, cerca de 1/3 de todas as proteínas plasmáticas quantificadas exibiu uma alteração significativa na abundância em comparação com ratinhos de controlo. Das proteínas que mudaram em abundância, a maioria era única para cada modelo. proteínas alteradas incluídos aqueles que estão envolvidos na resposta de fase aguda, a inflamação, a remodelação da matriz extracelular, a angiogénese, e sinalização de TGF-p. Comparação das alterações em proteínas do plasma entre os modelos de confundimento e os dois modelos de cancro revelou que as proteínas foram restringidos aos ratinhos com cancro, reflectindo a biologia destes tumores conhecido. Esta abordagem fornece uma base para distinguir entre as mudanças de proteínas no plasma que são oncológicos e aqueles que são parte de uma resposta do hospedeiro não específica

Citation:. Kelly-Spratt KS, Pitteri SJ, Gurley KE, Liggitt D, Chin A, J Kennedy, et al. (2011) Plasma Proteome perfis associados a inflamação, angiogênese e Câncer. PLoS ONE 6 (5): e19721. doi: 10.1371 /journal.pone.0019721

editor: Pierre Bobe, Institut Jacques Monod, França |

Recebido: 11 de dezembro de 2010; Aceito: 14 de abril de 2011; Publicado em: 12 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Kelly-Spratt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Paul G. Allen Família, os modelos NCI mouse de Consórcio Humano do Câncer programa (MMHCC) ea Fundação Canárias. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o tratamento eficaz do cancro depende de um diagnóstico preciso na fase mais precoce da doença eo prognóstico é significativamente melhorada se o cancro for detectado precocemente [1]. ensaios à base de sangue para detecção precoce do cancro são ideais, uma vez que o sangue chama são baratos, minimamente invasivo, e de rotina, na prática clínica. Embora o conceito de um teste do cancro com base no sangue é simples, a sua aplicação tem sido um desafio, a tal ponto que muito poucos novos biomarcadores de câncer têm sido aprovado pela FDA nos últimos anos [2]. Além disso, aqueles atualmente em uso, tais como CA125 e PSA para câncer de ovário e próstata respectivamente, são substancialmente limitadas por altas taxas de falsos positivos e excesso de diagnóstico [3], [4]. Um grande obstáculo ao desenvolvimento de novos biomarcadores baseado no sangue tem sido o desafio técnico de interrogação do proteoma do plasma [5]. Outro obstáculo tem sido a escolha de comparações caso /controle na descoberta de biomarcadores [6]. Níveis de biomarcadores candidatos de pacientes com câncer são frequentemente comparados com indivíduos saudáveis. Nestes estudos, é difícil controlar as variáveis ​​genéticos ou ambientais, bem como não-cancerosas condições de “confusão”. Por exemplo, inflamação e angiogênese são características do câncer, mas também ocorrer durante infecções, inflamação crônica, doenças auto-reactivas e outras condições que não são específicos para câncer [7]. Embora alguns estudos têm utilizado biomarcadores condições inflamatórias como controlos [8], [9], isto não exclui a necessidade de determinar a gama de proteínas que ocorrem com condições inflamatórias. Na verdade, o fato de que muitos biomarcadores de câncer candidato carecem de especificidade suficiente para ser útil defende uma nova abordagem [1], [6].

A inflamação e angiogénese desempenham um papel importante em todas as fases de progressão do cancro, incluindo iniciação do tumor , crescimento e disseminação metastática. De fato, condições inflamatórias crônicas são fortes fatores de risco para o câncer [10]. Inflamação incita e promove a carcinogênese, causando danos genoma da célula e, estimulando a renovação celular através de citocinas e liberação do fator de crescimento e criação de um microambiente tecido que pode melhorar a invasão, migração e angiogênese. Finalmente, o sistema imunológico também controla a progressão do câncer através de vigilância imunológica e immunoediting [11]. Inflamação é um processo complexo promulgada pelo host para controlar danos nos tecidos contra a lesão patogénico, traumática ou tóxico e é geralmente classificado em, uma resposta aguda rápida, uma fase de transição sub-aguda, e uma persistente, mas evoluindo lentamente condição crônica. A resposta inflamatória aguda envolve uma entrega rápida de componentes de sangue, plasma, neutrófilos e leucócitos para o local da infecção ou lesão, seguido de um influxo de macrófagos para resolver e reparar o dano [12]. proteínas de fase aguda encontrados no plasma são definidos como positivo ou negativo dependendo se aumentar ou diminuir durante um distúrbio inflamatório. Se uma resposta inflamatória aguda não consegue resolver o dano, a transição é feita a uma fase sub-aguda em evolução, em seguida, para uma condição inflamatória crónica. A inflamação crônica, como observado em algumas condições autorreativas, pode ser “ativo”. Este é caracterizado por remodelação de tecidos, macrófagos, células T e B, angiogénica e outros factores. A inflamação crônica pode, por sua vez, levar a danos excessivos do tecido, a desregulação imune, e autoimunidade [10], [13].

A angiogénese, o surgimento de novos vasos sanguíneos a partir preexistente vasculatura, é obrigada a fornecer oxigênio e outros nutrientes para suportar o crescimento do tumor; e o grau de vascularização é um factor de prognóstico que se correlaciona com a agressividade do tumor [14]. No entanto, a angiogénese também está associada a condições não-cancerosas, tais como a cicatrização de feridas, reparação de tecidos, artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias crónicas [15]. Assim, a inflamação e a angiogénese são intimamente envolvido no cancro, assim como outras patologias comuns. Estas condições desencadear respostas sistêmicas complexas e dinâmicas, mas a extensão da sobreposição entre a resposta sistêmica para o câncer e para condições não-cancerosas é em grande parte desconhecido.

Para caracterizar a resposta sistêmica para o câncer e inflamação, foi aplicado proteômica plasma para modelos de ratos com inflamação subaguda, inflamação crônica, e angiogênese. modelos de ratos a superar alguns obstáculos-chave para a descoberta de biomarcadores, incluindo o desenvolvimento de tecnologia [16]; correspondência mais precisa de casos e controles para reduzir a genética, idade e variáveis ​​ambientais; interrogando as mudanças dinâmicas no proteoma do plasma através da progressão da doença; e integração de resultados com as extensas bases de conhecimento biológicos [17]. injecções de carragenina foram utilizadas para modelar subaguda inflamação [18]. Este modelo representa uma evolução resposta subcuticular de irritação local e necrose semelhante ao que pode ser visto na sequência de necrose tumoral. Para a inflamação crónica, utilizou-se um modelo induzida por colagénio de artrite [19]. Este modelo está associado a complexos antigénio-anticorpo, de acordo com uma lesão auto-reactiva, com a infiltração de células mononucleares, remodelação óssea, fibroplasia e crescimento vascular em torno da articulação. FGF injecções foram utilizados para estimular a angiogénese, o que resulta na rápida em crescimento dos vasos sanguíneos e que suportam elementos estromais [20].

Um grande número de proteínas plasmáticas em abundância alterada em cada modelo, o que reflecte o complexo de cada biologia condição. Estes perfis de plasma foram comparados com os anteriormente identificados em dois modelos de rato bem caracterizado de pancreático [21] e do cancro da mama [22]. No modelo de cancro da mama, o antigénio T de polioma meio oncoproteína (PyMT) é conduzido pelo LTR de MMTV e é restrito para o epitélio mamário. Estes ratinhos desenvolvem carcinomas que se assemelham a cancro da mama humano e que estão associadas à infiltração de leucócitos e metástase pulmonar posterior [23]. Desenvolvimento de câncer de pâncreas na Pdx1-Cre Kras

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lox modelo /lox envolve progressão de pancreáticas neoplasia intra-epitelial (PanINs) para adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), fielmente recapitulando a doença humana [24]. Aqui mostra-se que a maioria das alterações de proteínas plasmáticas identificadas nestes modelos de tumores eram únicos para cada modelo e que não se vêem nos modelos variáveis ​​de confusão. Além disso, muitas destas proteínas têm papéis conhecido na progressão do cancro. A identificação e caracterização dos perfis de proteína associada com o câncer contra patologias não cancerosas pode ser usado para entender a complexa biologia da resposta do hospedeiro ao câncer e para priorizar candidatos a biomarcadores que estão associados com o câncer.

Materiais e Métodos

os estudos em animais

os estudos em animais foram realizados sob regulamentos IACUC aprovado pela comissão de uso de animais FHCRC (Protocolo # 1311). Dez ratinhos FVB fêmeas foram usados ​​em cada condição emparelhado com dez controlos não tratados da mesma ninhada. Para o modelo de inflamação aguda, que faz a transição para a inflamação subaguda, foi utilizado um irritante pró-inflamatórios bem conhecidos, carragenina, um hidrato de carbono derivado de algas marinhas [18]. Este foi entregue por meio de um implante da esponja que sustenta a libertação carragenano e contribui com uma resposta a corpo estranho clássica. 10 × 10 mm esponjas cirúrgicas foram injectados com 1% de carragenina (Sigma C1867-5G) e implantadas subcutaneamente no flanco direito. O plasma foi recolhido por punção cardíaca, 3 semanas mais tarde. As proteínas do plasma identificadas a partir destes ratos deve corresponder a uma resposta de fase subaguda tarde para a carragenina e o impacto associado esponja, em vez de à iniciação da resposta inflamatória aguda, que ocorre no prazo de 72 horas. Para avaliar o perfil de proteína associada à inflamação crônica, foi utilizado um modelo de rato de artrite induzida por colágeno [19]. Bovino colagénio tipo II (CII) (BD Biosciences, San Jose, CA) foi emulsionado com adjuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) a uma concentração final de 4 mg /ml e um total de 0,1 ml foi injectado por via intradérmica, perto da base da cauda. Isto resulta no desenvolvimento da artrite crónica nas patas traseiras no prazo de 14-21 dias. Os ratinhos foram monitorizados cada 2-3 dias para o desenvolvimento e progressão da artrite e de plasma recolhidas na altura do desenvolvimento do inchaço das patas posteriores em 4 semanas. Para modelar a angiogénese, Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA), mais de FGF (500 ng /mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi injectada subcutaneamente no flanco direito, resultando na rápida em crescimento dos vasos sanguíneos e elementos de suporte do estroma mas com pouca inflamação associada [20]. O plasma foi recolhido 3 semanas mais tarde. Para estes modelos, o sangue dos ratinhos experimentais e de controlo foi recolhido por punção cardíaca, utilizando uma mistura 1 cm

3 de seringa e uma agulha de 23 g, e colocados num tubo de K3-EDTA (Webster Fornecimento Veterinária, Sterling, MA) [17 ]. O plasma foi isolado por centrifugação a 2000 × g durante 5 min e alíquotas transferidas para criotubos e congeladas a -80 ° C.

A recolha de amostras para a pancreático [21] e da mama [22] modelos do rato do cancro tem sido previamente descrito. Resumidamente, os ratos para análise proteômica câncer pancreático foram obtidos por meio de cruzamento Pdx1-Cre

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LOX /lox e

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lOX /lox. Experimental Pdx1-Cre

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LOX /mice lox e controle de

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LOX /serve-se e Pdx1-Cre

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LOX /mice lox foram sacrificados em 5,5 e 7 semanas de idade. Para ambos os ratinhos de controlo e de casos, letais Comas foram induzidos por injecção de murganhos por via i.p. com um mL de 5% Avertin 0,6-0,8 (2,2,2-tribromoetanol, Sigma). Esta diferença no método eutanásia introduz um potencial, embora provavelmente menor, ressalva quando se comparam os modelos pâncreas para os outros modelos. Uma seringa de 1 mL com uma agulha de 22 g foi utilizado para punção cardíaca, para obter sangue. O sangue foi colocado em tubos de K3-EDTA (Fisher) e centrifugado a 4 ° C durante 5 min a 3000 rpm. O plasma foi removido e armazenado a -80 ° C.

Para o modelo de ratinho do cancro da mama, FVB transgénico /N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul /J () PyMT ratinhos foram obtidos a partir do National Cancer Institute e criados em casa para obter amostras de plasma a partir de murganhos portadores de tumor e da mesma ninhada de controlo em dois pontos de tempo de desenvolvimento do cancro da mama. PyMT machos heterozigotos foram cruzados com fêmeas do tipo selvagem FVB para gerar o grupo de PyMT heterozigotos e do tipo selvagem do sexo feminino para o estudo. Para evitar viés, ratinhos transgénicos e de controlo PyMT foram pareados ao desmame e foram combinados com relação à idade, maca, e gaiola. Todos os ratos foram alimentados com ração padrão (Harland Tekland, 8664) e água acidificada

ad libitum

e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 h. Começando às 5 semanas de idade, os ratinhos foram palpados todos os dias para detectar o crescimento do tumor da mama. tumores de mama foram autorizados a desenvolver a 0,5 ou 1 cm de diâmetro, após o que cada rato portador de tumor e um controle foram sacrificados back-to-back no mesmo dia pelo CO

2 inalação. O sangue foi obtido por punção cardíaca e o plasma foi isolado e armazenado como descrito para os modelos de rato de inflamação e angiogénese.

imunodepleção de proteínas abundantes e rotulagem isotópica

50 ul de plasma a partir de 5 ratinhos foi reunido para cada conjunto de amostras de casos e controles. Piscinas foram Imunodeprimido das três principais proteínas mais abundantes (albumina, IgG e transferrina), utilizando uma coluna MS-3 (4,6 × 10 mm, Agilent). A coluna foi equilibrada com imunodepleção tampão A em (0,5 ml /min) durante 13 min e alíquotas de soros combinados foram injectados após filtração através de um filtro de seringa de 0,22? M. As fracções de fluxo de passagem foram recolhidos durante 10 min a um caudal de tampão A de 0,5 mL /min, combinado e armazenado a -80 ° C. O material ligado coluna foi recuperado por eluição durante 8 minutos com tampão B a 1 mL /min. Subsequentemente, as amostras Imunodeprimido foram concentradas utilizando Centricon YM-3 dispositivos (Millipore Corp, Bedford, MA) e re-diluída em 8 M de ureia, 100 mM de Tris pH 8,5, 0,5% de OG (octil-beta-d-glucopiranósido, Roche). Na sequência de exaustão e troca de tampão, concentrações de proteína foram determinadas por ensaios Bradford: angiogênese 2,5 mg (caso) e 3,8 mg (controle), inflamação crônica 4,3 mg (caso) e 3,8 mg (controle), e inflamação aguda 2,8 mg (caso) e 3,1 mg (controlo), e toda a quantidade de proteína para cada amostra foi utilizada para a rotulagem subsequente acrilamida. As amostras foram reduzidas com DTT (0,66 mg de DTT /mg de proteína), e a marcação isotópica dos resíduos de cisteína nas proteínas intactas foi realizada. As amostras de controlo foram marcados com isótopo leve 12C acrilamida (7,1 mg /mg de proteína) ( 99,5% de pureza, Fluka), e amostras experimentais foram marcados com o isótopo pesado 13C-acrilamida (Cambridge Isotope Laboratories, 7,4 mg /mg de proteína) para 1 h à temperatura ambiente. Piscinas de amostras de controlo e experimentais foram então combinadas para a separação de proteínas intactas.

separação de proteínas Intact

As amostras marcadas com isótopos combinados foram separados por um sistema on-line 2D-HPLC automatizada controlada por Workstation Class-VP 7,4 (Shimadzu Corporation). As amostras de plasma marcadas combinadas foram separadas na primeira dimensão numa coluna de permuta aniónica (Poros HQ /10, 10 mmID x 100 mL, Applied Biosystems) usando um 8 passo de eluição (a partir de NaCl 0 mM a NaCl 1000 mM) a 0,8 ml /min. As fracções de cada um dos 8 passos de separação de eluição de permuta aniónica foram transferidos automaticamente numa coluna de fase reversa (PorosR2 /10, ID de 4,6 milímetros x 100 mL, Applied Biosystems) para uma segunda dimensão de separação. Um gradiente de eluição de 25 minutos (de 5% a 95% de fase móvel B) foi utilizado a 2,4 mL /min. Foram recolhidas fracções de 3 por minuto, com cada fracção contendo 800 ul. 576 fracções de fase reversa foram coletados no total (frações de câmbio 8 ânions cada separados em 72 frações de fase invertida). A fase móvel A para a cromatografia de permuta aniónica consistiu em Tris a 20 mM (Sigma), 6% de isopropanol (Fisher), ureia 4 M, pH 8,5 e a fase móvel B foi a mesma composição e o pH como A com 1 M de NaCl (Fisher) adicionou . A fase móvel A para a cromatografia de fase reversa, consistiu de 95% de água, 5% acetonitrilo, 0,1% de TFA (Supelco), e a fase móvel B consistiu de 90% de acetonitrilo, 10% de água, 0,1% de TFA.

Massa a análise por espectrometria

-solução de digestão foi realizada com aliquotas liofilizadas a partir do passo de fraccionamento em fase inversa (segunda dimensão). As proteínas em fracções individuais foram re-suspensas em 0,25 M de ureia (Fisher) contendo bicarbonato de amónio 50 mM e 4% de acetonitrilo e, em seguida, digeridos durante a noite com 200 ng de tripsina modificada (Promega) a 37 ° C. As misturas de peptídeos resultantes foram acidificadas com 5 mL de ácido fórmico a 1%. Alíquotas foram sujeitas a análise por espectrometria de massa depois de espingarda agrupamento de várias fracções consecutivas (concentração de proteína estimada por rastreio de UV). 12 conjuntos de fracções de fase reversa individuais para cada um dos passos de permuta de aniões 8 foram criadas através da combinação das seguintes fracções sequenciais: 1-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30, 31-32, 33 -34, 35-36, 37-38, 39-40, 41-42 e 43-72. 96 fracções foram analisadas para cada experiência por um espectrómetro de massa LTQ-Orbitrap (Thermo) acoplado com um NanoLC-1D (Eksigent). A separação de cromatografia líquida foi realizada numa coluna de 25 cm (Picofrit 75 um ID, novos objectivos, embalados em casa com resina MagicC18) utilizando um gradiente linear de 90 min de 5 a 40% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1% em 300 nl /min para análise espingarda. Aproximadamente 10 ug de proteína foi injectada por fracção. Os espectros foram adquiridos em um modo dependente de dados em

m

/

z gama de 400-1800

, incluindo a selecção dos 5 mais abundantes +2 ou +3 íons de cada espectro MS para MS análise /MS. Os parâmetros do espectrómetro de massa eram tensão capilar de 2,0 KV, temperatura capilar de 200 ° C, resolução de 60.000, eo valor-alvo de 1.000.000.

O processamento de dados

Os dados adquiridos foram automaticamente processadas pelos Proteomics Computacional análise de Sistemas (CPAS) [25] gasoduto usando o X! busca Tandem algoritmo [26] configurado com o cometa módulo pontuação plug-in. PeptideProphet [27] e ProteinProphet [28] foram utilizados para validação dos resultados de pesquisa e inferência proteína. A quantificação foi realizada usando a ferramenta Q3 quantificação [29]. Os espectros de massa em tandem foram pesquisados ​​na versão 3.48 do banco de dados IPI rato [30]. Todas as identificações com uma probabilidade superior a 0,2 PeptideProphet foram submetidos a ProteinProphet, e as identificações de proteína subsequentes foram filtrados a uma taxa de erro mínimo de 5%. Para quantificação, as relações para as proteínas foram calculados utilizando apenas os péptidos alcançando PeptideProphet probabilidade de pelo menos 0,75. grupos de proteínas designadas por ProteinProphet foram combinadas pelo símbolo gene comum e daí em diante referido como “proteínas”. Caso rácios /controlo para cada proteína foi calculado pela média de proporções log2 em todos os péptidos designados para a proteína. Mais de 1.000.000 de espectros MS /MS foram recolhidas e proteínas com 2289 nomes de genes únicos foram identificados entre os 3 modelos experimentais.

A significância estatística de quantificação de proteínas por espectrometria de massa foi determinada por dois métodos. Para proteínas com múltiplos eventos emparelhado MS de acrilamida pesada e leve, uma amostra de um teste-t foi usada para calcular um valor de p para a razão média de toda a proteína em todas as fracções. Em segundo lugar, a probabilidade para a razão para cada evento MS foi calculado a partir da distribuição de proporções de uma experiência de controlo de controlo em que a mesma amostra foi dividida e marcadas com acrilamida pesada e leve. Se o valor-p para cada evento individual foi 0,05, a proporção de proteína foi considerado estatisticamente significativo

Rede análise

As proteínas aumentada e diminuída identificados a partir da análise IPAS foram utilizados para biofunction. e análise de caminho usando Ingenuity pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems, mountain View, CA). A base de dados consiste em IPA ontologia proprietária representando 300.000 genes biológicos, proteínas, e os processos moleculares e celulares.

Enzyme linked immunosorbent (ELISA) Os ensaios

Os níveis plasmáticos de PF4, IGF1, Igfbp5, e Lcn2 foram medidos usando kits disponíveis comercialmente DuoSet de ratinho obtidos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). O plasma foi diluído 1:1000, 1:400, 1:120, e 1:180 para PF4, IGF1, Igfbp5, e Lcn2, respectivamente, para o teste. Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo e as amostras do fabricante foram testados em duplicata.

Resultados

Identificação de proteínas plasmáticas distintas de camundongos portadores de tumor

Para identificar plasma com restrição de câncer proteínas, foram comparados os proteomas de plasma de murganhos com inflamação induzida por carragenano subagudo, artrite induzida por colagénio, e a angiogénese induzida por FGF aos proteoma do plasma de ratos com cancro da mama dirigido PyMT e Pdx1-Cre Kras

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câncer pancreático LOX /lox. Os plasmas obtidos a partir de murganhos com inflamação subaguda, inflamação crónica, angiogénese e, juntamente com os ratinhos de controlo com idades de correspondência foram submetidos a análise proteomic em profundidade. Na comparação proteómica de plasmas de camundongos com a condição de confusão para controlar ratos, entre 378 a 511 proteínas foram quantificadas por meio de marcação isotópica diferencial sobre resíduos de cisteína (Tabela S1). A variabilidade do número de proteínas quantificadas reflecte variabilidade na medição da proteína e espectrometria de massa de amostragem. Notavelmente, aproximadamente um terço de todas as proteínas quantificadas alterados em abundância por 1,25 vezes ou mais em comparação com ratinhos de controlo (P 0,05) e, destes, de duas a três vezes tantas foram reduzidos, em oposição a um aumento em todos os três modelos (Tabela 1, Figura S1). Quando consideramos apenas proteínas quantificadas em todos os três modelos de rato, comparações de perfis de plasma entre os modelos revelaram uma sobreposição de 35% em proteínas alteradas entre subaguda e modelos de inflamação crónica, em comparação com apenas uma sobreposição de 15% entre os modelos de inflamação e o modelo de angiogênese ( Tabela 1). Devido à limitada amostragem do espectrómetro de massa, de um número de proteínas não foram quantificados em todos os três modelos de murganho. Quando não requerem proteínas a ser quantificada em todos os três modelos de ratinhos, a sobreposição de proteínas cima e para baixo-regulados é mostrado na Figura 1A e 1B, respectivamente. Comparações de mudanças nos níveis de proteína para cada modelo revelou uma forte correlação entre subaguda e inflamação crônica, com uma pontuação de teste Pearson de 0,67 (Figura 1C), enquanto que as comparações de cada modelo de inflamação ao modelo angiogênese revelou menos de 50% correlações (teste de Pearson dezenas de 0,49 e 0,31, respectivamente). Assim, os perfis de plasma foram mais semelhantes entre modelos de inflamação do que entre a angiogénese e, quer o modelo de inflamação, o que reflecte a biologia subjacente destas condições. Além disso, a maioria das proteínas alteradas eram únicos para cada modelo confundidor, demonstrando especificidade biológica. As abundâncias relativas das proteínas individuais identificadas em cada um dos três modelos estão listados na Tabela S1.

Diagramas de Venn de comparação (A) aumenta e (B) diminuiu proteínas no plasma a partir do sub-aguda e modelos de inflamação e angiogénese crónicas em comparação com ratinhos de controlo. Os diagramas mostram os números de proteínas, quer elevada ou reduzida, em cada modelo, e que são únicas ou partilhada entre cada um dos 3 modelos. A maioria das proteínas aumentada ou diminuída eram exclusivas de cada modelo. (C) as curvas de correlação para proteínas quantificadas. Caso /controle (log2) rácios para cada proteína quantificada são plotados no eixos X e Y. As parcelas refletem diferenças de abundância de proteínas específicas entre dois modelos. comparações entre proteômicas crônica contra a comparação subaguda inflamação são mais semelhantes (R = 0,67) do que as comparações entre ambos os modelos inflamação e o modelo de angiogênese (R = 0,49 e 0,31, respectivamente).

em seguida, compararam os perfis proteômicos destes modelos de confusão para os perfis obtidos anteriormente por câncer precoce e tardia de mama em estágio [22], e aos perfis de fase inicial (PanINs) e câncer em estágio final (PDAC) pancreático [21]. Em contraste com os modelos de confundimento, um número aproximadamente igual de proteínas foram aumentada e diminuída em ratinhos portadores de tumor em comparação com ratinhos não portadores de tumor (Tabela 2). Destas proteínas alteradas, a grande maioria ( 75%) não foram alteradas em fatores de confusão (Tabela 2). Observaram-se três padrões de distribuição de proteína do plasma: aumentou em ambos os co-fatores e os modelos de cancro (Figura 2A), o aumento em confusão, mas inalterada ou decresceu no cancro (Figura 2B), e diminuição em confusão e aumentada no cancro (Figura 2C). Apenas 27% de proteínas com níveis alterados no estudo estavam aumentados em ambos os fatores de confusão e do cancro, enquanto a maior categoria, que respondem por 55% do total, consistiu de proteínas que foram reduzidos em confusão, mas aumentou em ratinhos portadores de tumor. Níveis relativos de proteínas representativas que apresentam esses padrões são mostradas na Figura 3. Nota, lisil-oxidase como um (LOXL1) e proteoglicano 4 (Prg4) são reduzidas no plasma de confusão e aumentou em ambos mama e os ratinhos portadores de tumores pancreáticos, enquanto que o ácido gordo sintase (FASN) e lipocalin2 (Lcn2) são aumentadas em ambos os fatores de confusão e modelos de câncer (Tabela S1)

(a) As proteínas aumentou em ambos os fatores de confusão e modelos de câncer em relação aos controles ( . 1,25 vezes, p 0,05), (B) proteínas aumentou em confusão e diminuiu em modelos de câncer, e () proteínas C diminuiu em confusão e aumento em modelos de câncer (vermelho = up, verde = baixo, preto = nenhuma mudança, cinza = não quantificada).

gráficos mostram log2 rácios caso /controle de espectrometria de massa com base de proteínas específicas em cada modelo de fator de confusão e câncer que exibem padrões de abundância diferenciais. LOXL1 representa proteínas que são reduzidos na confusão e elevados nos modelos de cancro. FASN mostra elevação em todos os modelos, mas mais ainda em PanIN. Prg4 é elevado, principalmente no modelo de cancro pancreático. Lcn2 é elevada na inflamação e a um maior grau nos modelos de cancro, mas não o modelo de angiogénese.

Para verificar a abundância diferencial observado por espectrometria de massa, ensaios de ELISA foram realizados em seleccionados proteínas com base na disponibilidade comercial (PF4, IGF1, Igfbp5, e Lcn2) (Figura 4). Note-se, factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1) e insulina como a proteína de ligação ao factor de crescimento de 5 (Igfbp5) foram diminuídas ou inalteradas em confusão, mas aumentou em ratinhos portadores de tumores mamários. Lipocalina 2 (Lcn2) foi aumentada em todos os modelos, mas a um nível mais elevado em ratinhos portadores de tumor, enquanto factor de plaquetas 4 (PF4) foi diminuída em inflamação subaguda, mas aumentou na inflamação crónica e cancro. Outras proteínas plasmáticas que foram especificamente aumentados em ratinhos portadores de tumor incluídos acetil-CoA acetiltransferase 1 e 3, ácidos graxos proteínas 1 e 4, fibulin, peroxirredoxinas 1, 5 e 6, SPARC vinculativo, e thrombospondins 1 e 4.

análise ELISA do PF4, IGF1, Igfbp5, e Lcn2 mostrando aumento da concentração no plasma em ratinhos portadores de tumor da mama em comparação com PyMT quer a subaguda ou ratinhos inflamação crónica. O plasma de ratos não tratados foi usado como controle.

mudanças da proteína plasmática observada com a inflamação

A seguir, analisou as proteínas plasmáticas alterados de cada condição de fator de confusão. No modelo de inflamação subaguda, maior do que 50% das proteínas aumentou desempenhar um papel na inflamação conhecida, incluindo as proteínas de fase aguda positivas [31], bem como as quimiocinas Ccl8 e PF4 (também conhecido como Cxcl4) (Tabela S1). Entre as proteínas são reduzidos eram cinco proteínas de complemento, bem como proteínas de sinalização segregadas, tais como RBP4, IGF1, Igf2, TGFp, e Pdgfb. A cascata do complemento é importante na resposta de fase aguda, enquanto IGF1 e RB4 são proteínas de fase aguda negativos. A análise de redes ligadas muitas das proteínas com níveis alterados de intracelular (NF-kB) e segregada (IL-1 e TGF-p) reguladores do sistema imunitário (Figura 5A, B) [10]. -se TGFp foi reduzido, como foram múltiplas proteínas envolvidas na sinalização de TGF-p. proteínas de fase aguda em conjunto, a análise proteômica do plasma identificadas conhecidos, proteínas ligadas aos reguladores inflamatórios, tais como TGF e proteínas adicionais (por exemplo proteínas do citoesqueleto actins, cofilins, VASP, profilin e destrin) não previamente associadas à inflamação (Tabela S1).

Mais redes atribuídos pela Ingenuity Análise Caminho para proteínas ambas aumento e redução da inflamação subaguda (a, B), inflamação crônica (C, D) e os modelos de angiogênese (e, F). Redes para as proteínas de fibrinogênio e ECM abundantes subaguda modelo de série, o modelo crônica dá o fator de crescimento proeminente e redes de colágeno, enquanto a rede angiogênese mostra proteínas de quimiocinas e de coagulação. [Red = aumentou, verde = diminuiu, branco = nenhuma mudança em abundância em casos vs ratos de controle, 1,25 vezes p . 0,05]

Tal como no modelo de inflamação subaguda, um número significativo. de proteínas aumentada no âmbito inflamação crônica tinha conhecido links para a inflamação. Notavelmente, no entanto, menos proteínas de resposta de fase aguda que foram identificados com o modelo subaguda (Tabela S1). Outra grande categoria de proteínas alteradas com inflamação crônica estão envolvidos na remodelação da matriz extracelular (Figura 5C). Muitas delas foram reduzidos e são alvos de protease de MMP2, que por si só foi aumentada. Como no modelo subaguda, TGF e proteínas ligadas à sua regulamentação ou sinalização foram reduzidos, incluindo Ltbp1, Ltbp4 e Vasn (Figura 5D).

assinatura proteínas plasmáticas para a angiogênese

Um número significativo das proteínas alteradas identificadas no modelo angiogénica têm conhecido ligações mecânicas para a angiogénese e /ou são expressos nas células endoteliais, tais como trombospondina 1 e 4, renina 1 e 2, factor de plaquetas 4, factor trevo 1, e proteína de ligação a colagénio 2, bem como outras proteínas não previamente associados com a angiogénese. Além disso, a alteração das proteínas do complemento e factores de coagulação, que tem ligações a angiogénese, foram observados (Figura 5E) [32] [33].