Abstract

Objetivos

A hemoglobina (Hb) é o principal transportador de oxigénio e dióxido de carbono nas células de linhagem eritróide e é responsável pelo fornecimento de oxigénio aos tecidos com respiração do corpo. No entanto, Hgb também é expresso em células nonerythroid. No presente estudo, a expressão de Hgb em células de carcinoma do colo uterino humano e seu papel no câncer de colo uterino foram investigados.

Metodologia

O nível de expressão de Hgb em tecidos de câncer cervical foi avaliada por quantitativa a transcriptase inversa-PCR (qRT-PCR). Foram aplicados vários métodos, tais como RT-PCR, imunotransferência, e análise imuno-histoquímica, para confirmar a expressão de Hgb em células de cancro do colo do útero. Os efeitos da expressão ectópica de Hb e Hb mutantes sobre o stress e viabilidade celular oxidativo foram investigados por espécies reativas de oxigênio celulares (ROS) análise e lactato desidrogenase (LDH) matriz, respectivamente. Tanto o ensaio de coloração Anexina V por citometria de fluxo e ensaio de actividade da caspase-3 foram utilizados, respectivamente, para avaliar a apoptose celular.

Resultados

análise de qRT-PCR mostrou que Hgb-α- (hba1) e Hb-β-globina (gene HBB) a expressão do gene foi significativamente mais elevada no carcinoma do colo do útero do que em tecidos normais do colo do útero, ao passo que a expressão de factores de transcrição hematopoiéticas e genes marcadores específicos de eritrócitos não foi aumentada. experimentos imunocoloração confirmou a expressão de Hgb em células de câncer do colo uterino. ARNm e proteína de Hgb também foram detectadas nas linhas celulares de carcinoma cervical humano SiHa e CaSki, e expressão de Hgb foi regulado para cima pelo stress oxidativo induzido pelo peróxido de hidrogénio. Importante, expressão ectópica de tipo selvagem hba1 /HBB ou hba1, ao invés de mutantes hba1

H88R /HBB

H93R incapaz de se ligar hemo, suprimiu o estresse oxidativo e melhoria da viabilidade celular.

Conclusões

os presentes resultados mostram pela primeira vez que a Hb é expresso em células de carcinoma cervical e pode actuar como um antioxidante, atenuando danos induzida por stress oxidativo em células de cancro do colo do útero. Estes dados fornecem um impacto significativo não só na globina biologia, mas também na compreensão da patogênese do câncer cervical associado ao estresse oxidativo

Citation:. Li X, Wu Z, Wang Y, Mei Q, Fu X, Han W ( 2013) Caracterização de α- Adultos e β-globina Elevated por peróxido de hidrogênio em células de cancro do colo do útero que desempenham um papel Citoprotector contra oxidativo insultos. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10.1371 /journal.pone.0054342

editor: Russell O. Pieper, da Universidade da Califórnia, San Francisco, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de julho de 2012; Aceito: 12 de dezembro de 2012; Publicação: 17 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelos subsídios da National Science Foundation Natural da China (website é https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (No. 31201033, 31270820, 81230061 e 81001184) e foi parcialmente financiado pelas bolsas do National Science básica e Programa de Desenvolvimento da China (website é https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (No. 2012CB518103 e 2012CB518105). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hemoglobina (Hgb), a principal proteína heme de eritrócitos, facilita o transporte de oxigénio e dióxido de carbono no sangue. A molécula de Hb é uma montagem de quatro subunidades proteína globular. HgbA, o tipo mais comum de Hb em seres humanos adultos, é um tetrâmero constituído por duas a- e p-subunidades que contêm heme mantidas juntas por interacções não covalentes (α

2β

2) [1], [2] . Outros heme contendo proteínas de vertebrado com homologia estrutural com globina cadeias incluem mioglobina, que é amplamente encontrado nos corações de vertebrados e os músculos estriados e lisos [3], citoglobina, principalmente descritos nos tecidos conjuntivos [4], e neuroglobin, amplamente expresso no cérebro [ ,,,0],5].

a função comum de Hgbs como um portador de oxigênio e dióxido de carbono principal vertebrados é uma adaptação relativamente recente durante a evolução, necessária para garantir a entrega correta de oxigênio para todas as células do corpo através de meios da rede vascular . Além deste papel clássico, Hgbs pode realizar outras atividades celulares, incluindo o transporte intracelular de oxigénio, sensor de oxigênio, NO limpeza, eliminação de peróxido de hidrogênio e regulação do metabolismo do ferro [6]. Estudos recentes relatam a detecção de cadeias de Hb em outras células que não as da série eritróide, incluindo neurónios [7], [8], [9], células da retina [10], [11], as células epiteliais alveolares [12], [ ,,,0],13], [14], endométrio [15], células mesangiais renais de ratos [16], hepatócitos [17] e macrófagos [18]. Especula-se que a função de Hb nos neurónios de armazenamento pode ser de oxigénio [9]. Nas células epiteliais alveolares, Hgb expressão induzida por hipoxia podem desempenhar um papel na via de detecção de oxigénio [14]. analisa Microarray de linhas de células estavelmente transfectadas dopaminérgica MN9D com Hgb-α-globina (hba1) e Hb-β-globina (HBB) cadeias revelou alterações na expressão de genes envolvidos na homeostasia de oxigénio e fosforilação oxidativa mitocondrial [7]. Além disso, a sobre-expressão de Hgb foi mostrado para reduzir o stress oxidativo, o que sugere que as funções de Hgb como antioxidante [16], [17].

o stress oxidativo é causado por um desequilíbrio entre a formação de metabolitos de oxigénio activo e a taxa à que eles são eliminado por antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, e que tem sido associada com a patogénese e complicações de várias doenças, incluindo o cancro [19]. A produção excessiva ou inadequada remoção de espécies de oxigénio reactivas (ROS), tais como peróxido de hidrogénio, radicais hidroxilo e superóxido anião está associada com a carcinogénese [20] e invasividade [21]. Enzimática e os mecanismos de defesa anti-oxidantes não enzimáticos regular o equilíbrio redox celular e, por conseguinte, a patogénese de muitas doenças. No entanto, a nossa compreensão dos papéis do oxidante e sistemas antioxidantes na carcinogênese e desenvolvimento do tumor permanece limitada. Notavelmente, um estudo recente mostrou que as funções Hb como uma peroxidase antioxidante, atenuando peróxido de hidrogênio estresse oxidativo induzido [22].

Os avanços na tecnologia de microarrays de alto rendimento permitiram a comparação de perfis de expressão gênica entre tumores primários e normal tecidos. As análises de expressão de genes à base de microarray identificou genes Hgb diferencialmente expressos em tumores sólidos incluindo cancro da mama [23], carcinoma seroso do ovário [24], e carcinoma colorrectal [25]. Um estudo recente mostrou que proteomic hba1 soro e níveis HBB foram significativamente elevados em pacientes do cancro do ovário em relação às fêmeas saudáveis ​​normais [26]. Embora a fonte de Hgb livre no soro era desconhecido, presume-se ser o resultado de hemólise induzida por stress oxidativo. Os mecanismos subjacentes à regulação da Hgb e suas conseqüências funcionais em tumores sólidos continuam a ser plenamente compreendido.

No presente estudo, mostramos que Hgb-α, cadeia adulto 1 (HBA-a1) e Hgb- β, cadeia adulto 1 (HBB-B1) são expressos em células de carcinoma de vários tipos de tumores sólidos. Hgb expressão foi detectada em amostras de tecido clinicamente ressecados cervical humano e foi regulado para cima em tecidos de cancro do colo do útero em comparação com tecidos normais. Além disso, nossos resultados indicaram que o estresse oxidativo up-regula a expressão Hgb. Mais importante, a sobre-expressão de Hgb reduzida estresse oxidativo e melhorou a viabilidade das células de cancro do colo do útero. Coletivamente, os nossos resultados sugerem que a Hb pode ser um componente do sistema de defesa antioxidante endógena, as células contra danos oxidativos proteger em pacientes com câncer cervical.

Resultados

Aumento Gene Expression Hgb em Cervical Cancer Amostras

Para investigar genes diferencialmente expressos em câncer cervical, analisamos um conjunto de dados microarray publicado anteriormente, incluindo 33 do cancro do colo do útero e 24 amostras normais. Em comparação com epitélio cérvix normal, amostras de cancro do colo do útero mostraram um aumento significativo na expressão de genes e HbA1 HBB (Tabela 1). No entanto, a expressão de factores de transcrição para a diferenciação eritróide [27], incluindo NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL e GATA1 não aumentou. Além disso, a expressão de outros genes de hemoglobina (HBD, HBE1, HBG2, HBQ1 e HBZ) e genes marcadores de eritrócitos específica, tais como SPTB, ERAF ALAS2 e não mostrou um aumento significativo. Estes resultados sugerem que hba1 elevada e expressão HBB no cancro do colo do útero não resultou de eritropoiese, mas a partir de um mecanismo diferente.

A fim de validar o papel potencial da Hgb no carcinoma cervical humano, os níveis de expressão de hba1 e HBB foram investigados em 20 amostras de cancro do colo do útero e 10 amostras de tecido do colo do útero normais por análise de qRT-PCR. Os primers específicos de hba1 e HBB foram projetados para qRT-PCR de acordo com o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) banco de dados. A especificidade dos iniciadores para a amplificação do gene HBB hba1 e foi confirmada utilizando ARN extraído de medula óssea e do sangue periférico humano como um controlo positivo (Fig. 1A). Em primeiro lugar, experiência RT-PCR foi realizada para determinar os níveis de expressão de genes e HbA1 HBB em 20 amostras de cancro do colo do útero (Fig. 1B). Consistente com o conjunto de dados de microarray, análise de qRT-PCR mostrou que a expressão do gene HBB hba1 e foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro do colo do útero do que em tecidos normais do colo do útero (Fig. 1C e D). No entanto, a expressão de factores de transcrição para a eritropoiese, incluindo GATA-1, KLF1, e SCL /TAL1 [27], não foi alterada de forma significativa em tecidos de cancro do colo do útero, em comparação com os controlos (dados não mostrados). A expressão de genes marcadores de eritrócitos específica, tais como SPTB, ERAF, não foi regulado para cima em tecidos de cancro do colo do útero, o que indica que o aumento da expressão de Hgb não foi associada com a eritropoiese. Estes resultados sugerem que a Hb pode desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro cervical humano.

(A) para confirmar a especificidade dos iniciadores para o gene HBB hba1 qRT-PCR, a expressão do gene HBB hba1 e foi examinada na medula óssea humana e células de sangue periférico. Retrotranscriptase livre (-) como um controlo negativo, H

2O como um controle de sistema. Mr, marcador. (B) a partir de ADNc de amostras de cancro do colo do útero foi preparado e analisado quanto à expressão do gene HBB hba1 e por RT-PCR. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% e visualizado com brometo de etídio. GAPDH foi usada como um controlo de carga. H

2O como um controle de sistema, T, representa amostras de tumor primário. Os níveis de expressão do gene HBB hba1 e foram medidos por qRT-PCR em 20 espécimes de cancro cervical humano e 10 controlos de tecido cervical normal. Quantificação da hba1 normalizado indicado e níveis HBB (log

10) do colo do útero total de desemparelhado normal (n = 10) e do cancro do colo do útero (n = 20) das amostras são mostrados. As caixas de Tukey representam os quartis superiores e inferiores divididas pela mediana e bigodes são os valores maiores e menores, excluindo valores extremos representados por círculos. Todas as diferenças foram estatisticamente significativas em

P

. 0,05 (C e D)

detecção da proteína Hgb em Carcinoma Cervical tecidos

A expressão de Hgb ao nível da proteína foi examinada usando anticorpos comerciais contra Hb humana altamente purificada. Devido à elevada homologia entre proteínas da família da globina, a especificidade do anticorpo para a detecção das correntes hba1 e HBB foi verificada por meio de transfecção de rim embrionário humano HEK293 células com vectores de expressão que transportam EGFP-tagged globina isoformas (HBA-A1, HBB-b1 , HBA-x, y-HBB, HBA-Z), que não mostrou qualquer reacção cruzada com outras globinas em experiências imunocoloração (Fig. S1). Para evitar a reactividade cruzada com as células do sangue, tecidos de cancro cervical foram extensivamente lavadas em PBS antes da fixação. Hematoxilina e eosina (H E) coloração de secções de tecido de câncer cervical mostrou bem carcinoma de células escamosas diferenciada (Fig 2A e B).. Em tecidos cancerosos, hba1 e HBB mostrou um padrão de coloração citoplasmática difusa (Fig. 2D e F). Um anticorpo monoclonal de IgG não específica diluída com PBS foi utilizado como controlo negativo (Figura 2C e E.)

Secções de tecidos de cancro cervical humanos embebidos em parafina foram submetidos a um H . E coloração ou análise immnunohistochemical com hba1 e anticorpos HBB. amostras de cancro do colo do útero mostrou carcinoma epidermóide bem diferenciado (A e B). S, estroma. coloração citoplasmática de hba1 e HBB foi detectado em amostras de biópsia a partir de tecidos do colo uterino (D e F). Um anticorpo monoclonal de IgG não específica diluída com PBS foi utilizado como controlo negativo (C e E). Duas vezes contra imunocoloração de p16

INK4A, um marcador específico de cancro do colo do útero, demonstraram que Hgb foi expressa em células do cancro do colo do útero (I, K, M e O). Branca tracejada caixas foram digitalmente ampliada (J, L, N e P). Imunofluorescência sem anticorpo primário revelou sinais negligenciáveis ​​em células de cancro do colo do útero (G e H).

A expressão da proteína Hb em tecidos de carcinoma uterino foi confirmada por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo específico contra a Hgb, que mostrou distinta padrões de coloração citoplasmática difusa em tecidos de câncer cervical (Fig. 2I). A omissão do anticorpo primário, no mesmo sistema de imunocoloração serviu como um controlo negativo (Fig. 2G e H). Duplo-imunomarcação utilizando anticorpos policlonais com reactividade cruzada contra hba1 e HBB e um anticorpo específico para p16

INK4A, um marcador específico de cancro cervical utilizado para citologia e diagnóstico histológico [28], [29], demonstraram a co-localização de Hgb com p16

INK4A em tecidos de câncer cervical (Fig. 2I-P). Estes resultados confirmaram que a proteína de Hgb é expressa em células do cancro do colo do útero.

A detecção de ARNm e proteína de Hgb em células cultivadas do cancro do colo

A expressão de Hgb foi examinada no ARNm e os níveis proteicos usando o SiHa e linhas de células humanas de carcinoma cervical CaSki cultivadas

in vitro

para verificar nosso

in vivo

resultados de expressão Hgb em células de câncer cervical. A análise de RT-PCR utilizando ARN de células de sangue humano como um controlo positivo mostrou a presença do mRNA para o hba1 e cadeias HBB de Hb humana em células de cancro cervical em cultura (Fig. 3a). A sequenciação dos produtos de PCR revelou que eles correspondiam a 100% com hba1 (NM_000558) e sequências de mRNA do gene HBB (NM_000518). Consistente com estudos anteriores em células alveolares e hepatócitos [12], [17], a expressão de hba1 era aproximadamente 9,6 vezes maior do que a de HBB por qRT-PCR (dados não mostrados). A análise Western blot usando anticorpos específicos contra hba1 e HBB mostraram níveis baixos de expressão de proteína de Hgb nas linhas celulares analisadas. Proteína extraída a partir de leucócitos de sangue periférico (PBL) foi utilizado como um controlo positivo (Fig. 3B). A imunoprecipitação revelou uma banda clara de 17 kDa que foi especificamente enriquecido a partir de lisados ​​celulares (Fig. 3C). Aproveitando andibodies comerciais produzidos contra hba1 humana e HBB, análise de imunofluorescência foi realizada para examinar a localização da proteína Hb em células SiHa, que mostrou um padrão de coloração citoplasmática semelhante do hba1 e formas HBB como a de tecidos de cancro do colo do útero (Fig. 3D-G). Double-imunocoloração revelou que Hgb foi co-localizada com o câncer cervical marcador p16

INK4A (Fig. 3H-J). Resultados semelhantes foram obtidos em uma outra linha de células de cancro do colo do útero, CaSki (Fig. S2), confirmando a expressão de Hb em células de cancro cervical em cultura. Notavelmente, os dois tipos de células expressaram mais do que hba1 HBB nos níveis de ARNm e de proteína. Como Hgb é susceptível de agir como heterotetr�ero por duas subunidades diferentes, aproveitamos as experiências de co-imunoprecipitação para interrogar se hba1 e expressão HBB no cancro do colo do útero são capazes de formar heterodímeros. Como pode ser visto na Fig. S3, a fraca presença de hba1 heterodímeros endógenos /HBB foi confirmada por experiências de co-imunoprecipitação.

(A) amplificação RT-PCR de hba1 e HBB de SiHa, células CaSki e RNA sangue humano. O hba1 e transcritos HBB foram claramente amplificado a partir das linhas celulares de cancro cervical humano, SiHa e CaSki. RNA extraído a partir de sangue foi usada como um controlo positivo e de GAPDH foi detectado como um controlo de carga. amplicão identidades foram confirmadas por sequenciação. (B) e HbA1 HBB foram analisadas por western blotting. Leucócitos do sangue periférico (PBL) foram usados ​​como um controlo positivo e β-actina foi detectado como um controlo de carga. (C) Os lisados ​​celulares de células SiHa e CaSki foram imunoprecipitados e imunotransferidas com os anticorpos indicados. Uma faixa clara de 17 kDa foi enriquecida a partir SiHa e CaSki lisados ​​por imunoprecipitação utilizando um anticorpo Hgb anti-humano. IgG não específica foi utilizado como controlo imunoprecipitação. coloração citoplasmática de hba1 e HBB foi detectada nas células do cancro do colo do útero (D e E, F e G). Duas vezes com imunocoloração de p16

INK4A, um marcador específico de cancro do colo do útero para a citologia e diagnóstico histológico, demonstraram que Hgb foi expresso por células do cancro do colo do útero (H-J). Inserções são ampliados imagens de áreas selecionadas (pequenos quadrados).

Up-regulação da hba1 e HBB Expressão em células de cancro do colo do útero pelo estresse oxidativo

Para determinar se a função de Hgb em nonerythrocytes é diferente do seu papel conhecido como transportador de oxigénio, foi examinada a expressão da proteína em células SiHa e CaSki em resposta ao estresse oxidativo com base em evidências anteriores das propriedades antioxidantes de Hgb. O tratamento de células SiHa com H

2O

2 aumentou a expressão do gene HBB hba1 e no ARNm e os níveis da proteína (Figs. 4A e B). Resultados semelhantes foram obtidos em uma outra linha de células de cancro do colo do útero, CaSki (Fig. S4). A indução de Hb por H

2O

2 foi confirmada em células HEK293 (Fig. 4C), sugerindo que a expressão de Hgb pode ser regulada para cima por stress oxidativo em diferentes tipos de células.

(A ) hba1 e expressão de mRNA HBB em células SiHa foi induzida por H

2O

2 tratamento. células SiHa foram tratados com H

2O

2 (1 mM) durante 24 horas e os níveis de ARNm de Hgb foram determinados por qRT-PCR. níveis de Hb em controles foram normalizados para 1. Os dados foram expressos como média ± SD (n = 3)

**

P

. 0,01. (B) a expressão hba1 e proteína HBB foi induzida por H

2O

2 tratamento. Os lisados ​​celulares totais obtidos a partir de células SiHa tratados com ou sem H

2O

2 (1 mM, 48 h) foram analisadas para os níveis e HbA1 HBB. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) hba1 e HBB mRNAs foram up-regulada por H

2O

2 tratamento em células HEK293. As células HEK293 foram tratados com H

2O

2 (1 mM, 36 h). Os produtos de PCR de transcrição reversa foram separados em géis de agarose a 2% e visualizado com brometo de etídio. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (D) A dose e a dependência do tempo da resposta de células SiHa a H

2O

2 tratamento. células SiHa foram tratados com uma série de concentrações (0, 0,25, 0,5 e 1 mM) de H

2O

2 para 8, 16, 24 ou 36 h. nível de ARNm hba1 relativa foi determinada por qRT-PCR. Os dados foram expressos como média ± SD (n = 3). Os valores foram normalizados para o nível hba1 no controle (0 mM, 8 H), o qual foi definido como 1. Uma forma de teste ANOVA para comparações múltiplas foi utilizado para analisar as diferenças entre os tratamentos.

**

P Art 0,01;

***

P

. 0,001, quando comparado ao tratamento 0 mM

Para examinar a possibilidade da dose e do tempo de dependência do H

2O

2 induzida por sobre-regulação de Hgb, células SiHa foram tratadas com diferentes sub H

2O

2 concentrações para vários períodos de tempo e analisadas por qRT-PCR padrão. Como pode ser visto na Fig. 4D, H

2O

2 aumentou os níveis de mRNA de Hgb de uma maneira dose e dependente do tempo. O efeito do stress oxidativo na expressão do GATA-1 e KLF1, que são factores de transcrição que regulam a expressão de Hb durante a eritropoiese, foi examinada. Consistente com um estudo prévio em hepatócitos [17], a sobre-regulação de Hb por H

2O

2 não foi mediado pelo GATA-1 e KLF1, sugerindo que um mecanismo subjacente diferente pode estar envolvida (Fig. S5 ).

Atenuação de ROS Geração e apoptose indução por hba1 /HBB ou hba1, mas não hba1

H88R /HBB

H93R superexpressão em células de cancro do colo

Para investigar o biológico papel da Hgb em células de cancro do colo do útero, hba1 e HBB foram sobre-expressos por transfecção transitória de células SiHa. A expressão aumentada do gene HBB hba1 e foi confirmada por imunotransferência (Fig. 5A). Com base em um estudo anterior mostrando que certos genes induzíveis estresse oxidativo tem funções antioxidantes [30], a hipótese de que Hgb pode ter propriedades antioxidantes em células de câncer cervical em resposta ao estresse oxidativo. Estudámos, portanto, os níveis intracelulares de ROS em células tratadas com H

2O

2, utilizando sondas fluorogênicos e ânion superóxido. A expressão ectópica de hba1 /HBB em células SiHa tratada com exógeno H

2O

2 suprimiu a produção intracelular de H

2O

2 e superóxido anião tal como determinado por análise de imunofluorescência (Fig. 5B e C) . Quantificação da produção de ROS por citometria de fluxo mostrou que a intensidade de fluorescência em células que sobre-expressam hba1 /HBB foi significativamente menor do que nas células de controlo transduzidas com lentivírus (Fig. 5D e E). Percentagem de células por contagem total com níveis elevados de cada ROS nas células que sobre-expressam hba1 /HBB foi significativamente reduzida em comparação com a transfecção com o vector vazio como um controlo (

P

0,05, n = 3 para cada grupo; Fig . 5F e G). Resultados semelhantes foram observados em células CaSki (dados não mostrados). O facto de o nível de hba1 em linhas celulares de cancro do colo do útero expressão é maior do que a do gene HBB sugere que múltiplas moléculas bioactivas, e não apenas as formas heterodiméricas, mas também formas monoméricas ou homodímero da proteína hba1 podem estar presentes ao mesmo tempo no cancro do colo do útero células. Em apoio a esta hipótese, as células SiHa estavam apenas transfectadas com hba1 e depois tratada com exógena H

2O

2. Consistente com um estudo recente [31], percentagem total de células por contagem com níveis intracelulares de ROS nas células que sobre-expressam hba1 foi significativamente menor do que a de células transfectadas com o vector de controlo (Fig. 5H). Para descartar qualquer efeito generalizada ou não selectiva devido à sobre-expressão não específica de protiens, geramos uma linha celular que expressa uma forma inativa de Hgb transportando uma mudança de aminoácido na Sua responsável pela coordenação do grupo prostético hemo (hba1

H88R [ ,,,0],31] e HBB

H93R, Fig. S6). Como pode ser visto na Fig. 5I, os níveis de ROS intracelulares em células com superexpressão hba1

H88R /HBB

H93R não foram significativamente reduzidos, em comparação com a de células transfectadas com vector vazio, sugerindo que a atividade heme-ligação é necessário para a função antioxidante Hgb.

(a) os lisados ​​de células inteiras a partir de células SiHa transfectadas com um plasmídeo de controlo ou hba1 e plasmídeos de expressão HBB foram analisados ​​com um anticorpo anti-Hb para confirmar a sobre-expressão de proteínas de globina. Hba1 /HBB- células com superexpressão de Controle e foram coradas com sondas fluorogênicos para detectar intracelular H

2O

2 e ânion superóxido e expostos a extracelular H

2O

2 (1 mM) durante 10 min. A imunocoloração confirmou que a geração intracelular de H

2O

2 (B) e anião superóxido (C) foi reprimida em células hba1 /HBB-sobre-expressam. A citometria de fluxo de análise confirmou estes resultados (D e E) e mostraram que os níveis intracelulares de H

2O

2 e anião superóxido foram maiores nas células expostas a estímulos extracelulares do que nas células não tratadas (B e C). As análises quantitativas confirmou que a geração intracelular de H

2O

2 (F) e anião superóxido (L) foi inibida em células hba1 /HBB que sobre-expressam (coluna preta) mais do que em células de controlo (coluna cinzenta;

P

0,05). As análises quantitativas confirmou que a geração intracelular de ROS foi reduzida nas células que sobre-expressam hba1 (coluna preta, H), mas não em hba1

H88R /HBB

H93R que sobre-expressam as células (coluna preta, I), mais do que no controle células-superexpressão do vetor (coluna cinza). *

P Art 0,05; **

P Art 0,01;

N

P Art . 0,05

A lactato desidrogenase (LDH) ensaio de citotoxicidade, que mede a libertação de LDH no meio de cultura, foi realizada para examinar a viabilidade celular sob estresse oxidativo. células SiHa com superexpressão hba1 e HBB mostraram taxas de libertação de LDH de 22,1 ± 2,2% e 32,5 ± 3,4% em resposta ao tratamento com 0,5 mM e H 1

2O

2 durante 24 h, respectivamente, em comparação com 29,6 ± 3,1 % e 34,6 ± 2,1%, respectivamente, em células transfectadas com vector vazio (

P Art 0,01 e

P Art 0,05 para 0,5 e 1 mM H

2O

2, respectivamente; n = 3 para cada grupo) (Fig 6A).. a viabilidade das células SiHa também foi melhorada por hba1 e sobreexpressão do gene HBB quando as células foram tratadas com 0,5 mM e 1 mM de H

2O

2, durante 36 h (

P

0,01). Resultados semelhantes foram obtidos em hba1-superexpressão células SiHa (Fig. 6B). Em seguida, investigaram se a função de Hgb para melhorar a viabilidade das células depende da sua actividade de ligação a heme, usando o hba1

H88R /HBB

mutantes H93R, que são incapazes de se ligar heme, mas preservar a conformação da cadeia. Como pode ser visto na Fig. 6B, mutação do seu responsável pela coordenação do grupo prostético heme (hba1

H88R e HBB

H93R) de HgbA prejudica sua capacidade de melhorar a viabilidade celular.

(A) a viabilidade das células SiHa tratou-se com 0, 0,5, e 1 mM de H

2O

2 para 12, 24 e 36 horas como o stress oxidativo extracelular foi avaliada pelo ensaio de libertação de LDH. células SiHa transfectadas com os vectores hba1 /HBB-expressam (coluna preta) apresentou uma maior resistência contra o H

2O célula

2-induzida em comparação com células transfectadas com o vector de controlo (coluna cinzenta). Experiências semelhantes foram pré-formada em ambas as células hba1-superexpressão e hba1

H88R /HBB

células H93R-superexpressão (B). células SiHa foram transfectadas com os plasmídeos indicados. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram tratadas com 1 mM de H

2O

2 ou deixada sem tratamento durante 22 h. A percentagem de células apoptóticas foi monitorizada por coloração com anexina V, seguido por análise de FACS (C). células SiHa foram transfectadas com os plasmídeos indicados e 40 horas mais tarde, foram tratadas como em (A), a actividade da caspase-3 no grupo diferente foi medida usando substrato de caspase específica AcDEVD-pNA como descrito sob Materiais e Métodos. Os valores de absorção foram expressos como o controlo que foi definido como 1 (D e E). Todas as experiências foram realizadas em triplicado e foram repetidas pelo menos três vezes, e os resultados são expressos como médias ± S.E.M *

P

. 0,05; **

P Art 0,01;

N

P Art . 0,05

ROS (superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila) são oxidantes intracelulares potentes e indutores do dano oxidativo, que têm sido propostas como reguladores críticos da apoptose [32] e os tratamentos com antioxidantes proteger as células da apoptose [33]. Dado que a presença de Hb (seja hba1 ou hba1 /HBB) leva a reduzir a produção de ROS interacellular, é concebível que essas células retêm a capacidade de se proteger de insultos oxidativos. Assim, nós levantamos a questão de saber se a protecção Hgb mediada contra a morte celular em células SiHa foi simplesmente por causa da reduzida acumulação intracelular de ROS. Nós exploramos essa possibilidade, determinar o efeito de tipo selvagem hba1 /HBB, hba1, e mutantes hba1

H88R /HBB

H93R-superexpressão sobre H

2O

2-apoptose induzida por análise de citometria de fluxo utilizando células SiHa. Como mostrado na Fig. 6C, os resultados mostraram que a população das células em apoptose induzida por H

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2 foi inibida em ambos os hba1 e células /HBB-superexpressão hba1, mas não em hba1

H88R /HBB

H93R -overexpression células. A activação de uma protease de cisteína, denominada caspase-3 e a geração de ROS foram considerados passos chave na indução da morte de células [34] e é sabido que a produção de ROS na mitocôndria activa da caspase-3 através da cooperação de citocromo

C

, Apaf-1 e caspase-9 [35]. A seguir, investigou o efeito de Hgb na activação da caspase-3. Consistente com o ensaio de ligação de anexina V, verificou-se que o aumento da activação de caspase-3 causada por 0,5 mM e 1 mM de H

2O

2 após incubação durante 12, 24 e 36 h, respectivamente, pode ser significativamente reduzida em ambos hba1 e células hba1 /HBB-sobre-expressão, em comparação com o vector vazio (Fig. 6D). Em contraste, a expressão ectópica de hba1

H88R /HBB

H93R em células SiHa não foi eficaz na prevenção H

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2 induzida por ativação de caspase-3 (Fig. 6E), sugerindo que heme- a actividade de ligação é necessária para a sua função. Em resumo, estes resultados sugerem que tanto hba1 e hba1 /HBB superexpressão pode ter um efeito antioxidante através de eliminação de ROS, protegendo assim as células cancerosas cervicais contra danos induzidos por estresse oxidativo.

Discussão

no presente estudo, nós mostramos que a expressão Hgb foi elevada em tecidos de câncer do colo do útero em comparação com os tecidos do colo do útero normais. Esta é a primeira evidência de que as cadeias a- e β-globina de Hgb são expressos em células de cancro do colo do útero. Utilizou-se as linhas de células de carcinoma cervical CaSki e SiHa para examinar Hgb-α e Hb-β ARNm e a expressão da proteína usando três abordagens diferentes: RT-PCR, a imunocoloração e análise de Western blot. Além disso, Hgb atenuou o estresse oxidativo induzido peróxido de hidrogênio em células de cancro do colo do útero, agindo como um antioxidante.

O longa noção de que a Hb é expressa apenas nas células da linhagem eritróide foi contestada em estudos recentes que mostram Hgb expressão em nonerythrocytes, incluindo neurônios [7], [8], [9], as células da retina [10], [11], células epiteliais alveolares [12], [13], [14], endométrio [15], de rim de rato células mesangiais [16], hepatócitos [17] e macrófagos [18]. A principal função de Hb nos eritrócitos é transportar oxigénio a partir do pulmão para os tecidos e para o transporte de dióxido de carbono a partir dos tecidos para o pulmão. A função biológica de Hb em células nonerythroid continua a ser elucidado e a sua função fisiológica é ainda uma questão em debate. Hgb sobre-expressão numa linha de células de murino dopaminérgico, MN9D, alterou a expressão de vários genes envolvidos na homeostase do oxigénio e a fosforilação oxidativa mitocondrial, sugerindo que a Hb pode funcionar como molécula de armazenamento de oxigénio em neurónios [9]. Hgb superexpressão no rato renal linha celular mesangial SV40-MES13 ea linha de células de câncer hepatocelular humano HepG2 reduzida de hidrogénio peroxide- estresse oxidativo induzido, sugerindo que as funções Hb como um antioxidante [16], [17].

Embora