Abstract

oxysterols são produtos de oxidação de colesterol. Colestano-3β, 5α, 6β-triol (abreviado como triol) é uma das mais abundantes e oxiester�is activas. Aqui, nós relatamos que triol apresenta actividade anti-cancerígena contra células cancerosas humanas da próstata. O tratamento de células com proliferação dependente da dose, o triol suprimida de LNCaP CDXR-3, DU-145 e PC-3 de células de cancro da próstata humano e reduziu a formação de colónias em agar mole. A administração oral de triol a 20 mg /kg por dia durante três semanas, retardou significativamente o crescimento de xenoenxertos PC-3 em ratinhos nus. A análise de citometria de fluxo revelaram que o tratamento triol em 10-40 uM causada paragem do ciclo celular G1, enquanto o ensaio TUNEL indicaram que o tratamento a 20-40 uM triol apoptose induzida em todas as três linhas de células. As matrizes micro-ocidentais e os métodos de Western blotting tradicionais indicaram que o tratamento triol resultou em expressão reduzida de Akt1, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, PDK1, c-myc, e os níveis de proteína Skp2, bem como a acumulação do p27 inibidor do ciclo celular

Kip. tratamento triol também resultou na expressão da proteína Akt1 reduzida em PC-3 xenotransplantes. A sobre-expressão de Skp2 em células PC-3 resgatou parcialmente a inibição do crescimento causada pelo triol. O triol tratamento suprimida migração e invasão de DU-145, PC-3, e células CDXR-3. Os níveis de proteínas associadas com a transição epitelial-mesenquimal, bem como quinase de adesão focal de expressão foram afectados pelo tratamento triol nestas células. tratamento triol causou um aumento da expressão dos níveis de proteína E-caderina, mas diminuiu a expressão de N-caderina, vimentina, Slug, FAK, fosfo-FAK Ser722, e os níveis de proteína fosfo-FAK Tyr861. A microscopia confocal a laser revelou redistribuição de β-actina e α-tubulina na periferia das células CDXR-3 e DU-145. As nossas observações sugerem que o triol pode representar um agente terapêutico promissor para o cancro da próstata metastático avançado

citação:. Lin C-Y, Huo C, Kuo G-K, Hiipakka RA, Jones RB, Lin H-P, et al. (2013) colestano-3β, 5α, 6β-triol suprime a proliferação, migração e invasão das células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 8 (6): e65734. doi: 10.1371 /journal.pone.0065734

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 28 Dezembro, 2012; Aceito: 27 de abril de 2013; Publicação: 13 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo CS-101-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-MY3 e NSC 101-2325-B-400-014 (Conselho Nacional de Ciência) em Taiwan por CPC; DOH101-TD-C-111-004 (Departamento de Saúde) em Taiwan por JYC e CPC. CYL é suportado por DOH101-TD-C-111-004. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

de próstata é o segundo câncer mais freqüentemente diagnosticado de homens eo quinto câncer mais comum global no mundo. Em 2008, mais de 899.000 novos casos foram diagnosticados (GLOBOCAN 2008 banco de dados, versão 1.2). Nos países ocidentais, o câncer de próstata é o carcinoma não-cutâneo mais comum dos homens. De acordo com as estatísticas da Vigilância Epidemiologia e Resultados Finais (SEER) do Instituto Nacional do Câncer, mais de 240.000 homens foram diagnosticados com e mais de 28.000 homens morreram de câncer de próstata em 2012 nos Estados Unidos. Embora a cirurgia é muitas vezes bem sucedida para o câncer de próstata confinado ao órgão, a terapia de ablação de androgénios é o tratamento primário para câncer de próstata metastático. Infelizmente, a maioria dos pacientes com câncer de próstata que recebem a terapia de ablação do andrógeno acabará por desenvolver recorrentes, tumores resistente à castração dentro de 1-3 anos após o tratamento. O tempo médio de sobrevivência global é de 1-2 anos após recidiva do cancro [1], [2]. Não existe nenhuma terapia padrão eficaz para os pacientes que sofrem recaídas com câncer de próstata avançado. A quimioterapia é muitas vezes utilizado para tratar metastático 2,3 câncer de próstata hormônio-refratário. No entanto, quimioterapias geralmente mostram pouco efeito sobre a prolongar a sobrevivência. Portanto, são necessários novos tratamentos para câncer de próstata avançado.

oxysterols são produtos de oxidação de colesterol. Oxiester�is desempenham um papel essencial na regulação da homeostase do colesterol, a agregação de plaquetas, a apoptose, e a prenilação de proteínas [4]. No entanto, oxiester�is estão associados com o desenvolvimento de aterosclerose, doença neurológica, e cancros [4]. Certos oxiester�is têm sido relatados para exibir efeitos anti-cancro, possivelmente através da modulação do efluxo de colesterol, Akt, ou receptores X do fígado (LXRs) [5], [6]. Por exemplo, o tratamento com 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol, 7α-hidroxicolesterol, 7β-hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, e 5α, 6α-epoxicolesterol suprimiu a proliferação de humano da próstata, mama, cólon, pulmão, e células cancerosas de leucemia [7] – [14]. Estes oxiester�is causada quer G1 paragem do ciclo celular [7] – [11] ou a apoptose em células cancerosas [12] – [14]. Portanto, oxiester�is com actividade citotóxica pode ser um agente terapêutico potencial para o cancro da próstata avançado.

colestano-3β, 5α, 6β-triol (abreviado como triol) é uma das mais abundantes oxiester�is. O triol é derivado a partir do colesterol por oxidação, via a formação de 5α, 6α-epoxicolesterol e 5β, 6β-epoxicolesterol [15], [16] como intermediários. Anteriormente, 5α, 6α-epoxicolesterol foi relatada como exibindo actividade anti-cancro [13]. Neste estudo, nós examinamos a capacidade de triol para suprimir a proliferação de linhas humanos avançadas de células de câncer de próstata ambos

in vitro

e

in vivo

. Aplicou-se micro-matrizes Ocidental,, num ensaio à base de anticorpo recentemente desenvolvida de alto rendimento Western Blotting [17] – [20], para estudar as proteínas de sinalização afectadas pela triol em células de cancro da próstata avançado. Nossas observações sugerem que triol pode representar um agente terapêutico promissor para o câncer de próstata metastático avançado.

Materiais e Métodos

Materiais

colestano-3β, 5α, 6β-triol foi comprado a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). Matrigel foi comprado de BD Bioscience (San Jose, CA, EUA).

Cultura celular

linhas celulares de cancro da próstata PC-3, DU-145 e LNCaP sublinhas foram um presente do laboratório do Professor Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, EUA). Estas linhas de células foram previamente descritos [7], [8], [10], [21] – [27]. LNCaP CDXR-3 foram subcultivadas e mantidas como descrito anteriormente [7], [8], [10], [11], [21] – [23], [27]. DU-145 e PC-3 foram mantidas em DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, EUA), penicilina (100 U /ml ), e estreptomicina (100 ug /ml) (meio completo), como previamente descrito [28]. As células PZ-HPV-7 foram adquiridos da Colecção Bioresource e Research Center (BCRC, Cidade Hsinchu, Taiwan) e foram cultivadas num meio isento de queratinócitos de soro (Gibco /Invitrogen) com um factor de 5 ng /mL de recombinante humana de crescimento epidérmico e 50 ug /ml de extracto de pituitária bovina.

Ensaio de Proliferação celular

As células foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

3 células /poço em 100 ul de meio completo em placas de 96 poços. Os ensaios de proliferação foram realizados sob condições de manutenção (meio DMEM com FBS a 10% para PC-3 e DU-145; DMEM com 10% de CS-FBS durante LNCaP CDXR-3). número relativo de células foi analisada através da medição do teor de ADN de lisados ​​de células com o corante fluorescente Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) como descrito anteriormente [8], [10], [11], [21], [ ,,,0],23], [24], [27], [28]. Todas as leituras foram normalizados para a média da condição de controlo (sem tratamento triol) em cada experiência individual. A experiência foi repetida três vezes. Dez poços foram utilizados para cada condição. A média eo desvio-padrão representou a média e desvio padrão, respectivamente, dos resultados de todos os 30 poços nos três experimentos.

Viabilidade Celular Ensaio

As células foram semeadas a uma densidade de 3 × 10

3 células por poço numa placa de 96 poços (BD Bioscience). Após 24 horas, as células foram tratadas com concentrações crescentes de triol para 48 horas ou 96 horas. A viabilidade celular foi avaliada por um MTT (3,4,5-dimetiltiazol-2-il) -2-5-brometo de difeniltetrazólio) ensaio [29]. A quantidade de formazano foi determinada medindo a absorvância a 560 nm utilizando um leitor de placas Tecan GENios ™ (Tecan Group Ltd, Männedorf, Suíça) [29]. Todos os resultados foram normalizados para a média da condição de controlo (sem tratamento triol) em cada experiência individual. A experiência foi repetida três vezes. Cada vez que dez poços foram utilizados para cada condição. A média eo desvio-padrão representados os resultados de todos os 30 poços nos três experimentos.

Fluxo de análise de citometria de

As células foram semeadas a uma densidade de 5 × 10

5 células em 10- pratos cm em 10 mL de meio e cultivadas durante 24 horas antes da adição de triol. Após 48 horas de cultura na presença de várias concentrações de triol, as células foram removidas com tripsina e fixadas em 70% de etanol em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante a noite a -20 ° C. As células fixadas foram lavadas com PBS, tratadas com 0,1 mg /ml de RNase A em PBS durante 30 min, e em seguida suspensas em PBS contendo 50? g de iodeto de propidio /mL. perfis do ciclo celular e distribuição foram determinados por análise de citometria de fluxo de células utilizando um citómetro de fluxo BD FACScan (BD Biosciences). A distribuição do ciclo celular foi analisada utilizando o software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EUA) como descrito [10], [23], [24], [26], [27].

macia Formação de Colónia agar Ensaio

PC-3 e LNCaP CDXR-3 células (8 × 10

3) foram suspensos em 0,3% de agarose de baixa fusão (Lonza, Allendale, NJ, EUA) contendo DMEM com 10% FBS ou 10% de carvão despojado de FBS (CS-FBS), respectivamente, e, em seguida, em camadas em cima de 3 mL de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% solidificado contendo meio DMEM com FBS a 10% (PC-3) ou 10% de CS-FBS ( CDXR-3) em 6 cm pratos. As células foram deixadas a crescer a 37 ° C com 5% de CO2 durante 14 dias (PC-3) ou 17 dias (CDXR-3). As placas foram coradas com violeta de cristal de 0,005% em etanol a 30% durante 6 horas para detectar colónias de células.

Ensaio TUNEL

As células foram cultivadas sobre lamelas em 24 poços e foram tratadas com 0, 20, 40 e triol uM durante 48 ou 96 horas. As células foram lavadas duas vezes com PBS e submetidas ao ensaio de TUNEL A fragmentação de ADN utilizando ApoAlert Assay Kit (catálogo n °. 630108 a partir de Clontech, Mountain View, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células TUNEL-coradas foram observadas com Olympus microscópio confocal a 200 × (FV300, Olympus, Tóquio, Japão).

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (Taiwan). O protocolo foi aprovado pela Comissão Nacional Institutos de Pesquisa de Saúde Animal Care Institucional e Use (INDH-IACUC-101.046-A). Os ratos foram mantidos sob condições ambientais controladas (22 ° C, ciclos de luz-escuro de 12 horas alternados, 50% de umidade, comida e água ad libitum). Anestesia (isoflurano 1%) foi dado para reduzir a dor em ratos durante a inoculação de células de câncer de próstata. cuidados com os animais foi conduzido de acordo com as diretrizes éticas padrão (Institutos Nacionais de Saúde do “Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório” e medicina de animais de laboratório clínico (K. Hrapkiewicz, L. Medina, e DD Holmes de 1998, Iowa State University Press). o experimento foi projetado para minimizar o número de ratos pelados utilizados.

xenoenxertos de tumores em ratinhos atímicos

Experimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo National Health Research Institutes animal Care Institucional e Comitê de Uso ( INDH-IACUC-101046-a). Male Balb /c nu /nu ratinhos (NCI Frederick, MD), com 6-8 semanas de idade, foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos com 5 × 10

5 PC-3 de células em suspensão em 0,5 ml de Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, EUA). Monitorização do crescimento do tumor foi iniciado uma semana depois da inoculação do tumor. os ratinhos foram separados em grupos de controlo e de tratamento. 5 ratinhos que transportam 10 tumores formaram o grupo de controlo e 5 ratinhos 8 transportando tumores composto do grupo de tratamento. Três semanas após a inoculação de células PC-3, os ratos no grupo de tratamento foram tratados por via oral, 5 dias /semana com 20 mg /kg de triol. O triol foi administrado num veículo contendo 1% de Tween 20, 25% de dimetilsulfóxido em PBS. Os ratos no grupo de controle foram tratadas por gavage com apenas veículo. O triol tratamento foi iniciado 21 dias após a inoculação das células e prosseguiu durante 21 dias. Os tumores foram medidos semanalmente usando pinças e o volume foi calculado utilizando o volume fórmula = comprimento x largura x altura x 0,52 [7], [21] – [23].

luciferase repórter Ensaio

células PC-3 foram semeadas a 2 x 10

5 células /poço numa placa de 12 poços em DMEM contendo 10% de FBS. 24 horas após o plaqueamento, PC-3 foram transfectadas com pRL-TK-Renilla plasmídeo da luciferase (vector de normalização; 5 ng /poço), pSG5RXRα e pSG5LXRα (400 ng /poço), 4xDR4Δ56cfos pGL3 (repórter gene do vector; 500 ng /cavidade ) utilizando o PolyJet ™ em reagente de transfecção de ADN in vitro (SigmaGen Laboratories, Rockville, MD, EUA). 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas com concentrações crescentes de triol ou T0901317. Após um período adicional de 24 horas, as células foram lisadas em 100 ul de tampão de lise passiva (Promega, Madison, WI, EUA) e a actividade de luciferase foi medida utilizando um kit de Dual-Luciferase (Promega) num 20/20

n luminómetro Turner Biosystems .

Análise Western Blotting

amostras de células foram submetidas a lise em tampão de lise de SDS (Tris-acetato 240, 1% de SDS, 1% de glicerol, EDTA 5 mM, pH 8,0, ditiotreitol 0,1 mM) contendo os inibidores de protease 1 mM ácido 4- (2-aminoetil) fluoreto de benzenossulfonilo (AEBSF), 0,8 uM de aprotinina, 40 uM de bestatina, 14 uM de e-64, 20 uM de leupeptina, 15 uM de Pepstatina a (Sigma-Aldrich, P8340) e a fosfatase inibidores cantaridina, bromotetramisole e microcistina LR (Sigma-Aldrich, P2850). amostras de tecidos foram preparadas a partir de tecido homogeneizado em 2 × tampão de Laemmli, como previamente descrito [7], [21] – [24]. A expressão de proteínas, incluindo Akt1, Skp2, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, PDK1, fosfo-p44 /42 MAPK Thr202 /Tyr204, CDK2, CDK6, sintase dos ácidos gordos (FASN), GSK-3α, a GSK-3β, Rb , ciclina B1, ciclina D1, fosfo-p38 MAPK Thr180 /Tyr182, fosfo-PDK1 Ser241, Ser780 fosfo-Rb, FAK, e MMP9 foi detectada usando anticorpos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). E-caderina, N-caderina e p27

KIP1 anticorpos eram da BD Biosciences (San José, CA, EUA). Anticorpos para a detecção de c-Myc, a caspase 3, caspase 8, caspase 9, PTEN eram de Epitomics (Burlingame, CA, EUA). Slug anticorpo foi comprado de Abgent (San Diego, CA, EUA). anticorpo foi vimentina da Thermo (Waltham, Massachusetts, EUA). Os anticorpos contra a Akt1, Akt2, Akt3, Bcl-2, p53, Cdk4, NF-kB, ciclina A, ciclina E1, E2 ciclina, E2F-1, fosfo-Ser21 GSK-3α, fosfo-GSK-3β Ser9, fosfo- c-Myc Thr58 /Ser62, fosfo-PTEN Ser385, Ser722 fosfo-FAK, fosfo-FAK Tyr861, e α-tubulina foram de Millipore (Billerica, MA, EUA). Os anticorpos de detecção α-tubulina, β-actina e GAPDH foram adquiridos a Novus (Littleton, CO, EUA). Anticorpos para Skp2, p21

Cip e p27

Kip eram de Santa Cruz (Dallas, TX, EUA). Peroxidase de rábano conjugada com anti-coelho e anticorpos secundários anti-IgG de ratinho eram de Santa Cruz. O sinal de anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano foi detectado por quimioluminescência melhorada reacção (kit de detecção ECL Western Blotting) (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). GAPDH, α-tubulina, e β-actina foram utilizados como controlos de carga.

matrizes micro-Ocidental

CDXR-3 e células de DU-145 foram tratadas com veículo (DMSO) ou 10 ^ M triol durante 48 horas. Arrays Micro-ocidentais foram realizados para medir a expressão da proteína e modificação como descrito anteriormente [17], [18], [20], [24].

Skp2 superexpressão em células PC-3

a expressão ectópica de Skp2 foi conseguida através da infecção de células PC-3 com um retrovírus gerado a partir do plasmídeo contendo ADNc LPCX Skp2 humano do tipo selvagem, como descrito [10]. colónias resistentes puromicina foram expandidos e pesquisados ​​quanto a expressão aumentada de proteínas Skp2 por análise de Western blot. As células PC-3 infectadas com um retrovírus LPCX vazios foram utilizados como controlos [10]. As células foram lisadas em tampão de Laemmli sem corante azul de bromofenol.

em tempo real quantitativa de Reacção em Cadeia da Polimerase

O ARN foi extraído das células PC-3 e DU-145 tratados com 0, 10, e 20 triol uM durante 48 horas utilizando o RNeasy Minikit (cat. No. 74104, Qiagen, Venlo, Países Baixos) seguindo as instruções do fabricante. O ADN genómico foi removido por tratamento com DNase-a-coluna fornecido com o kit de mini. A concentração de RNA foi determinada espectrofotometricamente a 260 nm. Quantidades iguais de ARN foram utilizados nas reacções de síntese de ADNc, utilizando o Transciption reversa SystemRevertAid ™ H Minus kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). PCR em tempo real quantitativo foi realizado como anteriormente descrito [7], [8], [21] – [23], [28] utilizando SYBR sistema verde /«reagentes em um condições de placa e de ciclismo 96 poços ópticos constituídos por 2 min a 50 ° C, 10 min r 95 ° C, 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C, e 60 seg a 60 ° C num sistema ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As sequências dos iniciadores para de ligação ATP cassete transporter A1 (ABCA1) foram TGTCCAGTCCAGTAATGGTTC (avançar) e AAGCGAGATATGGTCCGGATT (reverso). O nível de transcrição de ABCA1 foi determinada em células PC-3 e DU-145 a seguir ao tratamento com 0, 10, e 20 uM triol durante 48 horas e foi normalizada para níveis de GAPDH em cada amostra.

Transwell Ensaio de Migração

Os ensaios de migração com células PC-3 foram realizadas com um kit transpoço de BD Bioscience (número de catálogo 353097). PC-3, DU-145, e células CDXR-3 foram tratados com triol de 0, 10, e 20 uM, durante 48 horas. As células foram então removidos das placas de cultura de tecidos com tripsina, e lavou-se duas vezes com PBS. células tratadas com triol (1 × 10

4) em 250 ul de DMEM sem soro foram colocados na câmara de invasão superior e o compartimento inferior foi carregada com DMEM contendo 10% de FBS. A câmara de migração celular foi inserido no compartimento inferior e incubada durante quer seis (PC-3, DU-145) ou 24 (CDXR-3) horas a 37 ° C. As células na parte superior do filtro foram removidas com um cotonete. Células ligadas ao filtro foram então fixadas com metanol durante 10 min. Células ligadas ao filtro foram depois coradas com corante de Giemsa (5%) durante 1 hora. Os filtros foram de-coradas por lavagem com água e o número de células ligadas para o filtro foi, então, quantificada por células enumerando em fotografias dos filtros coradas.

Transwell Invasão Ensaio

Um ensaio de invasão com PC-3 células foi realizada com fator de crescimento reduzidas câmaras invasão BD BioCoat Matrigel (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Células PC-3 foram tratados com diferentes concentrações de triol para 48 horas. As células foram então tripsinizadas e lavadas duas vezes com PBS. As células de cada condição foram semeadas a 4 x 10

4 células por poço em meio DMEM isento de soro no compartimento superior, e meio DMEM com FBS a 10% foi colocado no compartimento inferior da câmara como um quimio-atractor. Após 24 horas de incubação, as células não invasoras no lado superior da câmara foram removidas e as membranas foram fixadas com metanol, lavada, e coradas com solução de Giemsa. Invasividade foi avaliada através da contagem de células invasoras sob um microscópio de luz. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Cicatrização de Feridas Ensaio

3-CDXR células foram pré-tratadas com triol de 0, 10, e 20 uM, durante 24 horas. As células foram então removidos das placas de cultura de tecidos com tripsina, e lavou-se duas vezes com PBS. As células foram semeadas a uma concentração de 3,5 × 10

4 células /poço em placas de 12 poços. Após 24 horas, um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada por raspagem das células com uma ponta de pipeta de 200 uL. As células foram observadas aos 0, 8 e 24 horas após o desbaste, e fotografados com um microscópio de imagem ao vivo (Leica AF 6000 LX, Leica, Wetzlar, Alemanha). A distância de migração foi medida automaticamente pelo programa dentro microscópio imagens ao vivo.

microscopia confocal

CDXR-3 e DU-145 células foram tratadas com triol 0 ou 10 mM durante 24 horas. As células foram então lavadas 3 vezes com tampão PBS, durante 5 minutos por lavagem, à temperatura ambiente (TA), fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente, e lavadas com PBS 3 vezes durante 5 minutos por lavagem e permeabilizadas durante 10 minutos à RT com 0,1% de Triton X-100 em PBS. As células foram bloqueadas durante a ligação às proteínas não-específicos com 2% de albumina de soro bovino em PBS durante 30 min, lavadas com PBS três vezes durante 5 min cada. As células foram incubadas com β-actina ou anticorpo α-tubulina durante uma hora. Após lavagem, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC durante uma hora. Após lavagem, as células foram montadas sob lamelas de vidro e seladas com Permount. Imagens de células foram observados com um microscópio confocal Olympus em 400 × (lente ocular 10 ×; lente objetiva 40 ×). (FV300, Olympus, Tóquio, Japão)

Análise de Dados

Os dados são apresentados como a média +/- DP de pelo menos três experiências ou são representativas de experiências repetidas pelo menos três vezes. teste t de Student (de duas caudas, não emparelhado) foi utilizado para avaliar a significância estatística dos resultados das experiências de ensaio de proliferação. A ED50V10 programa add-in Microsoft Excel foi utilizado para o cálculo da metade máxima concentração eficaz (CE

50).

Resultados

O triol suprimiu a proliferação de células cancerosas humanas da próstata

o primeiro procuraram determinar o efeito do tratamento sobre a viabilidade triol e proliferação de três linhas celulares de cancro da próstata humano vulgarmente usados ​​(Fig. 1). células LNCaP CDXR-3 são receptor de andrógeno (AR) células -positivas, recidiva, andrógeno-independente derivadas de células parentais AR-positivas andrógeno-dependentes LNCaP 104-S [27]. DU-145 e PC-3 ambos são células andrógeno-insensitive AR-negativas estabelecidas a partir de cérebros [30] e de ossos [31] metástase derivada, respectivamente. Um ensaio de MTT e a ensaios de proliferação baseados em corante Hoechst indicou que triol suprimida tanto a viabilidade celular e a proliferação celular (Fig. 1). O efeito inibidor sobre a proliferação foi dependente da dose e um aumento ao longo do tempo (Fig. 1, Tabela S1). A CE

50 para o triol no ensaio de MTT foi semelhante à CE

50 medida pelo ensaio de Hoechst à base de corantes proliferação (Tabela S1), sugerindo que a inibição da proliferação celular foi responsável pela redução de células viáveis ​​causados ​​pela triol de tratamento em todas as três linhas de células de cancro da próstata avançado humanos.

LNCaP de cancro da próstata CDXR-3, DU-145 e PC-3 foram tratados com concentrações crescentes de triol para 48 horas (a) (C) ou 96 horas (B) (D). Relativa viabilidade e número relativo de células de células de cancro da próstata foi determinada por MTT (brometo de 3,4,5-dimetiltiazol-2-il) -2-5-brometo de difeniltetrazólio) ensaio de 96 poços (A) (B) e corante Hoechst 33258- ensaio à base de 96 poços proliferação (C) (D), respectivamente, como descrito em Materiais e Métodos. Os números de células foram normalizados para controlar (sulfóxido de dimetilo) de cada linha de células. Asterisco (*, **, ***) representa diferença estatisticamente significativa (

p Art 0,05,

p Art 0,01,

p Art 0,001) entre o grupo tratado eo grupo controle.

Formação triol Tratamento inibido Colônia de PC-3 e CDXR-3 células em macio Agar

Tratamento de PC-3 e LNCaP CDXR-3 células com 25 uM e 50 uM triol inibiu marcadamente a formação de PC-3 e LNCaP CDXR-3 colónias em agar mole, confirmando a actividade anti-cancro de triol. As células DU-145 cresceram muito lentamente, em agar macio para detectar número suficiente de colónias para posterior análise (Fig. 2).

PC-3 (A) e células LNCaP CDXR-3 (B) tratou-se com 0, 10, ou triol 20 uM durante 14 e 17 dias, respectivamente. A imagem é um resultado representativo de três réplicas biológicas.

O triol Tratamento crescimento retardado da andrógeno-insensitive Prostate Cancer xenoenxertos em ratinhos nus

Para determinar se triol podem suprimir o crescimento tumoral

in vivo

, foi realizado um estudo piloto usando DU-145 xenoenxertos em ratinhos nus. Intraperitoneal (i.p.) de 1 mg (50 mg /kg) de triol por dia durante 14 dias provocou uma redução de 36% no volume médio de DU-145 xenoenxertos de crescimento em ratinhos nus (Fig. S1). O triol tratamento durante 14 dias não afectou o peso corporal dos ratinhos (dados não mostrados). Para determinar se as doses orais mais baixas de triol poderia inibir o crescimento de xenoenxertos PC-3 da próstata. administrou-se por via oral triol a 20 mg /kg cinco vezes por semana. A administração oral de 20 mg /kg triol (5 vezes por semana) a partir da estr 3

6

th semanas causou uma redução de 65% no volume médio do tumor (p = 0,0002) no grupo de tratamento comparado com o volume tumoral no grupo de controlo de veículo (Fig. 3A). O peso corporal de ambos os veículos e os grupos tratados com triol diminuiu gradualmente (Fig. 3B). Isto pode ser devido a efeitos caquética de xenoenxertos PC-3. Estas observações confirmaram que a administração oral de triol poderiam retardar o crescimento de tumores de próstata

in vivo

.

subcutaneamente macho Balb /c nu /nu, ratinhos com 6-8 semanas de idade, foram injectados em ambos os flancos com 5 × 10

5 PC-3 de células em suspensão em 0,5 ml de Matrigel. Os tumores foram medidos diariamente utilizando pinças e o volume foi calculado utilizando o volume fórmula = comprimento x largura x altura x 0,52. Monitorização do crescimento do tumor foi iniciado uma semana depois da inoculação do tumor. Os ratinhos foram separados em grupos de controlo e de tratamento. O grupo controle tinha 5 ratinhos que transportam 10 tumores eo grupo de tratamento teve 5 ratinhos que transportam 8 tumores. Três semanas após a inoculação inicial, o grupo de tratamento foi administrado por via oral triol ao dia para uma dose de 20 mg /kg, 5 dias /semana. Os ratos no grupo de controle foram tratadas por gavage com apenas veículo. O tratamento foi iniciado no dia 22 e terminou no dia 42 após a inoculação do tumor. Os volumes tumorais foram apresentados como média ± erro padrão (A), enquanto o peso corporal dos camundongos foi mostrado como média ± desvio padrão (B).

O triol tratamento causou G1 paragem do ciclo celular em células cancerosas da próstata

a seguir, realizada uma análise de citometria de fluxo para determinar se a progressão do ciclo celular de células de cancro da próstata foi afectada pela triol. O tratamento com 10-triol uM durante 48 horas provocou um aumento na população de células de fase G1 e uma diminuição em S e G2 /M populações de fase de LNCaP CDXR-3 e DU-145 células de cancro da próstata (Fig. 4A, 4B). O triol a 10 uM não alterou a progressão do ciclo celular de células PC-3. No entanto, 20 uM triol causou um aumento significativo nos grupos G1 e diminuição do S e G2 /M populações de células PC-3 (Fig. 4C). Portanto, o tratamento com 10-20 pM de detenção triol induzida celular G1 do ciclo em LNCaP, DU-145, e células PC-3. Nós não observamos aumento da população sub-G1 nestas linhas celulares de cancro da próstata de três. Para determinar se as concentrações mais elevadas de triol irá aumentar a população de células em sub-G1, que trataram células DU-145, com 0, 20, e 40 uM triol (Fig. 4D). A redução da população da fase S e a indução da fase G1 população de células DU-145 foi ainda mais significativa após o tratamento com o triol 40 uM. No entanto, não houve um aumento significativo de células na população sub-G1.

LNCaP CDXR-3 (A) e células DU-145 (B) foram tratadas com 0 ou 10-triol uM durante 48 horas. As células PC-3 (c) foram tratados com triol de 0, 10, ou 20 | iM, durante 48 horas. células (D) DU-145 foram tratadas com 0, 20, 40 e triol uM durante 48 horas. a distribuição do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. Asterisco (*, **, ***) representa diferença estatisticamente significativa (

p Art 0,05,

p Art 0,01 e

p Art 0,001, respectivamente) entre o grupo tratado eo grupo controle.

o tratamento com alta concentração de triol induzida apoptose em células de cancro da próstata

Como iodeto de propídio análise de citometria de fluxo coloração não é um método confiável para detectar a apoptose, foi utilizado o ensaio de TUNEL para determinar se o tratamento triol a concentrações mais elevadas a apoptose induzida em células de cancro da próstata. Foram tratados CDXR-3, DU-145, PC-3 e as células com 0, 20, e 40 uM para o triol 48 ou 96 horas. Consistente com a análise de citometria de fluxo de dados, o tratamento com triol durante 48 horas produziu apenas uma pequena população de células apoptóticas em todas estas linhas celulares (dados não mostrados). O tratamento com triol durante 96 horas dependendo da dose resultou num aumento da população de células em apoptose em todas as linhas celulares de cancro da próstata três (Fig. 5). Embora o tratamento com o triol 20 uM durante 96 horas apenas um ligeiro aumento da população apoptótica, o tratamento com 40 uM triol resultou num aumento significativo na apoptose em todas as linhas celulares de cancro da próstata três.

3-CDXR LNCaP, DU-145 e células PC-3 foram tratados com triol de 0, 20, e 40 uM, durante 48 horas. A morfologia celular foi determinada por microscopia de luz. ensaio TUNEL foi realizado como descrito em Materiais e Métodos para determinar a população de células apoptóticas. luz verde fluorescente indicado células em apoptose corados com TUNEL. As imagens foram vistas em 200 × com microscópio Olympus confocal.

Matriz Micro-Ocidental reveladas proteínas sinalizadoras sendo afetados pelo tratamento triol

A hipótese que triol pode reduzir a viabilidade celular através do seu efeito sobre proteína de sinalização redes. A fim de determinar quais as proteínas de sinalização pode ser afectada pelo tratamento triol, utilizou-se micro-ocidentais matrizes (MWAs), um ensaio de transferência de Western de alto rendimento [17] – [20], [24], para o rastreio de proteínas de sinalização afectadas pela tratamento com triol 10 uM em CDXR-3 e DU-145 células. PTEN é frequentemente suprimida em cancro da próstata, o que resulta em activação da via PI3K /Akt sinalização [32]. PI3K /Akt sinalização desempenha um papel importante na sobrevivência e a progressão de células cancerígenas da próstata, [33] [32]. -Regulação de PI3K /Akt atividade está associada com mau resultado clínico de câncer de próstata [34]. Utilizou-se 48 anticorpos que são capazes de detecção de proteínas que regulam a progressão do ciclo celular, sobrevivência celular e apoptose, Akt relacionadas com as vias de sinalização, e marcadores de vários transição epitelial-mesenquimal (EMT) (Figura S2, Tabela S2) para a porção de rastreio do nosso MWA estudo (Fig. 6). As diferenças no perfil de expressão de proteínas, na ausência e presença de 20 uM triol é mostrado na Fig. 7. Cada uma das três linhas de células apresentaram uma resposta única expressão da proteína em triol-tratamento. Os perfis proteicos de CDXR-3 e PC-3 de células após o tratamento com 20 uM triol foram mais semelhantes entre si do que para células DU-145.