Abstract

Apesar de c-Abl tem cada vez mais emergiu como um jogador-chave na resposta danos no DNA, o seu papel neste contexto está longe de ser clara. Foi estudado o efeito de inibição da actividade de c-Abl cinase imatinib por quimioterapia com drogas e encontrou uma diferença marcante na sobrevivência das células após a mitoxantrona combinada (MX) e tratamento com imatinib em comparação com um painel de outras drogas de quimioterapia. O tratamento combinatória apoptose induzida em células HeLa e outras linhas celulares de cancro, mas não em fibroblastos primários. A diferença de MX e doxorubicina foi relacionada com o aumento significativo de danos no ADN. Transcricionalmente p53 ativa acumulada nas células em que o papilomavírus humano E6 normalmente degrada p53. O tratamento de combinação resultou na ativação da caspase e apoptose, mas esse efeito não depende nem p53 ou atividade p73. Apesar do aumento da atividade de p53, as células presas em fase G2 tornou-se defeituoso nesse posto de controle, permitindo a progressão do ciclo celular. O efeito após o tratamento MX dependia parcialmente em c-Abl: interferência curto knockdown de ARN de células HeLa c-Abl tornar-se menos sensíveis ao MX. O efeito do imatinib foi diminuída por c-Abl siARN sugerindo um papel para o cataliticamente inactivo c-Abl na cascata de morte. Estes resultados indicam que MX tem um efeito citotóxico original quando a actividade de quinase de c-Abl é inibida. Os resultados do tratamento em aumento de danos ao DNA e apoptose c-Abl-dependente, que pode oferecer novas possibilidades para a potenciação da quimioterapia do cancro

Citation:. Alpay K, Farshchian M, Tuomela J, J Sandholm, Aittokallio K, Siljamäki E, et al. (2014) Inibição da c-Abl quinase Atividade torna as células cancerosas altamente sensível a mitoxantrona. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10.1371 /journal.pone.0105526

editor: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de dezembro de 2013; Aceito: 24 de julho de 2014; Publicação: 22 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Alpay et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado por doações do Finnish Medical Society, Fundação Universidade Turku e Cancer Society of South-Western Finland, a Academia da Finlândia (projeta 137.687 e 268.360), a Fundação de Pesquisa do Câncer finlandês, Sigrid Juselius Foundation, Grant Universidade Turku Hospital EVO (projeto 13336). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a quimioterapia no tratamento do tumor funciona principalmente através de causar danos no ADN que induz uma rede complexa de respostas celulares, em última instância conduzem à morte da célula do cancro. No núcleo da resposta são caminhos que reconhecem o dano, travar o ciclo celular, e a promulgar cascata de morte. Na terapia do câncer, a radioterapia ea maioria dos agentes quimioterápicos funcionar por meio de danificar diretamente o DNA ou interferir com a replicação do DNA. A resposta a danos no ADN das células normais e malignas determina a eficácia e efeitos secundários do tratamento. O destino da célula se encontra nas complexas vias de reparação do ADN evocadas por numerosos tipos de danos no ADN que podem surgir depois do tratamento genotóxico [1]. reparação bem sucedida é crítica para o tecido normal para superar os efeitos colaterais da terapia, mas no tumor pode resultar na resistência ao tratamento. As células cancerosas geralmente acumularam mutações em genes envolvidos na reparação do ADN, oferecendo uma variedade de oportunidades terapêuticas para os agentes que modulam as restantes vias de reparação funcionais. Após o tratamento que danificam o DNA, as bases danificadas, desfasamentos, ou aductos de ADN são geralmente toleradas até um certo limite quantitativo, mas pode dar origem a mutações se eles permanecem não reparados [2].

c-Abl inibição tem sido recentemente proposta para levar a uma resposta de dano de DNA alterado [3]. C-Abl tirosina-cinase é um não-receptor que desempenha um papel na diferenciação, adesão, a divisão celular, a morte, e respostas ao stress e se liga a várias proteínas envolvidas em vias de apoptose [4]. As alterações na conformação da proteína c-Abl variar, e os parceiros de ligação, por conseguinte, diferem [4] – [6]. Várias proteínas, tais como ATM, DNA-PK, BRCA1 e os fatores de transcrição p73 e RFX1 interagir com c-Abl [5]. Mais notavelmente, c-Abl, foi reportado para interagir com a proteína homóloga recombinação-reparação Rad51, elevar a [7], a sua expressão ao nível do gene, e activá-lo por fosforilação. Activa c-Abl pode ser inibida pela pequena molécula droga imatinib (Gleevec; STI-571), que foi desenvolvida contra a proteína de fusão aberrantes BCR /ABL encontrados na leucemia mielóide crónica (LMC) [8]. Em células CML, o primeiro exão de c-Abl é substituída pela sequência do gene BCR, resultando na expressão de c-Abl constitutivamente activa. Esta actividade de quinase aberrante resulta na proliferação aumentada, que pode ser inibida com imatinib. Imatinib é um inibidor competitivo do ATP-estabilizando conformação inactiva de c-Abl [8]. A actividade de quinase de c-Abl é aumentada após o dano no DNA e, em seguida, aumenta a actividade da ATM e Atr [9]. O tratamento com imatinib diminui o nível de RAD51 elevados envolvidos na ruptura de fita dupla (DSB) reparação e sensibiliza vários tipos de células à quimioterapia [10] – [13]. Interacção directa também foi demonstrada entre c-Abl e a DNA-PK, que regula a extremidade não-homóloga juntar [14].

O desenvolvimento do cancro do colo do útero é um processo de múltiplos passos que envolve a transformação de células da mucosa cervical por oncogénica papilomavírus humano (HPV proteínas) E6 e E7. E7 inactiva o regulador de pRb ciclo celular, inibição da paragem do ciclo celular, enquanto E6 inactiva a proteína p53 supressora de tumores, o regulador chave da apoptose e da resposta ao stress genotóxico [15]. Dado que as células de cancro cervical quase sempre levar p53 de tipo selvagem, que é degradado por HPV de alto risco, a p53 foi anteriormente considerado como completamente não funcional em células de cancro do colo do útero. No entanto, o trabalho de vários grupos foi feita recentemente evidente que a p53 a inactivação pode ser revertida em células HPV E6-transportam e que o estado de p53 em células de cancro do colo do útero não é igual ao das células cancerosas com um gene p53 mutante [16]. Nós já observamos que chemoradiation reativa p53 em células de câncer cervical e promove a morte celular sinergicamente. No entanto, quando analisadas em pormenor, a proteína p53 pode aumentar ou inibir a citotoxicidade da droga de quimioterapia [17], [18]. Fibroblastos de rato embrionárias nulos para c-Abl estão com defeito na fosforilação p53 e resistente à morte depois de dano genotóxico. A inibição da c-Abl por imatinib diminui a fosforilação de p53 induzida por hidroxiureia [9]. Trabalhamos com a hipótese de que a p53 ativo pode aumentar o reparo do DNA e, assim, queria estudar o efeito sobre a morte das células da modulação do reparo. c-Abl é acreditado geralmente para relé de sinalização pró-apoptótica da ATM e Atr para p53 e p73, entre outros alvos [3]. Estudamos aqui o efeito de inibição de c-Abl sobre a atividade p53 em células HPV-positivos e como se relaciona com as respostas danos e morte.

Um painel abrangente de drogas representam agentes alquilantes, drogas de platina, e topoisomerase I e inibidores II foi estudada juntamente com imatinib em células de cancro do colo do útero transportando HPV e em linhas celulares HPV-negativos. Relatamos aqui que a inibição c-Abl por imatinib em combinação com MX tratamento genotóxico resultados de reparação de DNA prejudicada, revogação da barreira da fase G2, e apoptose maciça.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e ensaios de citotoxicidade

As linhas de células de cancro cervical humano SiHa (HPV 16+), CaSki (HPV 16 +), e HeLa (HPV 18 +), linha celular de cancro da mama MCF7, e A431 linha celular de cancro vulvar foram obtidos a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Os fibroblastos humanos primários foram descritos antes [19]. As células foram cultivadas como monocamadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, aminoácidos não essenciais (Euroclone, Wetherby, Reino Unido), e 50 ug /ml de gentamicina (Calbiochem, San Diego, CA, EUA ). A linha de células relatora HeLa p53, levando o repórter plasmídeo p53 ptkGC3p53-luc, foi descrito anteriormente [18]. Apesar da presença de E6 de HPV, mesmo as linhas celulares HPV positivos mostrar alguma actividade de p53 após o stress genotóxico, mas a actividade pode ser degradado pela p53 dominante-negativa (DDp53) ou ectópica E6 conduzido por um promotor forte. O SiHa DDp53, SiHa CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (vector vazio), e SiHa E6 linhas celulares também tem sido descrito anteriormente [18].

O dominante negativo de linha celular HeLa que expressam p53 (DD HeLa ) foi derivada por transfecção da linha celular parental com um plasmideo que expressa uma p53 de rato truncada contendo resíduos de aminoácidos 1-14 e 302-390, sob o controlo do promotor de CMV. Os transfectantes estáveis ​​foram seleccionados com 0,8 mg /ml de G418.

Em ensaios de viabilidade celular de curto prazo, 1-2 × 10

4 células por poço (de acordo com linha de células) foram semeadas em placas de 96 poços , e o meio foi substituído com fármacos diluídos com o meio. A viabilidade celular foi medida por um agente de WST-(Roche, Mannheim, Alemanha) ou o agente de MTT (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EUA), e a absorvância foi medida a 450 nm (Multiskan microreader placa; Labsystems, Finlândia) a 570 nm ou multi-leitor de placa (Tecan;. Tecan, Suíça), respectivamente

Para ensaios de crescimento clonogénicos, as células SiHa e HeLa foram semeadas em placas de 6 poços de 48 horas antes do tratamento. As células foram expostas a tratamento durante 6 horas e, em seguida, tratadas com tripsina e suspensas em meio fresco e semeadas em placas de 6 cavidades com 3 uM de imatinib. células SiHa foram incubados durante 14 dias e as células HeLa, durante 7 dias. Após a incubação, as células foram fixadas com 1:01 de acetona-metanol e coradas com Giemsa (Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA). Em seguida, ambos os clones foram contadas manualmente ou analisados ​​como descrito anteriormente [20]. Caspase 3/7 actividade de células que sofrem apoptose foi determinada utilizando o Apo-ONE caspase-3/7 caspase ensaio homogéneo (Promega).

Reagentes, drogas e anticorpos

A quimioterapia compostos mitoxantrona (MX) (Wyeth-Lederle, Finlândia), doxorrubicina (DXR) (Nycomed, Roskilde, Dinamarca), ciclofosfamida (Orion Pharma, Espoo, Finlândia), topotecano (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, Reino Unido), etoposide (Pfizer), cisplatina (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, EUA), docetaxel (Aventis), e carboplatina (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, EUA) e foram armazenados preparado como descrito [17]. Imatinib foi um presente da Novartis Pharmaceuticals (Basileia, Suíça). A solução estoque de imatinib a 200 mM foi preparada por dissolução do composto em DMSO. O c-kit e PDGF-α e β bloqueador do receptor AG1296 foi comprado de Calbiochem (cat. Nº. 658.551). PDGF-BB foi adquirido a Sigma-Aldrich. Os anticorpos seguintes foram utilizados para a transferência de Western: anticorpo monoclonal de ratinho DO-1 para p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-GADD45α (.. Cell Signaling, gato não 3518), anticorpo policlonal de coelho anti-fosfo receptor -PDGF β (Cell Signaling, gato não 3161..), monoclonal de ratinho anti-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; cat. No. 35-6500), anticorpo monoclonal de ratinho anti-ciclina B1 (BD Biosciences, gato. n. 554178) e anticorpos monoclonais anti-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). O ARN foi isolado utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha).

RNAs interferentes curto e transfecções

O c-Abl RNAs interferentes curta (ARNsi) foram obtidos da Invitrogen (discrição, Carlsbad, CA, EUA;…. cat no 1299003), e siRNA não segmentação (Qiagen, cat no 1027281) foi utilizado como controlo. A transfecção das células foi realizada com 75 nM de ARNsi três individuais segmentação c-Abl e ARNsi de controlo utilizando o Reagente siLentFect Lípido (Bio-Rad).

repórter p53 ensaio

Estável ptkGC3p53luc-BSD linhas de células SiHa, CaSki, e HeLa, bem como a composição do plasmídeo p53 repórter ptkGC3p53-Luc foram descritos anteriormente [17]. As células foram semeadas em placas de 96 poços (10

4 células /cavidade). Depois de permitir que para a fixação das células durante 24 horas, os tratamentos foram iniciados para as durações indicados. As células vivas em cada poço foram determinadas colorimetricamente com o ensaio de WST-1. Em seguida, as células foram enxaguadas com PBS e cobertas com 100 ul de uma mistura contendo 50% de PBS e 50% de Glo-brilhante reagente de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). A actividade de luciferase foi quantificada com o auxílio de um luminómetro captura híbrida (Digene, Gaithersburg, MD, EUA). Leituras de luciferase foram divididos pelo valor de WST-1 para obter uma actividade repórter normalizada.

Western blotting

As células foram colhidas utilizando 200 ul de tampão de amostra de SDS padrão 1 ×. Os extractos de células totais resultantes foram fervidos e, em seguida, separados por 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas Immobilon-P fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram sondadas com os anticorpos primários indicados e detecção secundária foi feita com anti-ratinho com peroxidase de rábano (HRP) (GE Healthcare, NJ, EUA), de HRP anti-coelho (DAKO, Glostrup, DK) e ECL (GE Healthcare , NJ, EUA). Beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. Os filmes de Western blot foram digitalizados com um ChemiDoc MP plataforma análise em gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). e analisados ​​com Fiji (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, NIH, EUA), utilizando a opção Gel.

A citometria de fluxo

análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. As células foram colhidas com tripsinização em conjunto com flutuante células não viáveis. As células foram lavadas uma vez com PBS e suspendeu-se em tampão de citrato de sódio (40 mM de citrato de Na, 0,3% de Triton X-100, 0,05 mg /ml de iodeto de propídio, PBS) 20 minutos antes da análise. análise do ciclo celular foi realizada utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, EUA) e o software CellQuest Pro (Becton Dickinson). as análises do ciclo celular e apoptose foram realizadas com ModFit LT (Verity Software House Inc., Topsham, ME, EUA) e fluido de software ver. 2.5 (Mr. Perttu Terho, Centro de Turku de Biotecnologia, Finlândia, www.flowingsoftware.com), respectivamente. Para analisar ainda mais a indução de apoptose após o tratamento com imatinib células HeLa MX e MX + foram cultivadas em placas de 6 poços e tratadas com medicamentos indicados por 24 e 48 horas. Meio e as células foram recolhidas e as amostras foram coradas com o kit de anexina-V-FITC (ab14085; Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram adquiridos com um citómetro de fluxo FACSCalibur, e analisados ​​com Fluir Software.

em tempo real transcrição reversa quantitativa PCR

O método RT-PCR foi descrita anteriormente [18]. Os iniciadores foram HPV 18 E6, para a frente, 5′-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 ‘, e reverso, 5′-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3′; e EF1α, para a frente, 5’-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 ‘, e reverso, 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3’. As quantidades de HPV 18 E6 transcrições foram normalizados contra as leituras para EF1α.

Ensaio Cometa

dano ao DNA foi estudado com um único kit de eletroforese em gel de célula (Trivigen, Gaithersburg, MD, EUA). O ensaio foi realizado em condições alcalinas, para detectar danos no ADN tanto simples e de cadeia dupla. A electroforese em gel de uma única célula de ADN foi efectuada tal como descrito pelo fabricante. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência Olympus BX60 (Zeiss AXIOVERT 200 M) a 20 × ampliação.

Microscopia

Time-lapse

As imagens foram capturadas em um intervalo de hora para 72 horas com IncuCyte ZOOM cinética sistema de imagem (Essen Bioscience, Michigan, EUA). poços representativos foram seleccionados e os filmes foram construídos com ImageJ Ver 1.47d (Wayne Rasband, NIH, EUA). Barra representa 200 m.

Estatísticas

Para avaliar as diferenças entre os grupos, foi utilizado o teste t de Student. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado para indicar significância estatística.

Resultados

A inibição de c-Abl por imatinib potencia o efeito citotóxico da mitoxantrona em células cancerosas mas não em fibroblastos primários

A potência de imatinib no aumento da citotoxicidade foi rastreada em um grande painel de drogas de quimioterapia. Nos ensaios de citotoxicidade a curto prazo, de imatinib por si só não foi citotóxico para qualquer uma das linhas celulares a 3 uM a 10 uM. Quando HeLa, CaSki e SiHa células foram tratadas com a inibidores da topoisomerase I (topotecano e etoposido), análogos de nucleósidos (gemcitabina, fluorouracilo, e citarabina), agentes alquilantes (ciclofosfamida e dacarbazina), ou cisplatina, imatinib não aumentou a citotoxicidade (dados não mostrado). Nem isso afetou antraciclina (doxorrubicina, DXR) células tratadas (Figura 1A). O efeito da carboplatina foi aumentada duas vezes por adição de imatinib durante 48 horas (dados não mostrados). Em contraste com todos os outros quimioterápicos testados, imatinib mostrou um efeito dramático em conjunto com mitoxantrona (MX), um inibidor de topoisomerase II (Figura 1A). O efeito do imatinib foi igual entre 3 um e 10 uM, indicando que a actividade de cinase está bloqueado nas linhas celulares estudadas mesmo com 3? M.

(A) células do cancro do colo do útero humano (HeLa) foram tratados com MX ( 0,6 uM), DXR (0,8? M), imatinib (10 uM) ou as suas combinações. ensaio de viabilidade celular WST foi realizada a 12 h, 24 h e 48 h. Os resultados foram normalizados com o número de células em meio contendo apenas poços. *** P 0,001 amostras independentes T-teste. Tanto a linha de carcinoma vulvar (B) A-431 de células que possui uma mutação sem sentido no gene p53 e linha celular de cancro da mama MCF-7, que possui um gene p53 mostra tipo selvagem de um efeito melhorado quando MX e imatinib são combinados. O Imatinib não aumentar a citotoxicidade de MX em fibroblastos primários. As medições foram realizadas a 48 h utilizando o ensaio de viabilidade celular WST. ** P 0,01, *** p 0,001 amostras independentes t-teste. (C) ensaio clonogénico. O imatinib aumenta MX citotoxicidade tanto na linha de células HeLa em CMV com p53 de tipo selvagem e o vector vazio e a linha celular de HeLa DDp53 carregando uma p53 negativa dominante. As células foram tratadas com cada droga durante 12 h. Em seguida, o meio foi substituído com meio fresco sem drogas. A concentração do imatinib foi de 3 uM enquanto que MX foi usado em diferentes concentrações variando desde 1 nM até 40 nM. Os clones foram contados sob o microscópio. Experimento foi realizado em triplicado, a média ± SD. *** P . 0,001

O efeito melhorada também foi observada em células CaSki e SiHa, embora em menor grau (Figura S1). As linhas celulares que queríamos principalmente para teste foram derivados de câncer cervical HPV-positivos. No entanto, o efeito parece não ter sido restringido a estas células. Os fármacos foram testados com duas linhas celulares de cancro de origem diferente: A linha celular A431 de carcinoma vulvar contém uma mutação sem sentido no gene p53, e a linha celular de cancro da mama MCF7 tem um p53 de tipo selvagem. A sobrevivência era muito semelhante à das linhas celulares HPV-positivos (Figura 1B). Em contraste, os fibroblastos não transformadas primárias não foram mais sensíveis ao imatinib foi adicionado ao tratamento MX (Figura 1B). Este resultado indica que o efeito observado não se restringe a células de cancro HPV positivas, mas podem ocorrer de forma mais ampla, independentemente do estado de p53. No entanto, as células não transformadas podem apresentar resistência a este tratamento.

O efeito aumentado de imatinib foi também observada no nativo e modificado de forma diferente as células HeLa e SiHa de um modo independente de p53, quer ou E6 (Figura S2). MX foi ainda estudado em ensaios de crescimento clonogénicas para monitorar a capacidade de recuperação de longo prazo das células. MX concentrações tão baixas como 1 nM juntamente com 3 uM de imatinib inibiu o crescimento clonal de células HeLa completamente, tanto em células de transporte de vector p53 e vazios (Figura 1C). Em linhas de células SiHa, 3 uM de imatinib sozinho não afectou o crescimento clonal. A sensibilidade das células CaSki para além de imatinib foi entre a das células SiHa e HeLa (Figura S3).

Mitoxantrona induz caspase 3/7, que é reforçada por bloqueio de c-Abl com imatinib

o tratamento com MX aumenta a libertação de caspase 3 e 7 a partir das mitocôndrias indicativas de apoptose. O imatinib por si só não é capaz de alterar estes níveis (Figura 2). As células tratadas com 0,6 uM e 0,8 uM MX DXR aumentou a actividade da caspase em 2,5 vezes, enquanto que o tratamento de combinação de imatinib MX + aumentou a actividade 4 vezes. O Imatinib não aumentou a actividade induzida por DXR sozinha.

Células

HeLa foram tratados com fármacos indicados durante 48 h. Em seguida, o meio fresco foi substituído e caspase 3/7 actividade foi medida utilizando o ensaio ELISA. Experimento foi realizado em triplicado, a média ± SD. *** P 0,001 T-test

A inibição da actividade c-Abl quinase aumenta o dano do DNA em células tratadas com MX

Adicionando imatinib para MX aumentou tailing cometa em células HeLa. Considerando imatinib sozinho não teve qualquer efeito (Figura 3A). Imatinib não induziu tailing em células tratadas com DXR. A quantidade de proteína GADD45α aumentou ligeiramente até mesmo na totalidade dos lisados ​​celulares com MX + imatinib (5 vezes, Figura 3B). Este aumento parece ser regulada ao nível da transcrição porque temos também observado um aumento acentuado dos níveis de transcritos GADD45α após a terapia de combinação em análises de ARN de microarray (dados não publicados). Como a acumulação da proteína p53 no estresse celular, aumenta a transcrição GADD45α sob estresse, incluindo com danos no DNA. Ambos DXR e MX aumento dos níveis de RAD51 (10) de dobragem, e imatinib pré-tratamento inibiu o aumento igualmente (20%), mas aumentou a acumulação de p53 quando adicionado ao MX (13 vezes, Figura 4).

(A) danos no ADN nas células HeLa foi estudada utilizando o ensaio de cometa após o tratamento com MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM) e imatinib (5 uM), ou suas combinações. Cometting (tailing) indica danos no DNA. (B) O imatinib combinado com MX aumenta o nível de GADD45α. Western blot dos níveis de proteína GADD45α a partir de lisados ​​de células inteiras. As células HeLa foram tratadas com MX (0,6 M), DXR (0,8 M), imatinib (5 M), ou suas combinações para 30 h.

Western blot das proteínas p53 e RAD 51 em células HeLa. O imatinib combinado com MX aumenta os níveis de proteína p53 em células HeLa. nível RAD51 foi ligeiramente reduzida em células tratadas com imatinib e MX. As células foram tratadas com MX (0,6 uM), DXR (0,8? M), imatinib (5 uM), ou suas combinações durante 30 horas.

activação de p53 induzida por mitoxantrona é melhorada pela inibição da quinase c-Abl actividade

as drogas de quimioterapia utilizado neste estudo induzir várias formas de danos no ADN, os quais p53 nos sentidos células alvo. p53 é activada nas células cervicais, apesar da actividade de degradação de E6 [16], [19]. Nós medimos a atividade repórter p53 em linhas de células HeLa, CaSki e SiHa com DXR, MX, e cisplatina. Quando as drogas foram comparados, cisplatina induzida a repórter mais de MX em células HeLa e células CaSki, mas de forma semelhante em células SiHa, e 0,6 uM MX por si só não activar o repórter de todo em células HeLa em 48 horas. DXR induzida do repórter mais do que a cisplatina e MX, em todas as linhas celulares (tabela 1). Imatinib sozinhos não alterou significativamente a actividade de qualquer uma das linhas celulares. Adição de imatinib para cisplatina reduziu ligeiramente a actividade, mas não houve qualquer efeito de DXR. Em contraste, a adição de 0,6 uM de imatinib para MX aumentou a actividade em todas as linhas celulares, por 50% em células SiHa, mas quatro vezes em células HeLa e oito vezes em células CaSki. A limitação desta abordagem é que uma comparação directa entre as linhas de células não pode ser feita devido a diferentes quantidades de plasmídeo repórter integrada. Consistente com os ensaios de repórter, nível de proteína p53 foi também significativamente aumentada em análises de transferência de Western (Figura 4). Não vimos qualquer diminuição no nível de p53 apenas com imatinib, os resultados que estavam em conformidade com os resultados da análise repórter.

p73 é um membro da família de proteínas p53 e interage com c-Abl direta e também pode induzir a apoptose. Os níveis de proteína p73 não se alterou após os tratamentos (Figura S4).

Imatinib não altera os níveis de HPV E6

A maioria das drogas de quimioterapia reduzir a quantidade de mRNA E6 [17]. Queríamos saber se imatinib causa redução na expressão de E6 em células HeLa sozinhos ou combinados com MX. Descobrimos que 1 uM MX diminui os níveis de ARNm de E6 em células HeLa de cerca de 50% e que 5 uM de imatinib sozinho não reduz o nível de ARNm de E6 nestas células. Uma combinação de 5 uM de imatinib e 1 uM MX não reduziu o nível de ARNm de E6 em células HeLa mais do que 1? M MX sozinho.

Imatinib ab-roga a prisão da fase S causada por MX e aumenta a apoptose

em células HeLa tratadas só com imatinib, às 24 horas, a distribuição do ciclo celular foi a mesma que em células com meio sozinho, mas foram ligeiramente mais células na fase S após 48 horas (Figura 5A). Ao fim de 24 horas e especialmente de 48 horas, as células acumuladas DXR em fase G2. Adicionando prisão fase S induzida imatinib na análise de software; No entanto, às 48 horas com DXR + imatinib, pareceu haver uma pequena população G2 que o software de análise de falha ao detectar. células tratadas com MX progrediu a 24 horas para S e G2, mas a incubação prolongada após 48 horas mostrou uma prisão G2 clara. Adicionando imatinib para MX mostrou às 24 horas uma população progredindo para G1, indicando revogação da prisão. Às 48 horas, não havia células além da fase S, mas ainda também uma população G1 clara. Esta descoberta sugere que as células tinham prematuramente entrou diretamente de fase S para a mitose e que o imatinib dirigiu este efeito. Alternativamente, MX + imatinib pode induzir um atraso de G1 /S para G2. No entanto, várias mitoses mal sucedidas foram detectados no lapso de tempo vídeo de células tratadas com imatinib MX + favorecendo a interpretação de que a parada do ciclo celular foi revogada (Video S1). Determinou-se também os níveis B1 ciclina, um marcador mitótico bem reconhecido, em populações de células tratadas com droga para recolher mais evidências para a noção de que as células co-tratadas mx + imatinib são capazes de proceder no ciclo celular e inserindo-fase M. Nós descobrimos que o tratamento de células HeLa com DXR, DXR + imatinib, MX e MX + imatinib leva ao acúmulo de ciclina B1. O nível de proteína de células tratadas foi imatinib abaixo do nível de detecção semelhante ao dos controles não tratados que exibem expressão basal nível de ciclina B1 (Figura S5).

(A) células foram tratadas com MX (0,6 uM), DXR (0,8? M), imatinib (5 uM), ou suas combinações para 24 e 48 horas. Após o tratamento, as células foram colhidas e coradas com iodeto de propídio para quantificar o conteúdo de ADN utilizando citometria de fluxo. Os histogramas mostram as distribuições do ciclo celular. (B) Anexina-V (eixo X) versus PI (eixo dos Y) de coloração de células HeLa tratadas com fármacos indicados durante 48 h. Percentagens indicam o início (quadrante inferior direito) e (quadrante superior direito) fração apoptótica tarde. MX e imatinib mostram um efeito sinérgico claro na indução de apoptose. O espectro de emissão de PI e DXR coincidem no canal FL2, tornando-o impossível de distinguir da população apoptótica precoce da população apoptótica em células tarde tratados com DXR. No entanto, quando os quadrantes direitos foram adicionados em conjunto, não houve diferença entre DXR DXR e populações + imatinib.

imatinib aumentou os eventos G1 sub em células HeLa tratadas com MX, em parte, indicativo de apoptose. A população sub G1 foi maior (38,6%) no grupo MX + imatinib em 48 horas. Imatinib também aumentou-DXR induzida sub G1, mas em menor grau (17,8%) em 48 horas (Tabela S1). Para analisar melhor as possibilidades de apoptose que manchou as células com anexina V que é um marcador de apoptose precoce. Descobrimos que o imatinib aumenta significativamente a percentagem de células em apoptose em células tratadas com MX, mas não conseguiu detectar qualquer aumento quando imatinib foi adicionado a DXR (Figura 5B) Citometria de fluxo resultados estão de acordo com a experiência da caspase apoiando a noção de que o imatinib com MX é mais potente indutor de morte celular do que com DXR. Imatinib foi previamente relatado para causar parada G1 em linhas de células de câncer de cabeça e pescoço [21] enquanto que causa G2 prisão MX e DXR [22]. Não vimos qualquer prisão G1 apenas com imatinib.

regulação negativa do c-Abl com siRNA impede a citotoxicidade de MX + imatinib

Imatinib e MX mostrou um efeito aditivo na redução do número de controle siRNA HeLa células. Quando c-Abl foi derrubado com siRNA, verificou-se que a proliferação de células não tratadas foi reduzido em 30-50% em experiências repetidas (Figura 6, de vídeo S2). Tanto as curvas de crescimento e de dados de microscopia de lapso de tempo mostram uma ligeira inibição do crescimento em células de c-Abl siARN HeLa. No entanto, nem o ARNsi de controlo ou ARNsi c-Abl sozinho induziu a morte celular. Este resultado sugere que c-Abl é necessário para a proliferação normal destas células. Segmentação de c-Abl em células HeLa por siRNA render as células menos sensíveis a MX. células CaSki também eram menos sensíveis a MX quando c-Abl foi reprimidos com siRNA, mas não foi observada inibição da proliferação. Estas células eram mais difíceis de transfectar com siRNA e apenas 40% de eficácia foi conseguido. Isto também pode explicar por que a proliferação não era inibida nestas células. Além disso, o efeito combinatório de imatinib foi significativamente reduzida, o que implica c-Abl como o alvo central de imatinibe neste resultado. A última descoberta também está em linha com as experiências com outros alvos de imatinib, PDGF e c-Kit. AG1296 é conhecido por inibir potentemente sinalização de α- PDGF humano e beta-receptores, assim como do factor de células-tronco do receptor c-Kit relacionada, em 1 jiM e 5