Sumário

AZD6244 (ARRY-142886) é um inibidor de MEK1 /2 e pode inibir a proliferação celular ou induzir apoptose de um modo dependente do tipo de célula. O mecanismo molecular preciso da apoptose induzida por AZD6244 não é clara. Para investigar mecanismos de apoptose induzida AZD6244 no cancro do pulmão humano, determinou-se que as alterações moleculares de dois subgrupos de linhas celulares de cancro de pulmão humanos que são ou sensível ou resistente ao tratamento AZD6244. Descobrimos que AZD6244 provocou um grande aumento de proteínas Bim e um aumento menor de proteínas de PUMA e noxa, e morte celular induzida em linhas celulares de cancro de pulmão sensíveis, mas não teve efeito sobre outras proteínas Bcl-2 relacionados nessas linhas celulares. Knockdown de Bim por siRNA aumentou consideravelmente o IC

50 e reduziu a apoptose em células tratadas AZD6244. Nós também descobrimos que os níveis de endógena p-Thr32-FOXO3a e p-Ser253-FOXO3a foram mais baixos em células sensíveis à AZD6244 do que em células AZD6244-resistente. Nas células sensíveis, AZD6244 translocação nuclear FOXO3a induzida necessária para a activação Bim. Além disso, o silenciamento de FOXO3a por siRNA revogada a apoptose celular induzida por AZD6244. Além disso, verificou-se que a transfecção de AKT constitutivamente activa-regulada p-Thr32-FOXO3a e p-Ser253-FOXO3a expressão e de expressão Bim induzida por AZD6244 inibida em células sensíveis. Estes resultados mostram que Bim desempenha um papel importante na apoptose induzida por AZD6244 em células de cancro do pulmão e de que a via PI3K /AKT /FOXO3a está envolvido na regulação Bim e susceptibilidade das células de cancro do pulmão para AZD6244. Estes resultados têm implicações no desenvolvimento de estratégias para superar a resistência a inibidores de MEK

Citation:. Meng J, Fang B, Liao Y, Chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) A apoptose Indução por MEK inibição em As células do cancro do pulmão humanos é mediada por Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10.1371 /journal.pone.0013026

editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de maio de 2010; Aceito: 31 de agosto de 2010; Publicação: 27 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Cancer Institute especializada de Investigação Excellence (SPORE) Grant CA-70907 (J. Minna e J. Roth), R01 Grant CA-092487 (B. fang) e Cancer Support Center Grant CA-16672. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Este trabalho também foi apoiado por uma Research Grant patrocinados da AstraZeneca Farmacêutica, que tinha um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este trabalho foi apoiado por um Research Grant patrocinados da AstraZeneca Farmacêutica. O financiador AstraZeneca teve um papel tanto no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A activação da Ras /Raf /MEK /MAP quinase tem sido implicado na descontrolada proliferação celular e o crescimento do tumor. AZD6244 (ARRY-142886), um romance, inibidor selectivo, não competitivo de ATP-activada por mitogénio proteína cinase cinase 1/2 (MEK1 /2), tem mostrado actividade em concentrações nanomolar contra a enzima MEK isolado e numerosas linhas celulares de cancro [1] . Os estudos in vitro mostraram que AZD6244 níveis de p-ERK regulada negativamente de forma eficiente. AZD6244 demonstrou actividade em vários modelos de tumor de xenoenxerto de cancro humano [2] – [4]. Em ensaios clínicos, enquanto os doentes de vários tipos de tumores tenham mostrado respostas a monoterapia com inibidores da MEK, tumores de outros doentes, particularmente os cancros do pulmão de células não-pequenas, são intrinsecamente resistentes à inibição de MEK. Por isso, é importante compreender os mecanismos subjacentes responsáveis ​​pela resistência à inibição de MEK em caso torna-se importante nesta modalidade terapêutica do cancro muito comum.

O nosso estudo anterior [5] mostrou que o AZD6244 inibidor MEK proliferação inibiu potencialmente em concentrações nanomolares em Calu-6, linhas celulares de cancro do pulmão H2347, H3122 e, mas teve pouco efeito sobre a H196, Calu-3, H522, ou linhas celulares HCC2450. Além disso, verificou-se que, após a paragem do ciclo celular sub-G1, 20-40% de células sensíveis à AZD6244 sofreram apoptose, não se observou a apoptose em células de AZD6244-resistente. Nós anteriormente mostraram que a expressão p-AKT é baixa em linhas celulares de cancro de pulmão sensível ao AZD6244, mas ricos em células resistentes, sugerindo que a p-AKT é um mediador de resistência ao tratamento AZD6244. Neste trabalho investigamos mediadores a jusante em apoptose induzida por AZD6244 em células de câncer de pulmão humano.

A apoptose pode ser regulada via extrínseca (receptor de morte) ou intrínsecas vias (mitocondrial) de morte celular. apoptose intrínseca é mediada pelas proteínas da família Bcl-2, que consiste em três sub-famílias: os membros pró-sobrevivência, tais como Bcl-2 ou de Mcl-1, a pró-apoptótica subgrupo Bax /Bak, e o pró-apoptótica de Bcl-2 homologia 3-only (BH3-only) proteínas. estímulos apoptóticos desencadear a activação de proteínas BH3-somente específicas, que, em seguida, envolver os pró-sobrevivência Bcl-2 membros da família e libertar os efectores a jusante, Bax e Bak, para induzir a permeabilização mitocondrial externa da membrana, desencadeando a cascata de caspase e culminando na morte celular. Bim, p53-regulada-se modulador da apoptose (PUMA) e noxa foram recentemente relatado para desempenhar um papel importante na quimioterapia e a terapia dirigida a apoptose induzida no cancro da mama [6], leucemia [7], mieloma [8] e NSCLC [ ,,,0],9] células.

A transcrição FOXO membros fator de promover ou inativar múltiplos genes alvo que participam na supressão do tumor, tais como

Bim

,

FasL

, e

FUGA

genes para induzir apoptose [10], [11],

p27kip1

,

ciclina D15 Compra de regulação do ciclo celular [12], e

GADD45a Compra de reparação de danos ao DNA [13]. FOXO3a é um dos mais importantes FOXO família de factores de transcrição que têm uma ampla gama de funções celulares. FOXO3a são fosforiladas e inactivado por AKT através da fosforilação em Thr32, Ser253, Ser315 e que resulta na exportação nuclear e a inibição da sua actividade de transcrição [14], [15]. FOXO3a também tem sido mostrado para ser regulado pela oncoproteína de ERK [16] em três locais de fosforilação de ERK, Ser 294, Ser 344, e Ser 425. Como com AKT, a fosforilação destes resíduos de serina com ERK aumentada FOXO3a distribuição citoplasmática e exportação nuclear.

porque o equilíbrio entre proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas é essencial para a apoptose induzida por drogas, nós avaliamos alterações em proteínas da família Bcl-2 em linhas de células sensíveis e resistentes cancro do pulmão AZD6244 e descobriram que o inibidor de MEK AZD6244-regula os pró-apoptóticos BH3-somente proteínas Bim, Puma e noxa, um processo associado a subsequente morte celular. Nós também descobrimos que o silenciamento quer FOXO3a, um regulador transcricional de Bim, ou Bim com pequena interferência RNA (siRNA) apoptose muito inibida. Além disso, a expressão de AKT constitutivamente activa (caAKT) em células sensíveis inibida AZD6244 induzida Bim sobre-expressão e levou a resistência AZD6244. Em contraste, a transfecção estável de AKT dominante negativo em células resistentes reforçada Bim over-exrpession induzida por AZD6244.

Materiais e Métodos

Materiais

AZD6244, fornecido pela AstraZeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, Reino Unido), foi dissolvido a 25 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e armazenada a -80 ° C. Anticorpo contra Bim foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA). Os anticorpos contra a P-ERK, FOXO3a, p-FOXO3a (Thr32), p-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, e noxa PUMA, e o estojo de ensaio de cinase AKT foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Os anticorpos contra Bak, Bcl-XL e caspase-9 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Predesigned FOXO3a ARNsi foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e Bim e ARNsi de controlo eram de Qiagene (Valencia, CA). O ADNc BimEL humana de comprimento completo, que é clonado no vector de expressão pCMV6-XL4, foi adquirido a partir de OriGene Technologies (Rockville, MD). cocktail inibidor de protease, o anticorpo β-actina, e sulfo-rodamina B (SRB) eram da Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). materiais de ensaio de proteína e SYBR Green Supermix foram adquiridos de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), e Geneticina foi de Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA). Lipofactamin 2000 e reagente Trizol foram adquiridos a Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), e reverso eram reagentes de transcrição a partir de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Deadend ™ Flurometic Sistema TUNEL foi adquirido de Promega (Madison, WI).

cultura celular

As linhas celulares H2347, H3122, H196, HCC2450 e H522 foram fornecidos pelos Drs. A. Gazdar e J. Minna, Centro de Hamon para Therapeutic Oncology Research, da Universidade do Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Todas as linhas celulares de cancro de pulmão foram mantidas em meio de Eagle modificado com alto teor de glucose de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 ug /ml de ampicilina, e 0,1 mg /ml de estreptomicina; as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 e 95% de ar.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de SRB, e cada ensaio foi realizado em quadruplicado. cancro do pulmão células foram semeadas a cerca de 3000 por poço em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas em DMEM suplementado com FBS a 10%. As células foram então tratadas com AZD6244, nas concentrações indicadas, que foram equivalentes a concentrações séricas atingidos em pacientes após a administração por via oral. As células tratadas com DMSO foram utilizados como controlos. As células foram fixadas 96 horas após o tratamento por adição de 50 uL de ácido tricloroacético a 10% a 4 ° C durante 1 hora. Eles foram depois coradas com 70 uL de 0,4% de SRB durante 60 minutos e lavou-se com ácido acético a 1%; 200? L de Tris base (10 mmol /L; pH, 10,5) foi adicionado. As leituras de absorvância a 570 nm foram determinadas usando um analisador de microplacas. A taxa de sobrevivência relativa (%) foi calculada pela equação OD

T /OD

C x 100% (com OD

T que representa a absorvância de grupos de tratamento, e OD

C a absorvância do controlo grupos). As concentrações inibidoras médias (IC

50) os valores foram determinados utilizando o software CurveExpert 1.3 e representada graficamente em curvas de dose-resposta. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

análise Western blot

lisados ​​de células inteiras foram preparados por lavagem das células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e submetendo-os a lise com tampão de amostra de Laemmli suplementado com um cocktail inibidor de protease. Após os lisados ​​foram sonicadas durante 15 segundos, as concentrações de proteína foram quantificados usando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad. proteínas equivalentes foram carregados, separadas por 10% ou 12% de electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), e, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose a 80 V durante 2 horas. As membranas foram bloqueadas durante 1 hora com 5% de leite desnatado seco em tampão Tris contendo 0,1% de Tween (TBST) e sondadas com anticorpo primário diluído a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes em tampão TBST e sondadas com anticorpos secundários marcados com corante de infravermelhos; as bandas imunorreactivas foram visualizadas com o uso de Odyssey® Imager (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

ciclo celular e apoptose ensaio

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas duas vezes em frio PBS, fixadas com gelo-metanol a 70% frio, e incubou-se a 4 ° C durante a noite. As células foram então lavadas com PBS e incubadas com 25 ug /mL de iodeto de propídio contendo 30 ug /mL de ribonuclease durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram analisadas em um perfil de fluxo EPICS citómetro II (Coulter Corp., Hialeah, FL) com o programa Multicycle Phoenix sistemas de fluxo (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

Medição da apoptose por TUNEL (terminal desoxinucleotidil transferase mediada nick-end rotulagem) Ensaio

O ensaio TUNEL foi realizada seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante de um comercialmente disponível kit (Fluorometric deadend ™ Sistema de TUNEL) da Promega. As células apoptóticas exibem uma forte fluorescência verde nuclear que pode ser detectada usando um filtro de fluoresceína padrão. Todas as células coradas com DAPI exibem uma forte fluorescência nuclear azul. As lâminas foram observadas por microscopia de fluorescência com células apoptóticas relativas determinadas pela contagem de células TUNEL positivos em cinco campos aleatórios (em ampliação x 100) para cada amostra.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado usando o reagente Trizol e reverter transcrito para cDNA. Conforme descrito anteriormente, foram utilizados iniciadores Bim [6] em nosso estudo. Quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em 25 ul de mistura, com 12,5 mL de 2 × SYBR Green Supermix, 1