Abstract

Fundo

As alterações na metilação do DNA no câncer incluem hipometilação global e hipermetilação específico do gene. Não está claro se esses dois erros epigenéticas são mecanicamente ligada ou ocorrer de forma independente. Este estudo foi realizado para determinar a relação entre a hipometilação do DNA, hipermetilação e instabilidade de microssatélites em câncer.

Metodologia /Principais Achados

Foram examinados 61 linhas celulares de cancro e 60 carcinomas colo-rectais e seus tecidos adjacentes usando LINHA-1 bissulfito-PCR como um substituto para a desmetilação global. carcinomas colo-rectal com instabilidade de microssatélites esporádica (MSI), a maioria dos quais são devidos a um fenótipo CpG ilha metilação (CIMP) e associada metilação do promotor MLH1, mostrou, em média, há diferença de LINE-1 metilação entre os tecidos adjacentes e cancerosas normais. Curiosamente, algumas amostras de tumores neste grupo mostraram aumento LINE-1 metilação. Em contraste, o MSI-mostraram uma diminuição significativa no LINE-1 metilação entre os tecidos adjacentes e cancerosas normais (P 0,001). análise de microarray de metilação elemento repetitivo confirmou esta observação e apresentaram um elevado grau de variabilidade entre as amostras em hipometilação. Além disso, agrupamento hierárquico não supervisionado identificaram um grupo de tumores altamente hypomethylated, composta principalmente de tumores sem instabilidade de microssatélites. Nós alargado análise linha 1 a linhas de células de cancro a partir de tecidos diferentes e descobriram que 50/61 foram hypomethylated em comparação com linfócitos do sangue periférico e a mucosa de cólon normal. Curiosamente, estas linhas celulares de cancro também exibiu uma grande variação na desmetilação, que era específico de tecidos e, portanto, pouco provável que seja resultante de um processo estocástico.

Conclusão /Significado

hipometilação global é parcialmente revertida em cancros com instabilidade de microssatélites e também mostra grande variabilidade no câncer, o que pode refletir vias de progressão alternativas no cancro

Citation:. Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ibrahim AE, Doshi K, Ele R, et al . (2007) LINE-1 hipometilação em Câncer é altamente variável e inversamente correlacionados com instabilidade de microssatélites. PLoS ONE 2 (5): E399. doi: 10.1371 /journal.pone.0000399

Editor do Academic: M. Cristina Cardoso, Max Delbrueck Centro de Medicina Molecular, Alemanha |

Recebido: 10 Janeiro, 2007; Aceito: 04 de abril de 2007; Publicado em: 02 de maio de 2007

Direitos de autor: © 2007 Estecio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health (EUA) concede CA098006, CA100632 e CA105346 (JP.JI) e da FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brasil) concede 99 /09368-1 (MRHE) e 00 /12361-8 (EHT)

CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro é uma doença complexa, que decorre ambos os erros genéticos e epigenéticos. A importância de alterações genéticas no cancro, incluindo anormalidades cromossômicas e mutações genéticas, bem seus fatores causais (por exemplo, radiações ionizantes e químicas cancerígenas) são agora bem conhecidos. O componente epigenética de transformação celular, no entanto, era até recentemente mal compreendida. Tem sido conhecido durante décadas que a hipometilação de todo o genoma acontece em tumores, em comparação com as células normais [1] – [4] e a sobre-expressão de oncogenes foi postulada como sendo um resultado desta hipometilação. hipermetilação DNA no câncer ganhou a atenção de alguns anos mais tarde, com estudos de Baylin et al. [5], [6] e Jones et ai. [7]. A última alteração ocorre em CpG promotores ilha de genes de cópia única e prejudica a transcrição do gene, resultando no silenciamento de genes supressores de tumor. Vários estudos descreveram um padrão específico de tecido de cancro e de metilação em centenas de genes alvos são conhecidos, incluindo os genes supressores de tumores e os genes envolvidos na invasão, angiogénese e apoptose [8], [9]. A natureza relacionada com a idade de hipermetilação do promotor em tecidos normais [10] tem sido proposta como um fator de predisposição ao câncer.

Uma questão importante e não solucionado é se hipometilação do genoma e de cópia única CpG promotor ilha hipermetilação são duas alterações independentes ou se eles estão mecanicamente ligados. Unbiased estudos de alterações da metilação do DNA foram identificados tanto hipermetilação frequente e hipometilação em vários tipos de neoplasias [11] – [14]. Tenta responder a esta pergunta resultou em resultados contraditórios, com alguns grupos de apoio [15], [16] e outros refutando [17], [18] uma ligação entre ambas as alterações.

Aqui, realizamos uma genome- estudo de metilação de largura em linhas celulares de cancro e tumores primários para determinar a relação entre a hipometilação do DNA, hipermetilação e instabilidade de microssatélites em câncer. O elemento retrotransponíveis LINE-1 foi utilizado como um substituto da hipometilação do genoma, e microarrays de metilação expandiu nossa análise a outras classes de elementos repetitivos. metilação do genoma diferia em carcinomas colo-rectais pertencentes a grupos distintos CpG ilha metilação fenótipo (CIMP), principalmente naqueles com instabilidade de microssatélites associados (MSI), onde hipometilação era pouco frequente comparativamente com tanto CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI- grupos. linhas celulares de cancro exibiu uma grande variação na desmetilação de todo o genoma, que era específico do tecido e, portanto, pouco provável que seja um processo estocástico. Em resumo, os nossos resultados mostram que a hipometilação do genoma do câncer é altamente variável, cujas causas são desconhecidas, ea existência de uma forte relação inversa entre hipometilação global e instabilidade de microssatélites em câncer.

Materiais e Métodos

amostras de tecidos e linhas celulares

Sessenta pares combinados de tumor e, aparentemente, espécimes de cólon normais adjacentes foram obtidas de pacientes tratados na Universidade Johns Hopkins (Baltimore, MA). CpG fenótipo ilha metilação (CIMP) e análise de microssatélites foram previamente determinados para estas amostras [19]. linfócitos do sangue periférico foram obtidas a partir de cinco dadores saudáveis ​​e tecido normal do cólon mucosa foi ressecado a partir de cinco indivíduos submetidos à cirurgia para a arma disparou feridas ou lesões não-malignas. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Johns Hopkins (Baltimore, MA), e o consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

Sessenta e um linhas celulares de cancro de oito diferentes tecidos (mama, sistema nervoso central, cólon, leucemia, fígado, pulmão, ovário e próstata) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas utilizando métodos padrão. DNA de pacientes e linhas de células foi extraído utilizando métodos padrão de extracção de fenol-clorofórmio.

Bissulfito-pyrosequencing LINHA-1 análise

o tratamento com bissulfito foi realizada como descrito [20]. análise de metilação de LINE-1 promotor (GenBank número de acesso X58075) foi investigado usando uma análise de metilação baseada pyrosequencing. Realizou-se 50 ul de PCR em 60 mM de Tris-HCl a pH 8,5, sulfato de amónio 15 mM, MgCl2 2 mM, 10% de DMSO, mistura de dNTP 1 mM, 1 unidade de polimerase Taq, 5 pmol de iniciador directo (5′-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG -3 ‘), 5 pmol do iniciador biotinilado-inverso (5′-BIO-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3′) e 50 ng de ADN genómico tratado com bissulfito. condições dos ciclos de PCR foram 95 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30s durante 50 ciclos. O produto de PCR biotinilado foi purificado e feito de cadeia simples de actuar como um molde numa reacção de pyrosequencing como recomendado pelo fabricante usando o pirossequenciao vácuo Ferramenta Prep (pirossequenciao, Inc., Westborough, MA). Em resumo, o produto de PCR foi ligado a estreptavidina-Sepharose HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) e as contas de Sepharose contendo o produto de PCR imobilizado foi purificado, lavou-se, desnaturados utilizando uma solução 0,2 M de NaOH, e novamente lavadas. Em seguida, 0,3 uM de iniciadores pyrosequencing (5’-GGGTGGGAGTGAT-3 ‘) foi emparelhado com o produto de cadeia simples purificado PCR e pyrosequencing foi realizada utilizando o Sistema HS 96 pirossequenciao PSQ (pirossequenciao, Inc.).

metilado amplificação ilha CpG (ACM) /ilha CpG microarray

Dezasseis tumores colorrectais foram comparados com o seu tecido adjacente aparentemente normal utilizando um protocolo de CpG ilha de microarray desenvolvido no nosso laboratório. Para cada amostra, amplicões MCA foram produzidos de acordo com a Toyota et ai. [20] o uso de adaptadores RXMA PCR. Para minimizar o viés de amplificação devido ao diferencial incorporação de corantes fluorescentes, optamos por um protocolo de marcação indireta. Para isso, a incorporação de dUTP amino-alilo (AA-dUTP, Sigma) em 600 ng de cada um dos ADN de tumor e normal de ADN foi realizada utilizando o protocolo de sistema de etiquetagem de DNA-Bioprime (Life Technologies). Cy5 e Cy3 fluorescentes corantes foram acoplados a tumor aa-dUTP marcado e amplicons normais adjacentes, respectivamente, e cohybridized ao HCGI12K-Human CpG 12K Array (Microarray Centre, University Health Network, Toronto, Canadá). procedimentos de hibridação e de lavagem pós-hibridação são de acordo com DeRisi e colegas e podem ser encontradas em https://www.microarrays.org. lâminas hibridadas foram digitalizados com o scanner GenePix 4000A (Axon Instruments, Foster City, CA) e as imagens obtidas foram analisadas com o software GenePix Pro 6.0. Apenas pontos com sequência de ADN anotado com 90% ou mais do seu comprimento, sobrepondo um elemento repetitivo foram usadas para análise. Um total de 770 pontos que representam DNA repetitivo de diferentes classes foram avaliadas utilizando este método e os dados de metilação para cada mancha foi representada como o log

2ratio de tumor (Cy5, vermelho) /(Cy3), normais intensidades normais. Values≥1.0 (alteração de 2 vezes) foram indicativos de aumento da metilação (hipermetilação) e 1,0-values≤ eram indicativos de diminuição da metilação (hipometilação) no tumor. agrupamento hierárquico não supervisionado foi feito usando o CIMminer programa (https://discover.nci.nih.gov/cimminer/) com o cálculo de distância usando correlação absoluta e clustering ligação completa.

A análise estatística

A importância das diferenças observadas entre as médias foi estimada utilizando o teste t de Student dos dois lados. valor de P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. One-way ANOVA foi utilizada na comparação de similaridade para três ou mais grupos. As análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software Statistica (StatSoft, Tulsa, OK).

Resultados

LINE-1 metilação no carcinoma colorretal se correlaciona com o estado MSI

Aplicamos o pyrosequencing método para determinar a densidade de metilação do promotor LINHA-1. Em estudos anteriores, que validou a aplicação deste método para avaliar o teor de metilação do genoma [21], [22], e mostrou uma forte correlação positiva entre a linha 1-metilação e LC-MS (cromatografia líquida /espectrometria de massa) de dados. Assim, LINE-1 níveis de metilação pode ser usado como um substituto de desmetilação de todo o genoma. O mapa do promotor LINHA-1 com os primers e as posições de sondas é apresentada na Figura 1A. Este método baseia-se no tratamento com bissulfito de ADN que modifica as citosinas não metiladas em tymidines enquanto as citosinas metiladas são não-reactivo. PCR de resultados de ADN tratado com bissulfito em piscinas de produtos que contenham tanto ADN metilado e não metilado que podem ser discriminados e quantificada utilizando o método pyrosequencing. Representativos LINHA-1 pirogramas são apresentados na Figura 1B. Nós investigamos cinco mucosa de cólon normal e cinco amostras de DNA de linfócitos periféricos do sangue (PBL) de dadores saudáveis ​​para determinar os níveis normais de LINHA-1 metilação. O LINE-1 metilação foi semelhante nos dois tecidos diferentes, com uma média de 71,9% em PBL e 70,8% na mucosa do cólon normal.

A quantificação de metilação do DNA usando o bissulfito LINE-1 PCR e pyrosequencing. A) Diagrama do promotor CpG Island (GenBank n. X58075, nucleótidos 108-520 posição pb) associado com o comprimento total LINHA-1. Cada linha vertical representa um site CpG única. A 3’UTR, 5’UTR e duas ORFs de LINE-1 são mostrados no topo. As setas indicam a localização dos iniciadores utilizados para PCR bissulfito (R-Biot e F) e pyrosequencing (S). B) representativos LINE-1 pirogramas para linfócitos normais de sangue periférico (PBL) e linhas celulares de cancro da mama (MB-468 e SKBR3). O pyrogram quantifica C para metilado e T para o DNA não metilado. A região sombreada representa o site CpG quantificada na linha 1-elementos, ea porcentagem de metilação é mostrado acima do pico.

A seguir, avaliou LINE-1 metilação em sessenta carcinomas colo-rectal primário e sua mucosa correspondência normal, e correlacionados isso com variáveis ​​demográficas, clinopathologic e moleculares (Tabela 1). tumores colorrectais em média 54,9% metilação (EPM = 1,1%) em comparação com 64,3% (SEM = 0,5%) a metilação no tecido normal adjacente, correspondendo a uma desmetilação média relativa de 14,6% (P 0,001). Em relação à linha-1 da metilação no cólon normal, que em média foi de 70,8% (SEM = 1,3%), tanto do tumor e adjacente à mucosa do cólon tumor foram desmetilado, com uma média respectiva de 22,5% e 9,2% desmetilação relativa (P = 0,001). Não houve diferença na LINE-1 metilação foram encontrados por idade ou sexo, mas uma diferença significativa foi encontrada para o lado, com baixos níveis de metilação em cólon direito adjacente normal (63,0%) em comparação com cólon esquerdo (65,5%, P = 0,016) e etapa, com baixos níveis de metilação para tumores em estágios 3 e 4 (51,9%) em comparação com estágios 0-2 (57,1%, P = 0,028).

Os tumores colorretais primários apresentou variação alta em lINE-1 metilação entre as amostras diferentes (Figura 2A), e a estratificação desses tumores colorretais e seu tecido normal adjacente revela uma variabilidade não uniforme em lINE-1 metilação. CRC com instabilidade de microssatélites esporádica (MSI), a maioria dos quais são devidos a MLH1 promotor metilação, não mostrou diferença em LINE-1 metilação entre os tecidos adjacentes e cancerosas normais (62,6% ± 1,1% versus 60,6% ± 1,7%, P = 0,33) , com uma diminuição média na metilação de apenas 3,12% ± 2,3%. Em contraste MSI-casos tiveram uma diminuição significativa na LINE-1 hipometilação entre os tecidos adjacentes e cancerosas normais (64,6% ± 0,5% versus 53,8% ± 1,2%, P 0,0001). Aparentemente, LINE-1 hipometilação era independente do estatuto CIMP, uma vez + /MSI-casos CIMP e CIMP-casos foram igualmente hypomethylated (15,4% ± 2,7% versus 17,7% ± 2,7%, P = 0,56). Esta distribuição desigual de desmetilação relativamente pela presença de instabilidade microssatélite é representada na Figura 2B, a qual ilustra a manutenção da Linha-1 metilação em CIMP + /MSI + tumores comparado com a mucosa de aparência normal, enquanto CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI- submeter hipometilação grave, com um caso apresentando uma desmetilação relativa extrema (61,3%).

Diferencial lINE-1 metilação entre os grupos CIMP /MSI em amostras de carcinoma colorretal primário (CRCs). A) ADN do tumor colorretal e sua aparição mucosa normal adjacente de sessenta pacientes foram avaliados para LINE-1 metilação. Estes tumores foram previamente avaliadas para CpG fenótipo ilha methylator (CIMP), utilizando um painel de análise de cópia única genes metilação, e estado de instabilidade microssatélite (MSI), que resultou na identificação de três grupos CIMP /MSI. Em condições normais aparecendo mucosa (top) pouca variação de LINE-1 metilação é observada entre as amostras e grupos CIMP /MSI (média metilação = 64,3%), enquanto que no tumor (em baixo) várias amostras submetidos a alta LINE-1 desmetilação (25/60 tumor amostras têm densidade de metilação abaixo de 55%), mais notável em CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI-grupos. B) Relativa LINHA-1 desmetilação em CRCs. desmetilação relativa foi calculada como a percentagem de alteração da Linha 1-metilação no tumor em comparação com os que aparecem mucosa normais. Ambos CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI-amostras apresentaram, em média, desmetilação 16% para LINE-1, enquanto que nenhuma alteração significativa foi observada para os + /amostras CIMP MSI +. Para o grupo CIMP +, aumento de 4-9% da densidade de metilação de LINE-1 foi observado para uma pequena fração das amostras, a maioria deles identificado como CIMP + /amostras MSI +.

análise de metilação de elementos repetitivos usando microarrays ilha MCA /CPG

Além de lINE-1 análise de metilação por PCR bissulfito e pyrosequencing, também avaliamos o estado de metilação de elementos repetitivos, incluindo lINE (longa intercaladas elementos nucleares), SINE (short intercaladas elementos nuclear), o LTR (repetições terminais longas), de ADN e de satélite se repete, por meio de acoplamento do MCA (amplificação ilha de CpG metilada; 20) para uma micromatriz ilha CpG contendo um total de 770 pontos que representam DNA repetitivo de diferentes classes. A primeira análise foi realizada por contagem hipermetilado (log

2ratio 1,0) e hypomethylated (log

2ratio -1.0) repete separados de acordo com suas diferentes classes (Figura 3A). Para o CIMP + /MSI + amostras, cada uma das repetições de classes, excepto repetições satélite foram encontrados para ser enriquecido para hipermetilação no ADN do tumor comparado com a mucosa normal adjacente (hipermetilação /hipometilação = 2,4 vezes em média). O enriquecimento de sequências hypermethylated diminuiu acentuadamente em CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI- (0,88 e 0,71 vezes, respectivamente). Estes resultados sugerem que existe uma forte pressão para a manutenção e /ou metilação de-novo de elementos repetitivos no grupo MSI +. Validação do nosso método de microarray foi feito comparando os resultados para a linha-1 para pirossequenciao dados nas mesmas amostras colorrectais. Esta análise revelou que os tumores com a linha mais baixa 1-desmetilação por pyrosequencing análise mostrou a maior enriquecimento para repetições LINHA hipermetilado (Figura 3B), com a situação inversa sendo observados para os tumores com maior LINHA-1 desmetilação. Estes resultados confirmam que a nossa análise microarray é uma técnica adequada para acessar alterações de metilação em elementos repetitivos.

metilado CpG Ilha amplication (MCA) /CPG ilha microarray de sequências de DNA repetitivas. A) relativa abundância de repetições hypermethylated e hypomethylated para cada grupo CIMP /MSI. Observou-se maior número de hypermethylated comparação com repetições hypomethylated para o grupo CIMP + /MSI +, e uma mudança gradual na representação de repetições hypermethylated e hypomethylated foi visto durante os-e MSI /MSI-grupos CIMP- CIMP + /, resultando em uma sobre-representação hypomethylated de repetições em grupos estáveis ​​microssatélites. B) A validação dos resultados de microarranjos para repete LINE. Note-se que grupos CIMP /MSI com maior desmetilação, conforme determinado pelo bissulfito-pyrosequencing de LINE-1, apresentaram também um maior número de LINHA hypomethylated repete por análise de microarray, como representado por uma relação de hiper /hipometilação inferior. C) de agrupamento hierárquico não supervisionado foi aplicada aos dados de metilação de um conjunto de 770 sequências de DNA repetitivas em todo dezesseis tumores colorretais emparelhado com o seu DNA mucosa aparentemente normal. Os tumores colorretais dendrograma é mostrado, e o ID da amostra para cada caso está incluído na direita. Os ramos terminais são codificados por cores para representar o estado CIMP /MSI da amostra de tumor (vermelho, CIMP + /MSI +; azul, CIMP + /MSI-; verde, CIMP- /MSI-). Em geral, as amostras do mesmo grupo CIMP /MSI agrupados juntos, reforçando o destino diferente para a metilação de ADN repetitivo sequências de metilação em cada grupo. LINHA, longa intercaladas elementos nucleares; SINE, short intercaladas elementos nucleares, LTR, longas repetições terminais; repetições de ADN; repetições satélite.

Finalmente, utilizando o registo normalizada

2ratio valores de pontos individuais, foi realizada agrupamento hierárquico não supervisionado para revelar as semelhanças entre os 16 casos de tumores colorretais estudados. O mapa de imagem em cluster resultante mostrou uma boa concordância com a segregação esperada das amostras individuais por conhecidos estatuto CIMP /MSI (Figura 3C), sugerindo que as assinaturas de metilação desses tumores não estão restritos a genes de cópia única, mas também envolvem elementos de DNA repetitivas.

a hipometilação de lINE-1 em linhas celulares de cancro mostra específico do tecido variabilidade

para verificar se a variabilidade na metilação do genoma é restrito aos carcinomas colo-rectais primárias ou também ocorre em outros tipos de tumores, aplicou-se o método de bissulfito-pyrosequencing lINHA-1-ona a sessenta linhas de células de cancro a partir de oito diferentes tipos de tecidos (mama, do sistema nervoso central, cólon, leucemia, pulmão, ovário, próstata e fígado). Curiosamente, verificou-se uma diminuição acentuada na LINHA-1 metilação na maioria das linhas celulares estudadas (Figura 4). Em geral, 50/61 testadas linhas celulares de cancro foram hypomethylated para a linha-1, com uma desmetilação relativa de 15% ou mais (absoluta densidade de metilação inferior a 60%) em comparação com linfócitos do sangue periférico e a mucosa de cólon normal. Da mesma forma a tumores colorectais primários, estas linhas de células de cancro exibiu elevada variabilidade em Linha 1-metilação, que varia de 6,5% (K562, uma linha de células de LMC com características de eritroleucemia) a 74,2% (CEM, uma linha celular de leucemia linfoblástica aguda). Há um tecido-especificidade aparente para a desmetilação; os níveis mais baixos de LINHA-1 metilação foram observados no fígado (24,0%), seguido pelo CNS (28,9%), de mama (29,8%), do pulmão (35,1%), da próstata (41,9%), ovário (49,7%), cólon (46,7%) e leucemia (56,1%). Enquanto uma descoberta interessante, que advertem generalização dos dados porque: (i) LINE-1 metilação não foi estudada para os tecidos normais, exceto cólon e sangue periférico; e (ii) um pequeno número de linhagens de células foram analisadas para cancro do fígado e da próstata.

LINHA-1 variabilidade metilação em linhas celulares de cancro. Amostras de DNA de linfócitos normais de sangue periférico, mucosa do cólon normal e sessenta e um linhas celulares de oito tipos diferentes tecidos foram investigados por LINE-1 metilação usando PCR bissulfito seguido por pyrosequencing. Os tecidos normais apresentaram níveis elevados de LINHA-1 metilação (acima de 70% em média), e uma grande variação de níveis de metilação foi observada para linhas de células de cancro, com uma densidade mínima de metilação de 6,5% a ser observada para a K562 linha celular de leucemia. Tomado como um grupo, as linhas celulares de leucemia foram moderadamente desmetilado (média 56,1%), seguido de ovário, cólon, próstata e linhas celulares de cancro de pulmão (variação de 49,7% para 35,1%). sistema nervoso central (SNC), mama e as linhas celulares de cancro do fígado uma testados foram profundamente desmetilado (abaixo de 30% em média). A linha pontilhada representa metilação média em controles normais.

Outro dado significativo é que algumas linhas celulares mostram extrema hipometilação. Enquanto leucemias em atuais níveis gerais LINE-1 metilação iguais a PBL, 3/15 linhas celulares têm mais de 50% desmetilação relativa (K562, HEL e TF-1). Uma situação similar é observada em outros tecidos, eram “campeões desmetilação” linhas celulares foram identificados (SKBR3 na mama e OVCA420 no ovário). Uma explicação atraente é que genes envolvidos na manutenção de metilação do DNA estão em falta ou mutado nestas linhas celulares.

Discussão

metilação do DNA desempenha um papel importante em células normais, estar envolvido na inativação do cromossomo X , imprinting e da repressão de elementos repetitivos, como retrotransposons e retrovírus endógenos [23], [24]. Ao mesmo tempo, ilhas de CpG da região do promotor de genes de cópia única são livres de metilação, o que é importante para permitir a transcrição. No câncer, um cenário inverso for encontrado, com um único exemplar CpG hipermetilação ilha e hipometilação do genoma. O objetivo do presente trabalho foi determinar a relação entre estes dois eventos anormais, utilizando linhas celulares de cancro de vários grupos tissulares e tumores colorretais primárias como um modelo.

Enquanto desmetilação todo o genoma e single-cópia CpG ilha hipermetilação ocorrem em câncer, ele é mal compreendida se estas duas alterações estão ligadas. Nossos dados com base nos níveis de metilação de elementos repetitivos, usando tanto um ensaio específico para análise de LINE-1 metilação e uma plataforma de microarray que compreende quase 800 sequências de DNA repetitivas de diferentes classes, mostram que os tumores com os mais altos níveis de hipermetilação aberrante (CIMP + /MSI + ), também apresentaram os menores níveis de hipometilação de todo o genoma, em comparação com mucosa normal adjacente. Com efeito, estes tumores apresentaram aumento frequente na metilação de elementos repetitivos, conforme revelado por análise tanto LINHA-1 e de microarray. Curiosamente, CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI-mostrou níveis mais elevados de LINE-1 hipometilação, reforçando a singularidade de CIMP + /tumores MSI +. Embora, CIMP + /MSI-e /MSI-grupos CIMP- foram igualmente hypomethylated para LINE-1, sugerindo que a instabilidade de microssatélites é a principal alteração molecular associada à falta de LINE-1 hipometilação. Estes resultados são concordantes com relatos anteriores de falta de hipometilação global em tumores instáveis ​​microssatélites [15]. A interpretação consensual destes dados é que os tumores colorretais surgem de duas vias de progressão distintos: hipermetilação global com instabilidade de microssatélites e hipometilação global com instabilidade cromossômica. No entanto, é necessário notar que o grupo CIMP + /MSI + não só é caracterizado pela instabilidade de microssatélites, mas também para uma maior frequência de ilhas hypermethylated CpG. Na verdade, o fator causador da instabilidade de microssatélites observado é a hipermetilação exclusiva de MHL1 nestes tumores, e de outros genes, como p16 e THBS1 também são encontrados com mais frequência metilado em CIMP + /MSI + em comparação com CIMP + /MSI- [25]. Além disso, a análise de microarray de ADN repetitivo suportado a existência de um grupo de tumores (CIMP + /MSI +) sob uma forte pressão para de metilação novo de ambos os promotores da ilha de CpG e elementos repetitivos e tumores colo-rectais re-classificados em seus grupos CIMP /MSI conhecidos . Notavelmente, CIMP + /MSI-e CIMP- /MSI-se principalmente em cluster para além, sugerindo que a análise microarray revelou algumas características especiais de cada grupo não visto por LINE-1 bisulfite-pyrosequecing. Por exemplo, repete SINE mostram uma mudança gradual na hipermetilação /hipometilação de acordo com o CIMP /MSI, com CIMP + /MSI-estar de um grupo intermediário. Além disso, repete satélite (representados principalmente por repetições centroméricas e pericentroméricas) mostrou um padrão mais estável de metilação e que pode estar relacionado a seu papel funcional na segregação dos cromossomos durante a divisão celular. Em contraste, Ehrlich et ai. [18] verificaram que a hipometilação e hipermetilação são independentes em cancros do ovário, com base na capacidade destas alterações para prever o grau de malignidade em tumores ovarianos. No entanto, as comparações directas de hipometilação em cancros com e sem níveis elevados de metilação (i.e. CIMP) não foram estudados. Mais estudos são necessários para responder por diferença de elementos repetitivos classes têm susceptibilidade diferente para hipometilação do DNA. Em geral, os nossos dados de microarranjos sugerem que algumas classes de elementos repetitivos podem estar sujeitos às mesmas pressões de metilação exercida sobre ilhas CpG em cancros CIMP +.

Usando LINE-1 metilação como um substituto para desmetilação global, encontramos uma grande variação de níveis de metilação entre diferentes linhas celulares de cancro, com especificidade para o tecido. Alguns tecidos como mama, CNS e do pulmão submetidos a acentuada LINE-1 desmetilação em cancros de uma forma bastante homogénea. Em outros tecidos testados, como do cólon e leucemia, algumas linhas de células tinham níveis de metilação semelhantes às exibidas por tecidos normais do cólon e do sangue, enquanto que outros foram profundamente desmetilado. Embora um estudo de seguimento, incluindo amostras normais a partir dos mesmos tecidos estudados é necessário para confirmar esta observação, uma análise realizada por Chalichagorn et al. [26] não mostrou uma diferença acentuada na metilação entre amostras normais a partir de vários tecidos. Da mesma forma que nossos resultados, um estudo anterior por Flörl et al. [27] tinha encontrado uma diferença marcante entre a bexiga e carcinomas renais, com apenas a primeira expositora LINE-1 desmetilação. A grande variação em hipometilação global observado implica mecanismos não-estocásticos para esse defeito, e também sugere uma vantagem selectiva para tumores com hipometilação grave. Com efeito, as experiências recentes mostram que a formação de tumores em ratinhos é induzida após hipometilação genómica global de [28], [29]. Usando a tecnologia transgene condicional para reduzir a expressão de DNMT1, Gaudet et al. [28] observada a formação espontânea de linfomas de células T com a aquisição de alterações genómicas adicionais. Holm et al. [29] gerado ratos que imitam perda de impressão (LOI), que se presume ser devido a hipometilação, e nestes animais foi também observada a formação de tumores. As causas de tal desmetilação diferencial entre o câncer de diferentes tecidos são desconhecidas, e ambos os fatores genéticos e exposição podem desempenhar um papel neste processo. hipometilação profunda, como observado na linha de células K562 e outros poderiam ser relacionado com a perda da função específica de genes que controlam a metilação de elementos repetitivos. Os genes candidatos são aqueles que codificam proteínas que têm sido descritos para exercer uma função como “guardas” heterocromatina. Por exemplo, a proteína LSH, um membro das proteínas SNF2 /helicase da família, é necessário para a metilação do genoma. camundongos knockout para o gene Lsh exibido mortalidade perinatal e mostrou desmetilação marcante de elementos repetitivos que é independente de alterações nos níveis de ARN de DNMT1 [30].

Em resumo, os nossos resultados mostram que a hipometilação do genoma é altamente variável em células de cancro, como é de cópia única ilha CpG hipermetilação. Ambas as alterações podem ser encontrados nos tumores e cada um pode promover a tumorigénese por processos independentes. Nosso estudo também fornece evidência para uma forte ligação inversa entre hipometilação global e instabilidade de microssatélites em câncer.