Abstract

Tipo de Niemann-Pick C2 (NPC2) desempenha um papel importante na regulação da homeostase do colesterol intracelular via ligação direta com o colesterol livre. No entanto, pouco se sabe sobre o significado da NPC2 no câncer. Neste estudo, nós localizaram o impacto de vários cancros diferentes na expressão NPC2. Uma série de anticorpos monoclonais anti-NPC2 (mAbs) com o isotipo IgG2a foram gerados e rastreio péptido demonstraram que o epitopo reactivo eram resíduos de aminoácidos 31-40 da proteína NPC2 humano. A especificidade destes mAb foi confirmada por transferência Western usando shRNA mediada knock-down de NPC2 em células SK-HEP1 humanos. Por coloração imuno-histoquímica, NPC2 é expressa em rim normal, do fígado, da mama, cólon, pulmão, esófago, do colo do útero, do pâncreas e do tecido do estômago. expressão forte de NPC2 foi encontrado no túbulo distal e proximal do rim e os hepatócitos de fígado. esofágico normal, colo uterino, do pâncreas, do estômago, da mama, do cólon e do tecido do pulmão corado moderada a fracamente. Quando comparados com os seus equivalentes de tecidos normais, NPC2 sobre-expressão foi observada em cancros da mama, cólon e pulmão. No que diz respeito ao cancro da mama, NPC2 sobre-regulação está associada com o receptor de estrogénio (-), o receptor de progesterona (-) e o receptor do factor de crescimento epidérmico humano (+). Por outro lado, NPC2 foi encontrado para ser sub-regulada em carcinoma de células renais, cirrose do fígado e tecidos de hepatoma. Pelo antígeno de captura de ensaio imunoenzimático ELISA, o NPC2 soro está aumentada em pacientes com cirrose e câncer de fígado. De acordo com os dados de Western blot, a alteração do padrão de NPC2 glicosilado no soro é associado com cirrose e cancro do fígado. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo imuno-histoquímico e sorológica abrangente investigar a expressão de NPC2 em uma variedade de diferentes cancros humanos. Estes anticorpos monoclonais novos deve ajudar com elucidar os papéis de NPC2 no desenvolvimento do tumor, especialmente em cancros do fígado e da mama

Citation:. Liao YJ, Lin MW, Yen CH, Lin YT, Wang CK, Huang SF, et ai. (2013) Caracterização do tipo de Niemann-Pick Expressão C2 proteína em cânceres múltiplos usando uma nova NPC2 Anticorpo Monoclonal. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10.1371 /journal.pone.0077586

editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão

Recebido: 30 de maio de 2013; Aceito: 04 de setembro de 2013; Publicação: 17 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência da República da China (conceder NSC100-2325-B-010-008 e NSC102-2320-B-038-003) e Taipei Medical University (conceder TMU101-AE1-B29). TLCN foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência desde 2005 (NSC 100-2325-B- 182-006) e os Institutos de Pesquisa em Saúde nacionais, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Tipo de Niemann-pick C2 (NPC2) proteína é uma pequena glicoproteína solúvel que contém um dezenove aminoácidos péptido sinal. A proteína foi caracterizada inicialmente como uma grande proteína secretora no epidídimo humanos [1]. NPC2 desempenha um papel importante na regulação da homeostase do colesterol intracelular via ligação direta com o colesterol livre [2]. Uma deficiência em NPC2 resulta na acumulação de colesterol livre no lisossoma [3]. Análise do ARNm NPC2 por transferência de Northern, revelou um único transcrito de 0,9 kb em todos os tecidos examinados, com os mais altos níveis de mRNA em testículos, rins e fígado [4]. A proteína NPC2 humana madura consiste em 132 aminoácidos e é expresso em diferentes isoformas; estes variam em tamanho de 19 a 23 kD, de um modo específico do tecido [5,6]. Recentemente, mostrámos que actua NPC2 coordenadamente com glicina N-metiltransferase para regular a progressão da homeostase do colesterol e a doença de fígado gordo hepática [7]. Além disso, NPC2 é essencial para a formação de papilas e modula o crescimento papilar [8]. NPC2 também é expressa em células alveolares tipo II epiteliais do pulmão [9]. Desde NPC2 regula negativamente a proteína quinase activada (MAPK) a fosforilação de ERK1 /2 em células de fibroblasto de mitogénio [10], uma perturbação na expressão NPC2 pode estar associada com doenças humanas importantes, incluindo o cancro. No entanto, as expressões de NPC2 em cancros humanos não foram explorados em detalhe. Portanto, nossos objetivos de pesquisa foram: (a) para desenvolver um painel de anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados contra a proteína NPC2 e (b) caracterizar suas propriedades e possíveis aplicações clínicas. Através da utilização de coloração imuno-histoquímica, altos níveis de expressão de NPC2 foram encontrados no túbulo convoluto distai e proximal do rim e nos hepatócitos do fígado. A expressão de NPC2 verificou-se ser regulada para cima na mama, cólon e pulmão humanos, enquanto, em contraste, não houve diminuição da regulação da expressão NPC2 em cancros do rim e do fígado. Finalmente, demonstrou ainda que a sobre-regulação de NPC2 está correlacionada com o estado do receptor de estrogénio (ER), receptor de progesterona (PR) e receptor do factor de crescimento epidérmico humano (HER-2) expressão. Além disso, a desregulação da NPC2 soros está associada com cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (HCC).

Materiais e Métodos

Geração de anticorpos monoclonais contra NPC2

Para gerar uma série de mAbs contra NPC2, purificada GST-NPC2 ou purificada His-NPC2 (Figura 1A) de proteína recombinante (RP) foram misturados com adjuvante completo de Freund (para a imunização inicial) ou adjuvante incompleto de Freund (para as injecções de reforço) (Sigma Co., St. Louis, Missouri, EUA) e a mistura resultante foi utilizado como um imunogénio. His-NPC2 RP foi utilizada como antígeno triagem para anticorpo surgiu por GST-NPC2 RP. Rato mAbs foram produzidas por a técnica de hibridoma [11]. Os hibridomas foram colocadas em seis placas de 96 poços e cultivadas em meio seleccionado [12]. Os sobrenadantes da cultura foram rastreados usando um ensaio imunoenzimático com GST-NPC2 RP e His-NPC2 RP como os antígenos. As células de hibridoma que têm uma elevada densidade óptica por imunoensaio enzima foram confirmados por ensaio de mancha de Western imediatamente. Cada poço de células que produziram um resultado positivo foi sub-clonado num prato de 96 cavidades com uma densidade celular de 0,5 células por poço. Resultando clones individuais com um resultado positivo foram então inoculadas com uma dosagem de 2 x 10

6 em um ratinho BALB /c que tinham sido sensibilizados com 0,5 ml de adjuvante incompleto (Sigma) previamente. O anticorpo monoclonal foi purificado a partir do líquido ascítico do rato utilizando proteína G mais proteína A Agrose (Calbiochem, San Diego, CA, EUA) e, em seguida, concentrou-se por Vivaspin 20 (GE Healthcare). O isotipo de cada mAb foi determinada usando o mouse Anticorpo Monoclonal isotipificação Reagentes (Sigma).

(A) Construção dos plasmídeos de GST-NPC2 e His-NPC2 expressão. proteínas de fusão NPC2 bacteriana (B) foram expressas em células BL21 e, em seguida, induzida com IPTG 1 mM. SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie foi utilizado para mostrar os pesos moleculares das duas proteínas eram de aproximadamente 43,3 kD para GST-NPC2 e 17 kD para His-NPC2. (C) Análise de Western blot utilizando os mAbs (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7D, 1-5b e 1-2 g) contra GST-NPC2 e His-NPC2 . (D) Análise de Western blot utilizando os mAbs contra epidídimo de rato.

Células e plasmídeos

células SK-HEP1, adquiridos a partir de ATCC, foram cultivadas em DMEM (Gibco BRL, Grand Island , Nova Iorque) com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (Hyclone, Logan, UT, EUA), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /mL), aminoácidos não essenciais (0,1 mM), e L-glutamina (2 mM) numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. O DNA de plasmídeo foi transfectado usando TurboFect ™ Reagente (Fermentas, Hanover, MD, EUA). As sequências dos iniciadores e enzimas de restrição utilizados para a todo o comprimento e diferentes comprimentos de genes NPC2 humanos foram previamente descried por Liao et al [7]. Plasmídeo shRNA para NPC2 (TRCN0000029323) foi obtido a partir da Unidade Nacional de RNAi Núcleo (Academia Sinica, Taiwan).

amostras Humanos

As lâminas de tecidos de carcinoma hepatocelular (n = 50) e soros (n = 165) foram obtidos a partir de Taiwan Liver Cancer Network (TLCN) e Taipei City Hospital. As características clínicas destes pacientes são mostradas na Tabela S1 e S2 Tabela. controle saudáveis ​​e pacientes com infecção crônica da hepatite, fígado gordo, cirrose e carcinoma hepatocelular tinham sido recrutados entre 2008 e 2010, do Departamento de Medicina International, Taipei City Hospital, Ran-Ai Branch, Taipei, Taiwan e TLCN. Total de 33 indivíduos cancro da mama invasivo foram identificadas no Municipal Ta-Tung Hospital Kaohsiung. Nós processadas todas as amostras de tecido sob as mesmas condições. A Comissão de Ética do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Yang-Ming (IRB No. 1.000.041) e Taipei City Hospital Institutional Review Board (IRB No. TCHIRB980509) aprovou as investigações clínicas, e todos os sujeitos deram consentimento informado por escrito. Diagnóstico de HCC foi confirmado por exame histológico. O peito (BR721), cólon (CO803), pulmão (LC1006), rim (KD991), múltiplos câncer (BCN721), várias doenças do fígado (LV1201) e cirrose hepática e hepatite (LV805) tecidos matrizes foram adquiridos da Biomax, US . informações clínicas e patológicas nas amostras cancerosas individuais estão disponíveis e foram obtidos a partir do fabricante de matriz.

rastreio de péptidos, transferência de Western e imuno-histoquímica (IHC) coloração

Foi utilizado um ELISA de placa revestida com péptidos para mapear epítopos do NPC2 vários anti-mAb. Estes péptidos (cada um com um comprimento de 10 a.a.) cobriu o comprimento completo do a.a. 1-40 região da proteína NPC2. Para transferência de Western, as proteínas celulares ou epidídimo de rato foram separados por SDS-PAGE. fosfo-ERK1 /2 e ERK1 /2; fosfo-p38 e p38; fosfo-JNK e JNK foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Immunoblotting sinais foram normalizados utilizando α-tubulina ou β-actina e quantificados por varrimento densitométrico. detecção IHC da proteína foi realizada utilizando NPC2 NPC2 Ab monoclonal (3-6B) a uma diluição de 1: 200 [7]. secções de tecido embebidas em parafina foram incubadas com o anticorpo primário e detectada usando Universal LSAB

kit TM2 (DakoCytomation) de acordo com as instruções do fabricante.

de captura de antigénio de imunoensaio enzimático ELISA

Resumidamente, 100? l de anticorpo policlonal NPC2 (5 ug /ml) em tampão carbonato 0,1 M (pH 9,6) foram adicionados a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (Corning Costar, Acton, MA) e incubadas a 4 ° C durante a noite. Em seguida, o bloqueio com BSA a 5% em PBST (tampão PBS contendo Tween a 0,05%) a 37 ° C durante 2 horas. soro de cada paciente (100 ul a uma diluição de 1: 1) foi adicionada a 96 placas de poço-e incubou-se a 37 ° C durante 1 hora. Após três extensas lavagens com PBST, anticorpo NPC2 monoclonal (diluição 1: 1000) e incubou-se a 37 ° C durante 1 hora, seguido por incubação com 200 ul de substrato (0,015% de o-fenilenodiamina dicloridrato) (Sigma-Aldrich) durante mais 30 min a 37 ° C. As reacções foram interrompidas pela adição de HCl 3N; absorbância foi medida com um espectrofotômetro a 490 nm.

glicosidase Digestão

microgramas Sessenta de proteínas hepáticas de soros humanos foram incubadas com ou sem N-glicosidase F (PNGase F) de acordo com as instruções do fabricante (NE Biolabs, Beverly, MA). Os produtos de reacção foram submetidos à análise western blot.

Análise estatística

bondade Qui-quadrado de ajuste, não paramétrico de Wilcoxon Signed Ranks teste ou teste de Mann-Whitney U foram utilizados para avaliar a associação entre NPC2 expressão e doenças clínicas. A

valor p

de ≦ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Geração e caracterização de mAbs contra NPC2

A fim de desenvolver NPC2 mAbs que irá detectar a expressão NPC2 em diferentes linhas celulares e tecidos, que inicialmente clonado um fragmento NPC2 completo e expressa a His-NPC2 proteínas de fusão GST-NPC2 e em um sistema bacteriano (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, a GST-NPC2 e His-NPC2 proteínas recombinantes, com dimensões de 43,3 e 17 kD, respectivamente, apareceu nos lisados ​​bacterianos induzidos por IPTG. O purificada GST-NPC2 e His-NPC2 proteínas recombinantes foram utilizadas como antigénios durante a geração de Acms contra NPC2. No total, oito mAb (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7B, 1-5b e 1-2 g) foram eventualmente gerado e verificou-se reagir com GST-NPC2 proteínas recombinantes e Seus-NPC2 (Figura 1C). Desde NPC2 é uma principal proteína secretora expressa no fluido epididimal [1], foi aplicado a NPC2 mAb para detectar a expressão NPC2 no epidídimo de rato utilizando Western blotting. Tal como mostrado na Figura 1D, NPC2 foi detectada em extractos totais epidídimo como bandas proteicas de aproximadamente 16 a 22 kD. determinação de isotipo identificados todos os mAbs como pertencente ao isotipo IgG2a e suas cadeias leves foram identificadas como cadeias kappa.

Para mapear a região reactiva reconhecido pelo mAb NPC2, que transfectado um conjunto separado de plasmídeos que expressam diferentes comprimentos de NPC2 -HA (incluindo full-length NPC2 [1-151 aa], domínio a e B [1-80 aa], o domínio B e C [40-105 aa] eo domínio C e D [81-151 aa]) para o 24 hrs. Como mostrado na Figura 2A, todos os oito NPC2 mAbs podem reconhecer comprimento completo e a metade N-terminal (1-80 a.a.) de pNPC2-HA. Enquanto, os fragmentos contendo a a.a. 41-105 região de NPC2 e a metade C-terminal de (81-151 a.a.) de NPC2 não reagiram com o mAb NPC2. Estes achados sugerem que todo o NPC2 mAbs reconhecem aminoácidos 1-40 da proteína NPC2. Para mapear os epitopos reactivos ainda reconhecidos pelo mAb NPC2, um ELISA foi realizado utilizando um painel de péptidos que consiste de quatro péptidos que abrangem os aminoácidos 1-40 da proteína NPC2. Os nossos resultados indicam que apenas um péptido (aminoácidos 31-40) foi reconhecido por seis seleccionado do NPC2 mAbs (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7B, 1-5b e 1-2g) (Figura 2B). Tal como mostrado na Figura 2C, a sensibilidade e especificidade do mAb NPC2 (3-6B, 14-8D, 5-4B e 2-7B) foram, em seguida, detectados utilizando células SK-HEP1 transfectadas com ou sem shNPC2. Entre estes NPC2 mAbs, selecionamos um mAb NPC2 (3-6B) como o melhor para o prosseguimento da investigação e utilização em aplicações clínicas.

mapeamento (A) região de epitopos dos anticorpos monoclonais NPC2. comprimento diferente de pNPC2-HA de comprimento total, incluindo pNPC2-HA, a metade N-terminal (1-80 a.a.), C-terminal da metade (a.a. 81-151) e 41-105 a.a. foram transfectados para células 293T e 24 horas mais tarde foram recolhidas para análise de Western blot. Pista 1, 1-2 g; Land 2, 1-5b; Pista 3, 2-7B; Pista 4, 3-6B; Pista 5, mAb-HA; Pista 6, 4-12C; Pista 7, 5-4B, Pista 8, 5-5B; Pista 9, 14-8D. placa (B) um ensaio ELISA revestidos com quatro péptidos abrangendo a a.a. 1-40 região da proteína NPC2 foi utilizado para o mapeamento de epitopo. Os resultados representativos dos mAbs (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7D, 1-5b e 1-2 g) são mostrados. (C) O efeito knockdown de shNPC2 em células SK-HEP1 foi detectada utilizando anti-NPC2 mAbs (3-6B, 14-8D, 5-4B e 2-7B).

A expressão diferencial de NPC2 em tecidos normais e tumorais humanas

a fim de investigar a aplicação clínica de NPC2 mAb, detectamos a expressão de NPC2 em vários tecidos normais e cancerosas, usando coloração IHC. Normal do esôfago, colo do útero, pâncreas, estômago, mama, cólon e pulmão tecido apresentou moderada a coloração de intensidade NPC2 fraco (Figuras 3A e 3C). Tal como mostrado na Figura 3B, a expressão forte de NPC2 foi encontrada em hepatócitos normais do fígado. No rim, NPC2 foi expressa tanto no túbulo contornado distal e proximal, mas não no glomérulo (Figura 3B)

Ampliação:. 200x. (A) NPC2 foi regulada em amostras de mama, cólon e tumores do pulmão. (B) NPC2 foi regulada para baixo em amostras renais e tumores de fígado. (C) A expressão de NPC2 permaneceu inalterado no pâncreas, esôfago, pares do colo do útero e estômago uterinos amostra de tecido.

A comparação entre esses tecidos normais (N) e seus tecidos tumorais correspondentes (T) foi realizada para fora e verificou-se que NPC2 foi significativamente sobre-regulada no cancro da mama, do cólon e cancros do pulmão (Figura 3A). Entre os 23 pares de tumor da mama e tecidos normais testados, 18 (78%) de os tecidos tumorais apresentaram níveis de expressão mais elevados do que os seus NPC2 tecidos normais (

P

0,0001, Tabela 1). Fora dos 44 correspondentes não-pequenas pares de carcinoma pulmonar de células, amostras de tecido de tumor de 30 (68%) teve maior expressão NPC2 do que as suas contrapartes normais (

P

= 0,02, Tabela 1). Em contraste, NPC2 foi significativamente regulada para baixo em carcinoma de células renais e do cancro do fígado (Figura 3B). Entre 33 pares de tumor do rim e tecidos normais, 31 (94%) amostras de tecido tumoral tinha uma expressão NPC2 muito menor do que a amostra de tecido normal equivalente (

P

0,0001, Tabela 1). Entre 50 pares de tecido tecido tumor no fígado e tumores adjacentes emparelhados, amostras de tecidos tumorais 36 (72%) mostraram muito menor expressão NPC2 do que a sua amostra de tecido tumoral adjacente (

p

= 0,02, Tabela 1). No entanto, não houve diferença entre as amostras de tecido normais e de cancro para o carcinoma do esófago, do colo uterino, pâncreas e estômago (Figura 3C). . Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que a expressão aberrante de NPC2 está associada a diversos cancros e que a alteração na expressão pode ser quer para cima ou para baixo, dependendo do tecido

cancros

t N n (%)

T = N n (%)

T N n (%)

p valor

Aumento do tumor tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung

# (n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) 0.02Decrease no tumor tissuesKidney (n = 33) 2 (6%) 031 (94%) 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0,02 . tabela 1. resultados Imuno-histoquímica de expressão em NPC2 humano da mama, cólon, pulmão, rim e fígado de cancro emparelhado tecidos

t, tecidos tumorais; N, tecidos normais;

#, carcinoma do pulmão de células não pequenas. CSV Baixar CSV

Relação entre a expressão NPC2 eo estado de ER, PR e HER-2

Em relação ao câncer de mama, foram coletadas mais 33 indivíduos com cancro da mama invasivo identificados na Ta-Tung Hospital Kaohsiung Municipal e analisou a relação entre a expressão NPC2 e características clínico-patológicas. Entre 33 pacientes, 18 (54,5%) amostras de tecido do tumor tinha uma expressão NPC2 muito maior do que a amostra de tecido normal equivalente (

p

= 0,002, Tabela 2). Indivíduos com NPC2-regulação foram mais propensos a ter uma fase patologia mais tarde (

p

= 0,018), ER (-) (

p

= 0,007), PR (-) (

p

= 0,005), HER-2 (+) (

p

= 0,006), ER (-) mais PR (-) (

p

= 0,011) e ER /PR (-) mais HER-2 (+) (

p

= 0,011)

total

T . N n (%)

T = N n (%)

T N n (%)

p

valor

patients3318 total (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0,002 TNM stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0,043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0,233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0,018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0,090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0,007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0,092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0,005 HER-2 ScorePositive (3) 2012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0,006 negativo (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 CombinationER (+), RP (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0,171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0.180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0,317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0,011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0.091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0,011 ER /PR (-), HER-2 (-) 000 0 N /AQuadro 2. expressão NPC2 e características clínico-patológicas de pacientes com câncer de mama

T, tecidos tumorais.; N, tecidos normais; ER, receptor de estrogénio; PR, receptor de progesterona; HER-2, receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2; (+), Positivo; (-), Negativa. CSV Baixar CSV

A desregulação da expressão NPC2 na cirrose humana e HCC

Uma vez que o fígado é a principal fonte de plasma e NPC2 biliar [13], o próximo examinou se o nível NPC2 soro pode ser usado como um romance biomarcador para doenças de fígado. Nós medimos a quantidade de nível NPC2 soro de 42 controles saudáveis, 20 pacientes com infecção crônica pelo HBV, 2 pacientes com infecção crônica de HCV, 27 pacientes com esteatose hepática, 28 pacientes com cirrose e 46 HCC usando um ELISA (Figura 4A). Os níveis de NPC2 em grupos com controlo saudável, a infecção crónica por HBV, infecção crónica pelo HCV, fígado gordo, cirrose e carcinoma hepatocelular foram 3,29 ± 1,43 ng /ml, 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9,66 ng /ml (valor máximo, 15,81 e mínimo valor, 3,504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml e 7,26 ± 2,11 ng /mL, respectivamente. Como mostrado na Figura 4A, os níveis de NPC2 houve diferença entre o controlo saudável, hepatite crónica (HBV e HCV) e pacientes com doença de fígado gordo. Importante, pacientes com cirrose e carcinoma hepatocelular tinham níveis significativamente mais elevados de NPC2 do que os controles saudáveis. Por outro lado, a coloração IHC demonstraram que NPC2 foi significativamente regulada para baixo em tecidos cirrose, enquanto que não houve diferença entre os tecidos normais e hepatite (Figuras 4B e 4C).

(A) análise de ELISA de soro níveis NPC2 em 42 controles saudáveis, 20 pacientes com infecção crônica pelo HBV, 2 pacientes com infecção crônica de HCV, 27 pacientes com esteatose hepática, cirrose e 28 de 46 pacientes com HCC. (B) coloração IHC da expressão de proteínas em tecidos NPC2 hepatite e cirrose normais crónicas. Análise (C) IHC de expressão NPC2 hepática em 44 normal, 21 hepatite crônica e 60 amostras de tecido cirrose (*,

p Art 0,05, Mann-Whitney U). (D) Os soros humanos (60 ug) foram incubados com o péptido N-glicosidase F (PNGase F) e sujeitas a análise de Western blot. (E) a análise Western blot de expressão NPC2 soro em 14 controles saudáveis, 7 fígado gordo, 4 cirrose e 4 pacientes com HCC. Cada linha foi carregada 100 ug de proteína.

Desde N-glicosilação é importante para a segmentação adequada e função do NPC2 [14], o próximo utilizado PNGase F digestão para confirmar se a heterogeneidade da proteína NPC2 soro é devido a modificações de glicosilação pós-translacional. Após tratamento com PNGase F, NPC2 foi visualizado como uma única banda imunorreactiva (Figura 4D). Para uma análise mais aprofundada se a forma glicosilada de NPC2 está associada com a progressão do câncer de fígado, as amostras de soro foram submetidos à análise western blot. Glicosilada e NPC2 nascente foram expressos em uma proporção de 1: 1 em soros humanos normais (Figura 4E). Curiosamente, embora não encontramos qualquer diferença na expressão NPC2 sérica entre pacientes saudáveis ​​e fígado gordo, expressão NPC2 glicosilada foi a principal forma em ambos os pacientes com CHC (Figura 4E) cirrose e. Estes dados sugerem que os valores e as mudanças de padrão glicosilada de NPC2 estão associados com cirrose e desenvolvimento HCC.

Efeitos de NPC2 sobre MAPK sinalização

Para identificar o mecanismo dependente de NPC2, enfatizamos sobre o estado de sinalização MAPK. Como mostrado na Figura 5, sustentada fosforilação de ERK1 /2 foi observada nas células NPC2 knockdown. No entanto, p38 e JNK não ativar em células NPC2 knockdown.

Total e fosforilada ERK1 /2, p38, JNK foram detectados por transferência de Western das células SK-HEP1. Knockdown dos resultados NPC2 na ativação de ERK1 /2.

Discussão

proteína NPC2 se liga com colesterol livre e controla a homeostase do colesterol intracelular [2]. A mutação do gene resulta em NPC2 acumulação de colesterol no compartimento endossomal /lisossomal tardia da célula [6]. No entanto, os papéis de expressão NPC2 em cancros humanos não são completamente compreendidos apesar do seu conhecido papel em colesterol de ligação. Neste estudo, foram gerados e caracterizados um número de NPC2 mAb e depois avaliada a sua imunorreactividade usando várias matrizes de tecido de tumor. A partir dos dados de mapeamento de epitopos, verificou-se que o mAb NPC2 alvo resíduos de aminoácidos 31-40 da proteína NPC2 humano (Figura 2B). Uma vez que os resíduos de aminoácidos 31-40 são altamente conservadas entre os vários ortólogos de mamífero [2], estes mAbs NPC2 deve ser utilmente aquando da realização de investigação sobre o papel da NPC2 em uma ampla gama de espécies de mamíferos no futuro. A sensibilidade e a especificidade do mAb NPC2 foi avaliada por knock-down NPC2 de proteína em células SK-HEP1 (Figura 2C).

A coloração IHC mostraram que a expressão NPC2 foi aumentada em cancros da mama, do cólon e do pulmão (Figura 3A). Desde forte expressão de NPC2 é observada em papiloma humano intraductal da mama, pólipos no cólon, carcinoma papilar pulmão e fimbria ovarianos [8,15], proteína NPC2 pode contribuir para papilados formação. Estudos epidemiológicos demonstraram que HER-2 subtipo [HER-2 (+), ER (-), e PR (-)] e negativo tripla [HER-2 (-), ER (-), e PR (-)] tiveram o pior sobrevivência, mau prognóstico e maior recidiva loco-regional [16-19]. Nosso estudo descobriu que NPC2 sobre-expressão está associada com HER-2 subtipo (Tabela 2), o que sugere que NPC2-regulação pode ser um preditor prognóstico favorável para câncer de mama.

O colesterol homeostase é importante corpos lamelares de células II que servem para a produção de surfactante pulmonar tipo alveolar. proteína NPC2 está presente no tipo alveolar pulmonar células II e macrófagos alveolares e regula o teor de colesterol surfactante [9,20]. Os nossos resultados mostraram que NPC2 é aumentada em tecido de adenocarcinoma do pulmão (Figura 3A). Proteomics análise demonstrou também que a expressão de NPC2 é aumentada em adenoma pulmonar e derrame pleural [21,22]. Embora não seja claro se NPC2 desempenha um papel no adenocarcinoma de pulmão, a presença de proteína na NPC2 derrame pleural de doentes com adenocarcinoma do pulmão sugere que pode ter um uso potencial como um marcador de diagnóstico para o cancro de pulmão.

redução da expressão de NPC2 foi observado especificamente em tecidos renais e tumores de fígado, em comparação com os seus homólogos normais. Desde NPC2 knockdown células de fibroblastos foram mostrados um fosforilação sustentada de ERK1 /2 MAPK [10], NPC2 podem regular negativamente ERK1 /2 de activação de MAPK. Com efeito, observou-se a activação de ERK1 /2 em células SK-NPC2 HEP1 knockdown (Figura 5). Em relação ao efeito da terapia de substituição em NPC2 NPC2 – /- ratos, verificou-se que a infiltração de macrófagos hepáticos e o número de células de gordura carregadas foram significativamente melhorados [23]. Desde acumulação de lípidos e, posteriormente, inflamação acelerar a progressão da cirrose e câncer de fígado [24,25], a administração NPC2 pode melhorar o desenvolvimento de câncer de fígado. Desde fígado é a principal fonte de plasma e NPC2 biliar [13], o aumento da NPC2 soros em cirrose e pacientes HCC pode relacionado ao dano grave de hepatócitos. No presente estudo, observaram-se também as alterações no padrão de expressão NPC2 glicosiladas no soro tanto de pacientes de carcinoma hepatocelular e cirrose, sugerindo que tais alterações podem servir como um indicador de cirrose do fígado e cancro. N-glicosilação é importante para a orientação adequada e da função de NPC2 [14]. Mais estudos são necessários para esclarecer os papéis de NPC2 glicosilada usando mais cirrose e casos de carcinoma hepatocelular.

Nos rins, NPC2 é abundantemente expressa no túbulo contornado distal e proximal (Figura 3B). Desde NPC2 é sobre-regulada em tecidos de rim de rato Dahl sensíveis ao sal dadas uma dieta de alto teor salino [26], tem sido sugerido que NPC2 pode regular a reabsorção de sódio no nefrónio. No entanto, a relevância funcional do NPC2 no carcinoma de células renais ainda não está claro e novos estudos são necessários para elucidar o papel do NPC2 no rim, tanto fisiologicamente e patologicamente.

Os resultados obtidos indicam que o nosso anticorpo monoclonal NPC2 tem aplicações potencialmente úteis nas áreas de diagnóstico clínico e progressão do câncer em vários tecidos.

Informações de Apoio

Tabela S1.

#, HBV ou HCV indicam os casos foram infectados pelo VHB e VHC, respectivamente

não-B não-C indicam pacientes não foram infectadas por vírus HBV e HCV. *, A classificação dos estágios da patologia estavam de acordo com AJCC, UICC, e CUPI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077586.s001

(DOC)

Tabela S2.

#, HBV ou HCV indicam os casos foram infectados pelo VHB e VHC, respectivamente.

doi: 10.1371 /journal.pone.0077586.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos TLCN para fornecer as amostras de tecidos de carcinoma hepatocelular e dados clínicos relacionados. Esta rede inclui atualmente cinco grandes centros médicos (National Taiwan University Hospital, Chang-Gung Memorial Hospital-LINKO, Veterano General Hospital-Taichung, Chang-Gung Memorial Hospital, Kaohsiung e veterano Hospital Geral, Kaohsiung).