Abstract
Objetivos
REIC /Dkk-3 é regulada para baixo em uma ampla variedade de células de cancro humano e é considerada funcionar como um supressor do tumor. Nós relatado anteriormente que REIC /Dkk-3-expressando vector adenovírus induzida retículo endoplasmático (ER) estresse (Ad-REIC) e apoptose específica por câncer no câncer de próstata humano. Neste estudo, examinamos o impacto terapêutico de Ad-REIC sobre o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
Materiais e Métodos
Foi examinado o efeito anti-tumoral de Ad-REIC em 25 linhas de células NSCLC
in vitro células A549
e
in vivo
. Duas destas linhas celulares foram artificialmente estabelecida como inibidor de EGFR-tirosina cinase (TKI) sublinhas resistentes.
Resultados
Ad-REIC-tratamento inibiu a viabilidade celular em 40% ou mais em 13 ( 52%) das linhas celulares de 25 a multiplicidade de infecção (MOI) de 20 (20 MOI). Estas linhas de células foram consideradas como sendo as células altamente sensíveis. A viabilidade das células de uma linha de células imortalizadas não-maligno, OUMS-24, não foi inibida em 200 MOI de Ad-REIC. Os efeitos de Ad-REIC em sublinhas resistentes EGFR-TKI eram equivalentes àqueles nas linhas celulares parentais. Aqui, demonstramos que o tratamento Ad-REIC activado c-Jun N-terminal quinase (JNK) em linhas celulares de NSCLC, indicando a indução do stress ER com GRP78 /BiP (GRP78) e a regulação positiva, resultando em apoptose. A injeção intratumoral única de Ad-REIC inibiu significativamente o crescimento tumorigénico de células A549
in vivo
. Como fatores preditivos de sensibilidade para o tratamento Ad-REIC em NSCLC, examinamos o estado de expressão de GRP78 e coxsackie e adenovírus receptor (CAR). Descobrimos que a combinação dos status GRP78 e Expressional CAR pode ser utilizado como um fator preditivo de sensibilidade Ad-REIC em células NSCLC.
Conclusão
Ad-REIC activação JNK induzida e apoptose subsequente em células NSCLC. Nosso estudo indicou que Ad-REIC tem um potencial terapêutico contra NSCLC e que os status de GRP78 e CAR expressão podem prever um potencial benefício terapêutico do Ad-REIC
Citation:. Shien K, Tanaka N, Watanabe M, Soh J, Sakaguchi M, Matsuo K, et al. (2014) Anti-Cancer Efeitos da REIC /Dkk-3-codificar Vector adenoviral para o tratamento de não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 9 (2): e87900. doi: 10.1371 /journal.pone.0087900
editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de dezembro de 2013; Aceito: 30 de dezembro de 2013; Publicação: 03 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Shien et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Nenhuma corrente fontes de financiamento para este estudo
Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo e a forma metastática é um importante fator que leva à mortalidade [1]. Existem dois principais subtipos histológicos de câncer de pulmão: o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e cancro do pulmão de pequenas células. estudos intensivos recentes identificaram alterações moleculares causativos que têm conduzido directamente para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e melhoraram o prognóstico do paciente [2]. Por exemplo, mutações do gene do receptor do factor de crescimento epidérmico (
EGFR
) são encontrados em cerca de 30% dos CPNPC, especialmente em adenocarcinomas do pulmão, e inibidores de cinase de EGFR-tirosina (TKI) são particularmente eficazes nestes tumores [ ,,,0],3], [4]. Mais recentemente, tem sido mostrado crizotinibe para ser eficaz para CPNPC com um
gene de fusão EML4-ALK
[5], [6]. No entanto, o número de pacientes com estas alterações é limitado, e pouca melhoria na prognóstico foi obtido no CPNPC sem estas alterações sensíveis a fármacos. Além disso, a resistência adquirida, eventualmente ocorre na maior parte dos
EGFR
tumores -mutant, que anteriormente tinha respondido a EGFR-TKI, após uma média de 10 meses de tratamento com [7]. Assim, uma nova modalidade terapêutica é necessário para melhorar a evolução clínica de pacientes com câncer de pulmão.
REIC /Dkk-3, um membro da Dickkopf (DKK) família de genes, é originalmente encontrada em células imortalizadas e tem foi relatado para ser um supressor do tumor; a sua expressão é significativamente regulada negativamente em uma ampla gama de tipos de células de cancro, incluindo cancro do pulmão [8]. A imagem heatmap de RNA mensageiro (mRNA) expressão de
REIC /Dkk-3
gene do cancro da UCSC Genome Browse, que está disponível gratuitamente base de dados pública (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (baixamos os dados em 16 de Julho de 2013), mostrou que
REIC /Dkk-3 expressão
gene foi reduzida na maioria das amostras analisadas de ambos os adenocarcinomas pulmonares e carcinomas de células escamosas em comparação com tecidos pulmonares normais (Figura S1) . Além disso, ele pôde ser confirmada a partir de uma base de dados pública que a expressão de
REIC /Dkk-3
também foi baixa em muitas linhagens de células NSCLC (Gene Expression Omnibus repositório [http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo, GEO GSE4824 adesão]). REIC /Dkk-3 é conhecida por interferir com a sinalização através de receptores de Wnt Wnt [9], [10] e foi previamente relatado para desempenhar um papel distinto na indução de apoptose e inibição de metástases [11], [12]. A indução de apoptose em células de cancro é causado principalmente por retículo (ER) endoplasmático o stress induzido pela superprodução de REIC /Dkk-3 nas células. ER stress desencadeia a activação da quinase c-Jun N-terminal (JNK), o que é um evento crítico na apoptose induzida pela produção excessiva de REIC /Dkk-3 utilizando um vector de adenovírus (Ad-REIC) [11], [13] . Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que o Ad-REIC teve um efeito terapêutico em vários tipos de cancro humano, incluindo a próstata, testículo, pleura, e carcinomas da mama [11], [13] – [15]. infecção ad-REIC e proteína REIC /Dkk-3 são também conhecidos para regular o immunosystem anti-tumoral [16]. Com base em dados pré-clínicos, um ensaio clínico utilizando Ad-REIC para câncer de próstata humana tem vindo a decorrer no Japão e nos EUA (NCT01197209).
Neste estudo, nós investigamos o efeito terapêutico do Ad-REIC em células NSCLC
in vitro
e
in vivo
. Também examinamos os fatores relacionados com a sensibilidade de linhas celulares para Ad-REIC como um passo para o desenvolvimento da terapia Ad-REIC personalizado para pacientes com NSCLC.
Declaração de Ética Materiais e Métodos
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade de Okayama (Permit Number: Oku-2012-549). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia cetamina e xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
As linhas celulares
linhas celulares Dezesseis de adenocarcinoma de pulmão humano, 3 carcinoma de células escamosas, 3 carcinoma de grandes células , um carcinoma adenoescamoso, sublinhas resistentes a EGFR-TKI 2 de HCC827 e células (HCC827-GR-high2 e RPC-9) PC-9, a linha de células de mesotelioma humano MSTO-211H (211H), e a célula de fibroblasto humano normal foram usadas linhas OUMS-24 neste estudo (Tabela 1). Os pormenores de linhas de células utilizadas neste estudo são descritos no Método S1. O HCC827-GR-high2 e linhas celulares de RPC-9 foram estabelecidos como descrito anteriormente [17], [18]. OUMS-24 foi estabelecido em nossa instituição [19].
Adenovirus vector portador REIC /Dkk-3
REIC /Dkk-3 foi sobre-expresso utilizando um adenovírus (Ad-REIC) que geraram anteriormente [11]. Um ADNc de comprimento completo de REIC /Dkk-3 foi integrado num vector de cosmideo pAxCAwt e transferido para um vector de adenovírus pelo método COS-TPC (Takara Bio, Shiga, Japão). Um gene LacZ adenovirus vector portador (Ad-LacZ), também foi utilizado como controlo [11].
A viabilidade celular ensaio
As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1,5 x 10
3 células /poço às 48 h após a infecção com Ad-LacZ ou Ad-REIC a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20, 100, ou 200 MOI. A viabilidade celular foi avaliada 3 dias mais tarde usando um ensaio MTS com CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagente (Promega, Madison, WI).
A apoptose ensaio
Para examinar o
in vitro
indução de apoptose após o tratamento, que as células semeadas em placas de 6 poços e incubou-se-lhes durante 24 h. As células foram tratadas com Ad-LacZ ou Ad-REIC a 20 MOI em meio isento de soro (500 ul) durante 2 h; o meio foi então substituído por meio completo fresco (2 mL). Após mais 48 h de incubação, a Hoechst 33342 corante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionada ao meio a uma concentração de 2 ug /mL, e as células foram incubadas no escuro durante 10 min. Hoechst 33342 é um corante de intercalação que permite a determinação de variações na quantidade total da cromatina e o grau de condensação da cromatina [15]. Usando a microscopia de fluorescência, foram identificadas as células apoptóticas pelo presença de núcleos altamente condensados ou fragmentados. As células apoptóticas foram contadas em 5 campos diferentes sob observação microscópica.
análise de Western blot
O protocolo detalhado para a análise de Western blot é descrito no Método S1. Foi realizada sob condições convencionais, utilizando os seguintes anticorpos: anticorpo de coelho anti-humano REIC /Dkk-3 levantada no nosso laboratório [11]; coelho GRP78 anti-humano /BiP (GRP78) (ab21685; Abcam, Cambridge, MA); de coelho anti-humano de SAPK /JNK (# 9252) e anticorpo de coelho anti-humano fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185; # 9251) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); receptor de coelho anti-humana do vírus coxsackie e adenovírus (CAR) (HPA030411; anticorpos Atlas, Estocolmo, Suécia); e de ratinho anti-actina (MAB1501; Millipore, Billerica, MA). Foram utilizados os anticorpos secundários seguintes: anticorpos de cabra anti-coelho ou peroxidase de rábano anti-IgG de ratinho conjugado (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para detectar os sinais específicos, as membranas foram examinadas utilizando ECL Western Blotting Detection mais reagentes (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido). Além disso, as intensidades das bandas de GRP78, CAR e actina, representando os seus níveis de expressão, foram medidas usando o software ImageQuant TL (GE Healthcare Bioscience) e quantificado por GRP78 ou carro rácio /actina.
O crescimento do tumor ensaio in vivo
células A549 (5 × 10
6 em 50 mL de tampão fosfato salino [PBS]) misturado com 50 mL de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de adultos do sexo feminino BALB /c nu /nu ratinhos (CLEA Japan, Tóquio, Japão). O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula empírica V = 1/2 x [(o diâmetro mais curto)
2 × (o diâmetro mais longo)]. Quando os tumores tinham atingido aproximadamente 50-100 mm
3, os ratos (n = 15) foram divididos aleatoriamente em 3 grupos de tratamento: (a) PBS; (B) Ad-LacZ; e (c) Ad-REIC. Os vírus (1 × 10
9 pfu) em 100 uL de meio isento de soro foram administrados intratumoral. No final das experiências, os ratinhos foram sacrificados após 24 dias depois da injecção virai e os tumores foram colhidos, medido, e fotografados.
Análise estatística
Todos os dados foram analisados utilizando STATA® ver.12 (Stata Corp., College Station, TX). O teste exato de Fisher foi aplicado quando for o caso. Para uma comparação de indução de apoptose entre Ad-REIC-tratadas e células A549 tratadas com Ad-LacZ, uma estatística Cochran-Mantel-Haenszel foi aplicado para comparar. medições repetidas ANOVA foi aplicado para a comparação dos tamanhos dos tumores NSCLC xenotransplantadas entre PBS, Ad-LacZ e Ad-REIC.
P Art 0,05 foi considerado significativo. Todos os testes foram em frente e verso.
Resultados
Efeito do Ad-REIC em NSCLC linhas celulares
Foi examinada a inibição da viabilidade celular utilizando Ad-REIC e um ensaio MTS . Em 13 (52%) de 25 linhas celulares de NSCLC, tratamento Ad-REIC a 20 MOI inibiu a viabilidade das células (40% -60% de inibição), em comparação com o tratamento com Ad-LacZ (Tabela 1, Figura 1). Estas linhas de células foram consideradas como altamente sensível para o Ad-REIC. Em contraste, linhas de células 12 (48%) não foram inibidas por tratamento com Ad-REIC a 20 MOI, e foram considerados como células resistentes. OUMS-24 não foi inibida em 20 ou 200 MOI de Ad-REIC. Digno de nota, o Ad-REIC tratamento a 100 e 200 MOI melhorou a inibição da viabilidade celular (100 MOI: 15% -59% de inibição, 200 MOI: 40% -78% de inibição), em comparação com o tratamento com Ad-LacZ (Tabela 1) . Assim, definimos 20 MOI como um valor MOI baixa e 200 MOI como um valor de alta MOI. Para comparação, o tratamento com Ad-REIC também foi realizada na linha de células de 211H mesotelioma humano, o qual foi previamente relatado ser Ad-REIC-sensíveis [14]. A 211H não foi inibida a 20 MOI, mas foi inibida em 200 MOI de Ad-REIC (Tabela 1). As características moleculares conhecidos de cada linha celular estão apresentados na Tabela 1. As 25 linhas celulares de NSCLC consistiu em 8
EGFR
-mutant, 6
KRAS
-mutant, 1
HER4
-mutant, 1
ARN
-mutant, 1
PIK3CA
-mutant, 1
EML4-ALK
de fusão, 1
HER2
-amplified e linhas 6 células sem alterações genéticas listados. Nove dos 17
EGFR
linhas celulares tipo -wild foram sensíveis ao Ad-REIC. HCC827 e sua sublinha resistente, HCC827-GR-high2, mostrou um grau semelhante de sensibilidade ao Ad-REIC. Nenhuma tendência no genótipo molecular foi observada entre as linhas de células sensíveis e não sensíveis. Estes resultados sugerem que o efeito de Ad-REIC não depende de um genótipo molecular conhecido.
As taxas de inibição de 25 linhas celulares de NSCLC transfectadas com Ad-REIC comparação com Ad-LacZ são mostradas como barras pretas em 20 MOI e barra branca em 200 MOI. Treze linhas celulares com taxa de inibição de mais de 40% em 20 MOI são definidos como altamente sensível e 12 linhas celulares com menor taxa de inibição em 20 MOI são definidas como resistentes. Todas as linhas de células resistentes mostra sobre a taxa de inibição de 40% em 200 MOI. As linhas celulares são classificados em 3 categorias, com base no nível de expressão da proteína GRP e carro como se segue; categoria A (baixo GRP /alta CAR), categoria B (baixo GRP /baixo CAR ou alta GRP /alta CAR), categoria C (alta GRP /baixo CAR). Todos os 8 linhas celulares altamente sensíveis foram incluídos na categoria A, e todas as linhas de células resistentes 5 foram incluídos na categoria C. Sq; carcinoma de células escamosas, AD; adenocarcinoma, LC; carcinoma de grandes células, ADSQ; carcinoma adenoescamoso, MM; mesotelioma maligno, NHF; fibroblasto humano normal.
Hoechst 33342 coloração foi realizada em células A549 para examinar a indução de apoptose. As células apoptóticas foram observadas em células A549 tratadas com Ad-REIC (Figura 2A). A taxa média de apoptose foi de 22%, e foi significativamente (p 0,001 pelo teste de Cochran-Mantel-Haenszel). Aumentado em comparação com o tratamento de controlo Ad-LacZ
(a) A indução de apoptose após
in vitro
Ad-REIC tratamento examinada em células A549 usando Hoechst 33342 coloração. O painel superior indica o aparecimento de células apoptóticas após o tratamento Ad-REIC. O painel inferior mostra a taxa de apoptose de células A549 após o tratamento indicado. Um total de 5 campos diferentes foram examinados sob um microscópio para determinar a taxa de apoptose. Foi observada uma diferença significativa (* p 0,001) entre o Ad-LacZ e o tratamento Ad-REIC. (Barra: 100 um) (b) análise de transferência de Western para as proteínas envolvidas na transdução de sinais desencadeados por Ad-REIC. As células foram colhidas 48 h após a transfecção com Ad-LacZ ou Ad-REIC a 20 MOI. (C) H460 células, que são resistentes a transdução de adenovírus, foram colhidas 48 h após a transfecção com Ad-LacZ ou Ad-REIC a 20, 100, e 200 MOI.
O efeito de recombinante REIC proteína /Dkk-3 em linhas celulares de NSCLC foi examinada em 7 linhas celulares seleccionadas aleatoriamente (NCI-H522, NCI-H611, NCI-H1299, NCI-H1819, NCI-H2009, PC-9, e A549). O ensaio MTS mostrou que REIC /Dkk-3 proteína não afectou a viabilidade das células nas linhas celulares examinadas, quando administrado a uma concentração que varia de 1 a 200 ug /mL (dados não mostrados).
A expressão de GRP78 e CAR em resposta à terapêutica Ad-REIC
Tal como fatores preditivos de sensibilidade Ad-REIC em NSCLC, examinamos as expressões de GRP78 e CAR; estes estados de expressão foram correlacionadas com a inibição da viabilidade das células pelo Ad-REIC em 13 linhas de células. Um estudo anterior relatou que a sobre-expressão de GRP78 inibida ER-stress, que pode ser opostamente correlacionada com o efeito de Ad-REIC. expressão carro está firmemente associada com a eficácia de infecção por adenovirus, a qual pode ser correlacionada positivamente com o efeito de Ad-REIC. Western blotting foi realizado, e o nível de expressão foi quantificado tal como mostrado na Tabela 1 e Figura 1. A mediana (gama) de GRP78 e expressões carro eram 0,24 (0,075-0,98) e 0,60 (0,080-2,1), respectivamente. Com base nestes dados, as células com um nível de expressão GRP78 mais do que 0,25 foram definidos como expressão CRP78 alta, enquanto aqueles com um GRP78 menos do que 0,24 foram definidos como baixa expressão GRP78. Em relação ao CAR, 15 linhas de células significativamente elevado nível de expressão CAR (acima de 0,50) foram definidos expressão como alta CAR, enquanto que 10 linhas de células esses com significativamente baixo nível de expressão CAR (menos 0,20) foram definidos expressão como Baixa CAR. expressão GRP78 foi baixa em 8 das células 13 Ad-REIC-sensíveis (62%) e em 4 das células resistentes Ad-REIC 12 (33%). expressão CAR foi elevada em 12 das células 13 Ad-REIC-sensíveis (92%) e em 3 das células resistentes a Ad-REIC 12 (25%).
Em seguida, classificou as linhas celulares em três categorias com base nos GRP78 e expressão CAR status; células com uma expressão /Alto carro de baixo GRP78 foram classificados como Categoria A, aqueles com baixa GRP78 CAR /Baixo ou Alto GRP78 expressão /Alto CAR foram classificados como Categoria B, e aqueles com alta GRP78 expressão /Baixo CAR foram classificados como Categoria C. as altas taxas de células sensíveis foram de 100% na categoria a (8º de 8, 95% intervalo de confiança [CI]: 63-100), 42% da categoria B (5 out of 12, IC 95%: 15-72), e 0% na categoria C (0 de 5, 95% CI: 0-52) (Tabela 2). As categorias foram significativamente associados com a sensibilidade ao tratamento Ad-REIC (p 0,01).
JNK e expressão GRP78 em linhas celulares de NSCLC tratados com Ad-REIC
Um western blot análise demonstrou a expressão significativa de REIC proteína /Dkk-3 em 14 linhas de células NSCLC tratados com Ad-REIC. Em 9 linhas de células infectadas com 20 MOI, tratamento Ad-REIC resultou na fosforilação de JNK e a sobre-regulação de GRP78 (Figura 2b). Nos outros 8 linhas celulares, que eram relativamente resistentes ao Ad-REIC, a activação de JNK e GRP78 foram observadas a valores mais elevados (MOI 100 e 200 MOI) (Figura 2C).
Efeito do Ad-REIC em tumores NSCLC em um modelo de xenotransplante
Nós investigamos o efeito da Ad-REIC sobre o crescimento das células A549
in vivo
. Uma semana após o transplante, quando o volume do tumor atingiu 50 a 100 mm
3, 1 x 10
9 unidades formadoras de placas de Ad-REIC ou Ad-LacZ em 100 uL de PBS ou 100 ul de PBS por si só eram injetado intratumoral. Os tumores cresceram progressivamente nos grupos de tratamento PBS e Ad-LacZ durante o período subsequente de observação de 24 dias. Em contraste, o crescimento do tumor no grupo de tratamento com Ad-REIC foi significativamente (p 0,001 por medidas repetidas ANOVA). Suprimido durante o período de observação (figura 3a, b)
(a) O volume médio do tumores de xenoenxertos subcutâneos foi calculada por 5 ratinhos em cada grupo. Foi observada uma diferença significativa entre os resultados de Ad-REIC e tratamento Ad-LacZ (* p 0,001 por medição repetida ANOVA). (B) Aparecimento de tumores no momento do sacrifício após o tratamento com PBS, Ad-LacZ e Ad-REIC.
Discussão
No presente estudo, verificou-se que ad-REIC era directamente aplicável em mais da metade das linhas de células NSCLC que foram examinadas, independente de suas alterações de driver conhecido como
EGFR Comprar e
KRAS
mutações. Um modelo animal xenoenxerto também mostrou que o efeito terapêutico de Ad-REIC. O efeito anti-tumoral de Ad-REIC depende da activação de JNK mediada por ER-stress carregado pela superprodução de proteína REIC /Dkk-3, resultando na indução de apoptose [14], [20]. A activação de JNK, que é um passo essencial na indução do stress ER e apoptose pelo Ad-REIC, foi observada a 20 MOI em linhas celulares de NSCLC. Por outro lado, não foi observado o efeito anti-tumoral da proteína recombinante REIC /Dkk-3, assim como em outros tipos de cancros que foram anteriormente analisados. Originalmente, REIC /Dkk-3 foi identificada como uma proteína secretora e assumiu-se que desempenham uma função fisiológica, mas o seu receptor da superfície celular e o seu papel como proteína de secreção não foram identificados.
definido como 20 MOI um valor de MOI baixo e 200 MOI enquanto um alto valor de MOI, porque as normais OUMS-24 da linha celular de fibroblastos humana não foi inibida em 20 ou 200 MOI de Ad-REIC, ao passo que linhas de células malignas foram inibidas quando o valor de MOI foi elevada para 100 e 200 MOI em linhas celulares em que Ad-REIC tinha sido ineficaz em 20 MOI. Em NSCLC, Ad-REIC foi eficaz a um valor baixo MOI em mais do que metade das linhas de células que foram testadas. Considerando o resultado que 211H foi inibida apenas com um valor alto MOI, Ad-REIC pode ser mais eficaz em NSCLC do que em mesotelioma.
A seleção dos pacientes com base nas características moleculares das células tumorais é um tema importante para maximizar a benefício terapêutico e minimizar os efeitos adversos. Para este efeito, são enfocados os níveis de expressão de GRP78 e expressão CAR. GRP78 é um membro da família Hsp70, o qual serve como um regulador de tensão-ER sinalização [21]. Um estudo anterior demonstrou que a sobre-expressão de GRP78 conferida resistência a uma grande variedade de agentes quimioterapêuticos em vários tipos de células [22]. Nós também mostrou que o clone de resistência adquirida de células PC-3 para Ad-REIC estabelecida após a exposição repetida a Ad-REIC exibiu um nível de expressão elevado de GRP78, em comparação com células PC-3 parental [13]. Teoricamente, Ad-REIC deve ser eficaz para células tumorais definidas na Categoria A e não tão eficaz para aqueles definidos como Categoria C. Embora foram identificadas células sensíveis na Categoria B, todos os 8 células da categoria A, responderam ao tratamento Ad-REIC. Estes resultados sugerem que os status de expressão de GRP78 e carro em tumores podem ser úteis como biomarcadores para a terapia personalizada Ad-REIC em NSCLC, enquanto mais uma confirmação é necessária por uma grande investigação escalado usando vários tipos de linhas celulares.
Como um tópico recente de tratamento de cancro do pulmão, o EGFR-TKI demonstraram ser eficazes para o tratamento de
EGFR
CPNPC -mutant. No entanto, a resistência adquirida a EGFR-TKI TKI após o tratamento é um problema que tem de ser ultrapassado. No estudo actual, os nossos resultados mostraram que o efeito de Ad-REIC contra células resistentes ao EGFR-TKI adquiridos era igual ao que contra as células parentais, o que sugere que o Ad-REIC pode ser útil após a aquisição de resistência a EGFR-TKI.
Embora vectores de adenovirus portadores de genes supressores de tumor adequadas, tais como REIC /Dkk-3, têm um grande potencial para a terapia genética do cancro, elas não apresentam especificidade de alvo e, por conseguinte, também podem infectar as células normais na vizinhança das células cancerosas . Os autores relataram que a infecção de fibroblastos humanos normais (NHF) com Ad-REIC não causar a apoptose de si NHF, mas em vez induzida a produção de interleucina (IL) -7. Quando o Ad-REIC-infectados NHF foram misturadas com as células cancerígenas não tratados e a mistura foi transplantado em murganhos, o crescimento das células cancerosas foi suprimida de forma significativa, o que sugere um efeito do tumor-supressor indirecta de Ad-REIC mediada por IL-7 [20] . Estes resultados mostram que a infecção segmentados por mis de células do estroma do cancro por Ad-REIC activa o sistema imunitário, através da produção de IL-7. Além disso, os autores relataram que REIC /Dkk-3 proteína desempenhou um papel-citocina como na diferenciação de monócitos em células do tipo dendritico, como características
in vitro
e que a infiltração de CD11c- e CD8-positivas (dendrítica e marcadores de células T killer, respectivamente células) foi observada nos tumores tratados
in vivo
. Na experiência usando um modelo de tumor de próstata ortotópico com pré-estabelecido metástases do pulmão, o número de tumores pulmonares metastáticas diminui significativamente depois da injecção de Ad-REIC no local do tumor primário para além da inibição do crescimento de tumores da próstata ortotópicos, sugerindo que o anti-câncer imune sobre-regulação por tratamento Ad-REIC em locais de tumor primário desencadeou efeitos anti-tumorais, mesmo no local do tumor distante [16]. Estes factos sugerem fortemente que REIC /Dkk-3 mostra um efeito anti-tumoral indirecta através do sistema imune anti-tumor que é um factor importante no tratamento da doença metastática. Porque Ad-REIC tem efeitos directos e indirectos na terapia do câncer, ele pode se tornar uma poderosa opção terapêutica como um “one-bala, e dois braços” agente anti-câncer especialmente para CPNPC, que muitas vezes metástase para outros órgãos.
em relação ao uso clínico, porque os nossos dados sugerem que o CAR e expressão GRP78 estados em células tumorais prever a capacidade de resposta do tratamento Ad-REIC, o tratamento Ad-REIC deve ser preferencialmente realizada para os pacientes que são classificados como grupo de alta sensibilidade no início fase do tratamento com uma dose baixa de Ad-REIC. Para pacientes cujas células tumorais revelaram eficácia pobre ou intermediário com uma dose baixa de Ad-REIC, que deve ser a sua fase tardia no tratamento com dose elevada de Ad-REIC. Para esses pacientes, relação custo-eficácia para o tratamento e evolução clínica deve ser cuidadosamente considerada. Como estratégia para a administração, a administração local pode ser preferível, em vez de administração sistémica para minimizar o efeito adverso em situações clínicas. Nós já confirmado no modelo de camundongo que Ad-REIC poderia ser amplamente distribuída nos corpos, após administração local intratumoral e administração local foi eficaz não só diretamente, mas também indiretamente, através do efeito sistema imunológico [16], [23]. Além disso, a administração local intrapleural poderia ser uma outra estratégia de administração para os pacientes com efusões pleural maligno. Tem sido relatado que a administração intrapleural de terapia génica mediada por adenovírus é uma abordagem útil para a produção de respostas imunitárias anti-tumor no mesotelioma maligno e efusão pleural metastática em diversos ensaios clínicos [24], [25].
em conclusão, foi demonstrado que o Ad-REIC induziu activação de JNK e apoptose subsequente em células NSCLC, independentemente do tipo de alterações moleculares conhecidas ou a sensibilidade a EGFR-TKI. O presente estudo sugere que Ad-REIC tem um potencial terapêutico para NSCLC, e os estatutos de GRP78 e CAR expressão pode ser um preditor da terapia Ad-REIC.
Informações de Apoio
Figura S1.
A imagem heatmap da expressão de mRNA de
REIC /Dkk-3 gene
. O nível de
REIC /Dkk-3
gene foi obtido a partir do cancro da UCSC Genome Browse, que está disponível gratuitamente base de dados pública (https://genome-cancer.ucsc.edu/) expressão de mRNA (que baixou o dados em 16 de julho de 2013), mostrou que
REIC /Dkk-3
expressão do gene foi reduzida na maioria das amostras analisadas de ambos (a) adenocarcinomas do pulmão e (b) carcinomas de células escamosas, em comparação com tecidos pulmonares normais.
doi: 10.1371 /journal.pone.0087900.s001
(PDF)
Método S1.
Informação de apoio para as linhas celulares e análise de Western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087900.s002
(DOC)