parafina-encaixado

Abstract

Os pacientes com rearranjos do gene ALK, muitas vezes manifesto respostas dramáticas para crizotinibe, um inibidor ALK. A identificação precisa dos pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células ALK-positivo (NSCLC) é essencial para a aplicação clínica da terapia alvo-ALK. No entanto, a avaliação

EML4-ALK

rearranjo em NSCLC continua sendo um desafio na prática patologia de rotina. O objetivo deste estudo foi comparar a precisão do diagnóstico de FISH, imuno-histoquímica (IHQ) e em tempo real RT-PCR quantitativo (qPCR) metodologias para detecção de

EML4-ALK

rearranjo em NSCLC e avaliar imuno-histoquímica como uma ferramenta de pré-rastreio. Neste estudo, um total de 473 amostras de NSCLC embebidos em parafina a partir de ressecções cirúrgicas e biópsias foram analisadas por IHC com anticorpos ALK.

ALK

rearranjo foi ainda confirmada por FISH e QPCR. a expressão da proteína ALK foi detectada em vinte pacientes (20/473, 4,2%). Dos 20 casos ALK-positivos por IHC, 15 casos foram confirmados como

ALK

rearranjo por FISH, e 5 casos não eram interpretável. Além disso, avaliou-se 13 dos 20 tecidos IHC-positivos por qPCR em adicional para os peixes, e constatou que 9 casos foram positivos e 2 casos foram ambíguos, enquanto 2 casos foram negativos, embora eles foram positivas por ambos IHC e FISH. O estado ALK foi concordante em 5 dos 8 casos que foram interpretável por três métodos. Além disso, nenhum dos 110 casos IHC-negativos com histologia de adenocarcinoma mostraram

ALK

rearranjos por FISH. Histologicamente, quase todos os

ALK

-rearranged casos foram adenocarcinoma, exceto que um caso foi o carcinoma sarcomatóide. Um padrão de células em anel de sinete sólida ou padrão cribriform mucinoso foi apresentada, pelo menos, focally em todos os tumores ALK-positivo. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que

ALK

rearranjo foi associada com a expressão da proteína ALK. O ensaio IHC convencional é uma ferramenta valiosa para a pré-triagem de pacientes com

ALK

rearranjo na prática clínica e uma combinação de peixes e QPCR é necessária para confirmação

Citation:. Zhang YG , Jin ML, Li G, Zhao HY, Zeng X, L Jiang, et al. (2013) Avaliação da

ALK

Rearranjo em chinês Non-Small Cell Lung Cancer Usando FISH, imunohistoquímica e Real-Time quantitativa RT-PCR em tecidos incluídos em parafina. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10.1371 /journal.pone.0064821

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 23 de novembro de 2012; Aceito: 18 de abril de 2013; Publicado em: 31 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (NO.81050015). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1], [2], apesar das melhorias nos métodos e tratamentos de detecção. Entre câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), sendo responsável por aproximadamente 85% de todos os cânceres de pulmão, o adenocarcinoma é o tipo mais comum de câncer de pulmão em homens e mulheres [2]. Atualmente, os esforços são dedicados ao desenvolvimento de moléculas contra alvos específicos para tipos específicos de tumores. Com a melhoria contínua em nossa compreensão das bases moleculares do câncer de pulmão, uma série de terapias direcionadas para NSCLC estão sendo avaliados ou desenvolvidos. Estes tratamentos incluem inibidores de angiogénese e inibidores de transdução de sinalização, tais como o receptor do factor de crescimento epitelial (EGFR) terapias -targeted [3]. Portanto, a identificação dos oncogenes importantes de cancro do pulmão é um passo muito importante para o desenvolvimento de agentes de direccionamento molecular novos.

Recentemente, a activação da quinase de linfoma anaplásico (ALK) gene no cancro do pulmão pela fusão de proteína-like4 echinoderm microtúbulos-associado (EML4) ou outros parceiros gene (tais como

TFG

e

KIF5B

) tem sido relatada [4], [5], [6]. O gene ALK foi caracterizada inicialmente como um parceiro de fusão do oncogene NPM-ALK em linfoma anaplásico de células grandes [7], e é agora reconhecido como o componente activo em várias proteínas de fusão numa variedade de cancros [8]. Alk é um receptor transmembranar de cinase de tirosina com atividades pertencentes à superfamília de receptores de factor de crescimento semelhante à insulina, que é codificado no cromossoma 2 (2p23). Os vários parceiros de fusão de mediar a dimerização ALK independente do ligando de ALK, resultando em actividade de quinase constitutiva e, assim, transmite sinais apoptóticos e anti-proliferação celular por meio de KRAS e PI3K [8]. Em NSCLC, a activação aberrante de ALK contribui para carcinogênese de pulmão depois de ser fundido com um número de outros parceiros de genes, mais frequentemente equinodermos associada a microtúbulos de proteína 4 (

EML4

). gene EML4 está localizado no cromossomo 2 (2p21) e é inversamente orientado com

ALK

.

EML4-ALK

fusão pode ocorrer após uma clivagem do cromossoma num local variável e inversão cromossoma, dando origem a diferentes isoformas de fusão [9].

EML4-ALK

fusão ocorre de uma forma mutuamente exclusiva com

EGFR

ou

KRAS

mutações e quase exclusivamente em adenocarcinoma. A presença de

EML4-ALK

é mais provável em pacientes com certas características demográficas, como o estado não fumar ou idade mais jovem [10]. A maioria dos estudos descobriu esta anomalia genética a uma taxa de 2-5% na população geral de pacientes com NSCLC [11], [12], [13], [14].

Em ensaios clínicos anteriores, crizotinibe, um inibidor da quinase ALK dupla /MET, foi mostrado ser dramaticamente eficaz em doentes com NSCLC ancorando rearranjos do gene ALK [15]. Crizotinibe foi recentemente aprovado pelo FDA dos EUA para o tratamento de avançada

ALK

-positivo NSCLC identificado por hibridização fluorescente in situ (FISH) [16]. Para garantir a identificação de pacientes com maior probabilidade de se beneficiar de Crizotinibe, é vital para desenvolver métodos de diagnóstico robusto e fácil de detectar ALK rearranjo de genes quando triagem de pacientes para tratamento com crizotinib. Embora ALK FISH tornou-se o padrão ouro para a detecção de

ALK

rearranjo em NSCLC, pode ser tecnicamente desafiadora e cara. Portanto, outras modalidades de diagnóstico continuam a ser explorados, incluindo imuno-histoquímica (IHQ) e reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR). RT-PCR é uma técnica altamente sensível para a detecção e quantificação de ARN para

EML4-ALK

. Ele também é capaz de digitar o

EML4-ALK

variante por sequenciação do produto da PCR. No entanto, porque esta metodologia pode não identificar novos rearranjos envolvendo anteriormente uncharacterized

EML4-ALK

variantes ou parceiros de fusão desconhecido e seu processo pode ser facilmente contaminados, sua sensibilidade e especificidade continuam a ser validado. IHC tem a vantagem de ser amplamente disponíveis, relativamente fácil de realizar e retém informação morfológica, que permite a avaliação confiante de genes aberrantes em células tumorais. Por esta razão, ALK IHC parece adequado para um rastreio em grande escala de pacientes com

ALK

-positivo NSCLC.

O grande desafio para usando ALK IHC é a expressão muitas vezes de baixo nível de ALK proteínas de fusão em

ALK

-rearranged NSCLC [16], o que torna necessário o desenvolvimento de métodos baseados em IHC mais sensíveis. Vários anticorpos ALK foram relatados em estudos recentes que mostram que IHC tem alta concordância com peixes ALK, incluindo anticorpo monoclonal alq1 da Dako [17], o anticorpo monoclonal 5A4 de Novocastra [18], e D5F3 anticorpo monoclonal desenvolvido por Cell Signaling Technology [19] . No entanto, estudos em larga escala são necessários para validar ainda mais a concordância entre IHC e peixe, bem como o desenvolvimento e avaliação de novos anticorpos com alta especificidade e sensibilidade para as proteínas de fusão ALK seria muito bem-vindo.

Neste estudo, nós examinou ALK rearranjo de genes utilizando imuno-histoquímica em NSCLC amostras clínicas, e correlacionaram os resultados com aqueles obtidos por FISH e QPCR. Além disso, investigamos características clínico-patológicas de NSCLC com rearranjos do gene ALK. O presente estudo teve por objetivo identificar a informação útil prever o rearranjo de genes ALK e determinar um procedimento de diagnóstico que podem ser realizados na prática rotineira.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê de Ética Clínica do Hospital Pequim Chao-Yang, Capital Medical University. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina de arquivamento foram obtidas de 473 pacientes que tinham sofrido um tratamento de câncer de pulmão primário entre 2006 e 2011 no Hospital Chao-Yang de Pequim Capital Medical University na China. Os casos foram selecionados aleatoriamente entre os pacientes diagnosticados como NSCLC por exame histológico de amostras obtidas por ressecção cirúrgica e biópsia. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia antes da cirurgia e biópsia. Para todos os casos, analisamos a idade no momento do diagnóstico, sexo, história de tabagismo, e localização do tumor primário, que foram obtidos a partir de registros médicos. De acordo com o 7º manual de estadiamento edição TNM para câncer de pulmão publicado pela AJCC em 2010, todos os casos foram revistos e encenado. Todas as lâminas histológicas disponíveis de cada caso foram reavaliados e o tipo histológico e grau de diferenciação foram confirmados de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde classificação dos tumores do pulmão e as ERS /ATS /IASLC classificação multidisciplinar de adenocarcinoma de pulmão [20]. Para cada caso, o bloco de tecido contendo células de tumor representante mais viáveis ​​foi seleccionado por dois patologistas. O estágio da doença era pós-operatória estágio patológico. As doenças estágio IV incluídos casos que receberam biópsias por pulmonar a céu aberto ou cirurgia torácica vídeo-assistida para o diagnóstico. Os dados clínico-patológicos estão resumidos na Tabela 1.

Detecção ALK com Imunohistoquímica

Para cada caso, um representante fixo em formalina incorporado parafina (FFPE) bloco de tecido foi escolhido e seccionados a espessura de 4 mm para a imunocoloração. Resumidamente, após desparafinização e re-hidratação, as lâminas foram aquecidas para a recuperação de antigénio na panela de pressão durante 3 minutos a 100 ° C em 0,01 mol /L de tampão de Tris-EDTA (pH 9,0). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das lâminas em peróxido de hidrogénio a 3% em metanol absoluto durante 15 minutos, e a ligação não específica foi bloqueada com soro de cabra a 10% durante 15 minutos. Um anticorpo monoclonal de coelho para ALK (clone SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, EUA) foi utilizado como o anticorpo primário a uma diluição de 1:100. Após incubação durante a noite com o anticorpo ALK a 4 ° C, as lâminas foram incubadas com um anticorpo anti-coelho, o anticorpo secundário de rábano polímero marcado com peroxidase a partir do DAKO Envision + ™ System (DAKO Corporation). A imunorreactividade foi visualizada com 3,3′-diaminobenzidina (DAKO Corporation, Carpinteria, CA). Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina e montadas. secções de controlo positivo de casos conhecidos ALCL ALK-positivos foram incluídos em cada lote de coloração. tecido de linfonodos normais foi utilizado como um controlo negativo. Para o controle em branco, todas as etapas de incubação eram idênticas, exceto que soro de coelho IgG não imune foi usada em vez do anticorpo primário (ALK).

Foram determinados os critérios de pontuação durante uma avaliação preliminar usando um microscópio multi-dirigido, a fim de chegar a um acordo. os resultados da coloração foram então interpretada por dois dos autores de forma independente, sem o conhecimento prévio dos parâmetros clínico. casos discordantes foram revistos e acordados antes que os dados foram analisados ​​estatisticamente. Para cada amostra, foram analisados ​​pelo menos cinco campos (400 ×) e mais de 500 células. Para as manchas de ALK, apenas a coloração citoplasmática inequívoca foi considerada como uma reacção positiva. O número de células imunopositivas foi estimado semiquantitativamente: sem células positivas (-); 50% das células tumorais que coram positivo (+); 50% -75% das células tumorais coloração positiva (++); . 75% de células tumorais coloração positiva (+++) A intensidade da coloração foi classificada numa escala de 0 a 3+ (0, negativo; 1+, fraco; 2+, moderada; 3 +, intenso), de forma semelhante com os protocolos previamente descritos [17], [18].

fluorescência Hibridização In Situ (FISH)

FISH foi realizada em, embebidos em parafina (FFPE) tecidos tumorais fixados em formol utilizando o Vysis LSI ALK dual Color, Separar Rearranjo Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, EUA). A ALK quebra-apart conjunto de sonda inclui duas sondas de ADN marcadas com Spectrum Orange and Spectrum Verde que, respectivamente, hibridizam com a banda 2p23 em lados opostos flanqueando o ponto de interrupção do gene ALK. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, secções de 4 um de espessura dos blocos de tecidos FFPE foram desparafinados e desidratados, em seguida, as secções foram tratadas com o reagente pré-tratamento Vysis (Abbott molecular) e feito reagir com solução de protease (Abbott Molecular). A mistura de sonda de quebra-Além ALK foi aplicada a todo o tecido, e foram co-desnaturada a 73 ° C durante 3 minutos. As lâminas foram então hibridizados durante a noite numa câmara humidificada a 37 ° C. Após a lavagem, os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Os cortes foram analisados ​​sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro passa-triplo (DAPI /verde /laranja). Uma análise repetida de algumas amostras foi efectuada devido a sinais de hibridação fraca e /ou morfologia do tecido pobre. lâminas de controlo positivo e negativo foram incluídos em cada série de teste FISH.

FISH Interpretação

De acordo com as especificações do fabricante, as lâminas PEIXES foram avaliados sem o conhecimento dos resultados de IHC para ALK. Os dois técnicos analisaram cada slide FISH, a digitalização da secção de tecido inteiro e marcando 50 núcleos representativos, que foram claramente identificados e constantes sinais inequívocos. Núcleos contendo sinais de uma única cor não deve ser enumeradas. Os resultados de cada técnico não foram combinados até o término do estudo para minimizar qualquer tendência para marcar. A célula foi considerada como positiva, quando um núcleo tido, pelo menos, um conjunto de sinais para além quebrados, ou teve um único sinal vermelho (sinal suprimido verde) em adição aos sinais fundidos e /ou quebrada. A distância entre dois sinais vermelhos e verdes separados, foi estimada utilizando os dois momentos de maior tamanho do sinal. As amostras foram consideradas positivas se mais do que 25 de 50 células tumorais foram positivas, negativo e se a menos de 5 células tumorais foram positivas. A amostra com 5-25 células tumorais positivas foi considerada ambígua, e, em seguida, foi avaliada por um segundo técnico. A primeira e segunda leituras de contagem de células foram somados e um por cento foi calculado de 100 células. Se a percentagem média de células positivas foi de 15% ou mais, a amostra foi considerada positiva. Caso contrário, ele foi considerado negativo para

ALK

rearranjo.

em tempo real RT-PCR quantitativo (qPCR)

O RNA total foi extraído de secções de tecido FFPE recém-cortadas usando o kit RNeasy (Qiagen). Resumidamente, a área de tumor foi identificado através de coloração com hematoxilina-eosina e do tecido a partir desta área em secções coradas foram raspadas para extracção de ARN. Depois dos passos desparafinização e lise, o ARN total foi purificado com uma coluna de centrifugação RNeasy MinElute. O ADN genómico foi removido com DNase I isenta de RNase (Qiagen). Antes de amplificação de ARN, a integridade e a pureza do RNA foi estimada por eletroforese em gel de agarose desnaturante e medição de A260 /A280.

em tempo real a amplificação por PCR foi realizada utilizando o gene de fusão Kit de Detecção AmoyDx ™ EML4-ALK (Amoy Diagnostics , Xiamen, China) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, 0,1-5 ug de RNA total foi transcrito de modo reverso para ADNc, utilizando M-MLV da Transcriptase Reversa (Invitrogen). Seis microlitros de ADNc foi então utilizado como molde para uma reacção de 25 ul para a detecção em tempo real de PCR dos transcritos de fusão EML4-ALK usando o EML4-ALK Reacção mestre Misturas e um aparelho de ciclos ABI 7500 (Applied Biosystems). O gene de fusão Kit de Detecção de EML4-ALK emprega novela, primers proprietárias para amplificar especificamente a sequência do gene alvo envolvendo nove variantes conhecidas EML4-ALK transcrição de fusão, incluindo E13; A20, E6a /b; A20, E20; A20, E15; A20, E14 ; A20, E18; A20, E2; A20, E17; A20. A quantidade de ADNc alvo foi medido após cada ciclo na fase de captura de dados usando uma sonda fluorescente romance. A qualidade do ADNc sintetizado foi verificada durante a mesma execução através de amplificação do gene de referência (β-actina,

ACTB

). O gene de fusão EML4-ALK e

ACTB

ensaios foram marcados com FAM. Um controlo positivo e negativo foi incluído em cada PCR em tempo real de execução. Tal como definido nas instruções do fabricante, ensaio de QPCR para o gene de fusão EML4-ALK foi considerada positiva, se a amostra de valor de Ct 30. Para as amostras negativas, em tempo real ensaio de RT-PCR foram repetidos duas vezes.

Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS para Windows programa 13.0 (SPSS Inc., Chicago , IL). Para analisar as correlações entre

ALK

status e variáveis ​​clínicas-patológico, foi utilizado o teste χ2 ou teste exato de Fisher, quando aplicável. Os valores de probabilidade de 0,05 foram considerados significativos nas análises

Resultados

Características Clinicopathogical de tumores

No presente estudo, analisamos um painel de 473 amostras de NSCLC,. compreendendo 375 casos de tumores cirurgicamente ressecados, e 98 casos de biópsias. Nenhum paciente recebeu quimioterapia no momento do diagnóstico. Como estão resumidos na Tabela 1, os pacientes composta de 314 (66,4%) homens e 159 (33,6%) mulheres com uma idade mediana de 59 anos (de 21 a 84 anos). Histologicamente, 341 (72,1%) foi adenocarcinoma, 112 (23,7%) carcinoma de células escamosas, e 20 (4,2%) outros tipos. O estágio patológico eu estava em 166 (35,1%), II em 104 (22%), III, em 105 (22,2%), e IV em 98 (20,7%) casos.

Expression ALK proteínas por IHC

Todos os casos ALK-positivos exibiram uma difusa e padrão de coloração citoplasmática em células tumorais, e não a imunocoloração foi observada no epitélio normal pulmonar brônquica, pneumócitos alveolares, macrófagos alveolares, tecidos mesenquimais, e células inflamatórias nos tecidos pulmonares adjacentes (Figura 1). Vinte casos em cada 473 foram ALK-positivos, o que representa 4,2% de todos os casos estudados por IHC, que incluiu pontuação de 3 visto em 14 casos com uma intensa coloração citoplasmática granular (Figura 1-A), escore de 2 em 5 casos com coloração moderada citoplasmática (Figura 1-C), pontuação de 1 em 1 caso com uma coloração fraca citoplasmática (Figura 1-e) e pontuação de 0 em 453 casos (Figura 1-G). Não se observou qualquer coloração intratumoral heterogeneidade significativa, embora as células em anel de sinete tendem a apresentar uma coloração mais fraca do que as outras células, talvez porque a proteína ALK citoplasmática foi diminuída por um grande volume de material de muco. Não houve correlação aparente entre o rearranjo de genes ALK por FISH ea intensidade de imunomarcação

A, C, E, G:. Imunomarcações ALK (aumento original x 200). A e C: colorações citoplasmáticos intensa e moderada (pontuação = 3 e 2, respectivamente), E: fracos colorações citoplasmáticos (pontuação = 1) e G: sem coloração (pontuação 0). B, D, F e H. análise FISH para

ALK

usando uma sonda quebra-apart ALK dual-cores. B, D e F sigals show de peixes nos tumores reorganizados-ALK, e a proporção de células com sinais positivos de ALK foi de 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), respectivamente . Reorganizados

ALK

(B, D e F) é indicada por divisão de sinais vermelho e verde ou vermelho signals.H única mostra sigals peixes em um tumor não-reorganizados. a proporção de células com sinais positivos de LFA foi de 3% (3/100). Não reorganizados

ALK

(H) mostra fusão ou sinais vermelhos e verdes adjacentes.

ALK Rearranjo avaliado por FISH

ALK rearranjo foi avaliada usando FISH em 110 casos IHC-negativos com histologia adenocacinoma e 20 casos IHC-positivos. Entre os 20 casos IHC-positivos, 15 casos foram confirmados como

ALK

rearranjo por FISH ALK, 5 casos não foram interpretáveis, devido aos artefatos técnicos, tais como a perda de sinal que possivelmente resultaram da fixação ou perda de tumor inadequado tecido. Nenhum dos casos 110 IHC-negativas mostraram

ALK

rearranjo por FISH. Imagens representativas de ALK peixe são mostrados na Figura 1-B, D, F, H. Havia dois

ALK

rearranjo padrões positivos. Um deles foi o (BA) padrão de quebra-apart com um ou dois sinais vermelhos e verdes separados, e outro foi isolado padrão de sinal vermelho sem sinal verde correspondente. Os casos FISH negativo ALK mostrou dois sinais de fusão ou proximidade dos sinais vermelhos e verdes.

Correlação entre ALK IHC e FISH

No presente estudo, 130 casos foram analisados ​​por ambos IHC e FISH. A concordância entre IHC e FISH é mostrada na Tabela 2. Sem considerar 5 casos por FISH não foram interpretáveis, a sensibilidade e especificidade de IHC nos 125 casos, em comparação com os peixes, foram de 100% e 100%, respectivamente. Assim, este estudo mostrou que houve alta concordância na avaliação da

ALK

rearranjo entre IHC e FISH.

fusão do gene EML4-ALK por qPCR

em seguida, testados 13 casos IHC-positivos por qPCR. Os genes de fusão foram EML4-ALK detectada em 9 dos 13 casos. Eles incluíram

EML4-ALK

variante 1, 2, 3 com exon 13 do

EML4

, exão 20 do

EML4

e exão 6a /b de

EML4

fundido ao exão 20 do

ALK

, respectivamente. Houve 2 casos em que os genes de fusão EML4-ALK não foram detectados por qPCR, mas

ALK

rearranjos foram detectados por FISH. Além disso, o resultado positivo para

EML4-ALK

em 2 casos não poderia se repetir na análise repetida. É de notar, em um caso, ALK FISH foi informativo para

ALK

rearranjo, mas o caso foi relatado positiva por qPCR. Este resultado poderia ser devido à escassez de células tumorais. Neste exemplo, um total de 30 núcleos de células tumorais representante foram contadas, e apenas duas células tumorais foram positivas.

Características clínico-patológicas de ALK-positivo pacientes

Um total de 473 ressecado e biópsia NSCLC foram examinadas amostras. a expressão da proteína ALK foi avaliada em todos os casos por IHC.

EML4-ALK

translocações e /ou

ALK

rearranjos foram confirmados em todos os casos ALK-imuno por FISH e /ou QPCR. A relação entre

ALK

rearranjo e características clinicopatológicas está resumida na Tabela 3.

ALK

rearranjo foi detectada em 20 de 473 casos de NSCLC. Dos 20 casos ALK-positivo, 19 (95%) eram adenocarcinomas, e uma era de carcinoma sarcomatoide que tinha uma célula fuso significativa e o componente de célula gigante. Histomorfologicamente, como mostra a Tabela 4, o

ALK

-rearranged adenocarcinomas pulmonares frequentemente apresentaram padrão celular anel de sinete sólida. Um padrão de células em anel de sinete sólido ou padrão cribriforme mucinoso foi apresentada, pelo menos, focalmente em todos os tumores ALK-positivo (Figura 2). Como mostrado na Tabela 3, os pacientes ALK-positivos mostraram diferença estatística na idade (p = 0,003) e fase patológica (p = 0,024), em comparação com pacientes -negativas ALK. Os pacientes com adenocarcinoma de pulmão ALK-positivos eram mais jovens no momento do diagnóstico e teve um estágio mais elevado, mais comumente na fase IV. Nenhuma relação significativa foi demonstrada entre rearranjo ALK e ambos os sexos ou fumar história do paciente.

Eles mostraram padrão sólido de células em anel de sinete (A), uma estrutura cribriform (BD), e muco extracelular abundante (C).

Discussão

Embora o gene de fusão EML4-ALK é uma anomalia genética menor em NSCLC [21], [22], a incidência de câncer de pulmão está a aumentar em muitos países, o número absoluto de doentes com cancro do pulmão que alberga o gene de fusão EML4-ALK não é trivial. Crizotinibe, um inibidor de tirosina-quinase dupla de TEM /ALK tem sido mostrado para ser eficaz para o tratamento de doentes com NSCLC ALK-positiva. Com base na sua eficácia e segurança, crizotinibe foi recentemente aprovado pelo FDA dos Estados Unidos para o tratamento de doentes com NSCLC avançado ALK-positiva. No entanto, a incidência de

ALK

rearranjo é relativamente baixa, variando de 2 a 5%. Mesmo quando uma população enriquecida de pacientes com NSCLC são selecionados com base em suas características clínicas de previsão, tais como a idade mais jovem, estado não-fumadores, e histologia de adenocarcinoma, é difícil identificar os subconjuntos de tumores ALK-positivos. Portanto, o rastreio eficaz para pacientes com

ALK

-rearranged NSCLC é uma questão crucial na prática clínica.

O ALK teste FISH quebra-apart tem servido como o teste dignostic companheiro para estabelecer ALK positividade em ensaios clínicos de crizotinibe [15]. Em teoria, ALK FISH é capaz de detectar qualquer reorganização envolvendo

ALK

, independentemente de os parceiros de fusão ou o

EML4-ALK

variantes, sobre o tecido FFPE que representa o método mais comum para o processamento e armazenar as amostras de tumor. No entanto, do ponto de vista tecnológico e custo, FISH para a detecção de rotina em larga escala de

ALK

rearranjo em NSCLC continua a ser um desafio. É urgente desenvolver e validar métodos economicamente mais eficaz para detectar esta aberração genética. abordagens atuais de diagnóstico para detectar

ALK

rearranjo incluem imuno-histoquímica (IHQ), FISH e reação em cadeia da polimerase (PCR) métodos baseados. No entanto, dados suficientes para uma comparação adequada com os peixes não existem actualmente.

IHC é um método rápido e acessível preferido por patologistas para diagnóstico de rotina. Ele pode ser realizado com sucesso numa variedade de espécimes histológicos e citologia. Embora a técnica de imuno-histoquímica não detectar directamente o gene de fusão LFA-se, com base na observação de que ALK não é detectável em quaisquer outras do que o cérebro [23] tecidos normais, ALK-imunorreactividade está associado com a expressão regulada positivamente dos genes, devido ao atividade do promotor alterado que é muito característico de um

ALK

inversão. Estudos anteriores demonstraram que alguns anticorpos ALK disponíveis comercialmente têm relativamente baixa sensibilidade na detecção de ALK por IHQ, possivelmente devido a uma fraca actividade de transcrição da região de promotor-potenciador de

EML4

que dirige a expressão de EML4-ALK. O anticorpo D5F3 (Cell Signaling Technology) é um dos mais promissores anticorpos para a detecção de

ALK

rearranjo em NSCLC [19]. No entanto, mais estudos continuam necessário para validar concordância entre IHC e peixes em séries maiores de amostras

No presente estudo, foi realizada imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal (Clone SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, EUA)., um comumente utilizado, bem testado anticorpo ALK para a mesma diluição tal como utilizado na ALCL, tornando a sua utilização mais prático do ponto de vista de diagnóstico laboratorial. Este anticorpo reconhece uma proteína p80 humana, identificado como um gene híbrido de ALK e o gene de nucleofosmina (NPM) resultante da translocação t (2; 5) (p23; q35) translocação encontrados em 30-50% dos linfomas de células grandes de CD30 +. Reconhece-se também a proteína ALK de comprimento completo. O nosso método de IHC é com base em um método para a prática padrão IHC patologia de rotina. Nós prolongada antigénio tempo de recuperação e incubada durante a noite no anticorpo 4 ° C para aumentar a sensibilidade e especificidade. A taxa de ALK-positivos nos casos de NSCLC (20/473, 4,2%) foi comparável à taxa de transcrição de fusão EML4-ALK relatado nos estudos anteriores (2-5%). Todos os casos NSCLC ALK-positivos por IHC mostraram ALK rearranjo de genes por FISH e /ou QPCR. Por outro lado, entre os 473 casos NSCLC, foram selecionados aleatoriamente 110 casos IHC-neagative com histologia de adenocarcinoma de avaliar

ALK

rearranjo por FISH, e descobriu que não havia casos em que

ALK

o rearranjo de genes foi detectado. Em contraste com um estudo anterior [6], o teste de IHQ com anticorpo SP8 apresentaram maior especificidade e sensibilidade em nosso estudo. A coloração ALK forneceu uma imunorreactividade muito limpo, fácil de interpretar, sem perturbar a coloração de fundo nos casos positivos. Esta discrepância resultou presumivelmente do procedimento IHC diferente, tais como recuperação de antigénios e incubação do anticorpo, ou resultaram de variações no processamento de tecidos em diferentes laboratórios. Nossos resultados ficou para ser confirmada em estudos de coorte lager.

RT-PCR de cDNA tem sido uma estratégia de triagem comumente aplicado para rearranjos do gene ALK. Por sequenciação do produto de PCR, as variantes específicas expressas EML4-ALK pode ser identificado. No entanto, novos parceiros de fusão ALK não será detectado com tais técnicas. Em estudos recentes, RT-PCR de detecção baseado

ALK

rearranjo tem sido largamente restringidos ao tecido fresco ou congelado. Em comparação com RT-PCR multiplex, QPCR aparece um método perfeitamente adequado para a identificação directa de variante de fusão e detecção do seu nível de expressão, devido ao seu baixo custo e tempo de resposta rápido. RT-PCR de detecção com base de

ALK

rearranjo em tecidos FFPE requer optimização do projecto de ensaio e continua a ser avaliada em grandes estudos de coorte. Em nosso estudo, foi realizada QPCR em tecidos FFPE de 13 casos ALK-positivo em IHC. 2 casos foram negativos para

EML4-ALK

por qPCR, mas positivos para

ALK

arranjo por FISH. Presumivelmente, não eram parceiros de fusão ALK romance ou novela

EML4-ALK

variante, enquanto o nosso projeto ensaio envolveu apenas nove conhecido

EML4-ALK

variantes. Este manteve-se a ser validado por sequenciamento do gene. Em adicional, a degradação do RNA nos blocos de tecido FFPE também podem levar a resultados falso-negativos. Em nosso estudo, todos os blocos de tecido FFPE testados foram 7-45 meses de idade, quando o nosso trabalho de detecção foi realizada. qualidade de ARN e a ausência de contaminação com ADN genómico foi verificada por electroforese em gel de formaldeído-agarose. Nós também quantificado o nível de β-actina como controlo de qualidade do RNA endógeno. O controlo da qualidade exigida, incluindo um controlo sem molde, conhecido controlo ALK-positivo e negativo, foi realizada ao longo de todo o procedimento. Nossos resultados demonstraram QPCR em tecidos FFPE não foi eficiente o suficiente como um método de detecção único, mas manteve-se útil para identificar a variante de fusão envolvidos quando material congelado não está disponível.

Foi realizada FISH, que é considerado como a corrente