Abstract

Fundo

métodos actualmente disponíveis para o diagnóstico e estadiamento do câncer de próstata não têm a sensibilidade para distinguir entre pacientes com câncer de próstata indolente e aqueles que exigem tratamento radical. Alterações na adherens chave (AJ) e junção apertada (TJ) componentes têm sido aclamados como potenciais biomarcadores para a progressão do câncer de próstata, mas a maioria das pesquisas foi realizada em moléculas individuais.

Objectivo

para elucidar um painel de biomarcadores que podem ajudar a distinguir o câncer de próstata latente da doença metastática agressiva.

Métodos

Foi analisada a expressão de 7 componentes AJ e TJ bem conhecidos em linhas celulares derivadas de próstata normal, tecido epitelial (PNT2), não-invasivo (CAHPV-10) e câncer de próstata invasiva (LNCaP, DU145, PC-3) utilizando a expressão do gene, técnicas de transferência e de imunofluorescência ocidentais.

resultados

claudina 7, α -catenina e a expressão da proteína β-catenina não foram significativamente diferentes entre CAHPV-10 e células PNT2. No entanto, em células PC-3, os níveis de proteína para claudina 7, α -catenina foram significativamente regulada negativamente (-1,5 dobra, p = 0,001) ou indetectável, respectivamente. Imunofluorescência mostrou localização β-catenina em células PC-3 para ser citoplasmático em oposição ao membraneous

Conclusão

Estes resultados sugerem aberrante Claudina 7, α -. E β-catenina expressão e /ou localização padrões podem ser marcadores putativos para distinguir câncer de próstata localizado de doença metastática agressiva quando usado em conjunto

Citation:. Morgan C, Jenkins SA, Kynaston HG, Doak SH (2013) o papel da Moléculas de Adesão como biomarcadores para a agressivo prostate Cancer fenótipo. PLoS ONE 8 (12): e81666. doi: 10.1371 /journal.pone.0081666

editor: Frédéric André, da Universidade Aix-Marseille, França |

Recebido: 28 de junho de 2013; Aceito: 17 de outubro de 2013; Publicação: 16 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Morgan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela próstata Acção (número de referência concessão G2009 /27) e Fundação médica do St David, faculdade de Medicina da Universidade de Swansea. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (CaP) é o câncer mais comum em homens no Reino Unido. Todos os anos, cerca de 35.000 casos de CaP são diagnosticados e é responsável por aproximadamente 12% de todas as mortes de homens por câncer no Reino Unido [1]. O diagnóstico precoce de Cap confinado ao órgão é essencial, pois a prostatectomia radical ou radioterapia oferece a única chance de cura completa e tratamento da doença avançada é paliativo e em efetivo (a longo prazo). Além disso, a CAP confinado ao órgão precoce nem sempre é uma ameaça à vida e pode seguir e curso indolente, que não requer tratamento. É geralmente aceite que os métodos disponíveis atualmente utilizados para o diagnóstico e estadiamento do CaP (níveis de antígeno específico da próstata, escore de Gleason e grau clínico e patológico) não têm a sensibilidade para distinguir entre pacientes com PAC indolente, confinado ao órgão, aqueles que exigem tratamento radical e aqueles em risco de recaída após o tratamento radical. É evidente que há uma necessidade de identificar marcadores moleculares de CaP progressão, invasão e metástase para prever o diagnóstico e orientar a terapia.

Para um câncer para metastizar, as células deve primeiro romper com o tumor primário. Em tecido epitelial, as células são ligadas uma à outra através de estruturas de membrana chamadas junções apertadas (TJ), adherens junções (AJ) e desmosomas [2]. Juntos, eles manter a arquitectura do epitélio. AJ proteínas compreendem as famílias de caderina e catenina. E-caderina é principalmente presente no epitélio e representa o membro prototípico da família caderina. O domínio citoplasmático da E-caderina liga-se a proteínas citosólicas denominadas cateninas (α, β e p120) [3]. β-catenina se liga directamente a E-caderina, enquanto α-catenina se liga indirectamente através da sua interacção com β-catenina [4]. Juntamente com desmosomes eles são os principais responsáveis ​​pela adesão entre células adjacentes [5] e que formam contactos célula-célula estáveis. O TJ separar as regiões apicais e basolaterais da membrana plasmática e regular a passagem de iões e macromoléculas, água através do epitélio [6]. TJs são compostas de proteínas ligadas a membranas (claudinas, ocludina, tricellulin) e as suas proteínas adaptadoras e andaimes (molécula de adesão juncional, ZO-1, ZO-2, 3-ZO cingulin, MUPP1) [7].

Até recentemente, TJs só foram percebidos como selos celulares [8]. Agora, no entanto, as perdas de proteínas TJ estão sendo reconhecidos por sua associação com uma variedade de cânceres. A desregulação de proteínas TJ está associada com a perda da polaridade celular epitelial e desdiferenciação que é um evento conhecido na carcinogénese fase inicial [7]. Em mama pouco diferenciado [9], [10], da tiróide [11], do endométrio [12] e gastrointestinal [13] cancros a expressão de proteínas de junções apertadas têm sido mostrados para ser reduzido, enquanto a perda de TJ funcional dos doentes com cancro da mama proteínas também tem sido associada com um prognóstico pobre [14], [15]. Desde que as proteínas TJ são definidos como o ponto em que as membranas das duas células se unem eles desempenham uma função vital, mantendo as células em conjunto e são uma barreira fundamental que as células cancerosas devem superar a fim de difundir [16].

Enquanto provas continua a crescer em relação a expressão de componentes TJ e AJ no câncer a maioria dos estudos são destinadas a investigar moléculas individuais. Os cancros são heterogéneos por natureza e, portanto, é impossível para o diagnóstico de cancro ou prever a progressão da doença usando um único biomarcador.

Nós utilizamos cinco linhas de células de próstata disponíveis comercialmente derivadas de epitélio normal da próstata, cancro da próstata não-invasivo e metastático cancro para analisar a expressão dos 7 componentes AJ e TJ bem conhecidos, identificado como expressas de forma aberrante em amostras de tecido de cancro da próstata [17], [18], [19], [20], [21], no primeiro passo de potencialmente elucidar um painel de biomarcadores que podem distinguir o câncer indolente da doença metastática agressiva quando usado coletivamente.

Materiais e Métodos

cultura celular

células da próstata epiteliais (PNT2) e células de câncer de próstata derivada de cancro metastático para os nódulos linfáticos (LNCaP) e osso (PC-3) foram obtidas a partir da Colecção Europeia de culturas de Células. células de cancro da próstata derivadas do cancro da próstata não-invasiva (CAHPV-10) e cancro metastático do cérebro (DU145) foram adquiridos da American Type Culture Collection. PNT2, LNCaP, DU145 e PC-3 foram rotineiramente cultivadas em RPMI 1640, 2 mM de L-glutamina Glutamina e 10% (v /v) de soro fetal de vitelo (Invitrogen, Paisley UK). CAHPV-10 as células foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos com 5 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante ml e 50 ug /ml de extracto de pituitária de bovino (Invitrogen, Paisley UK).

As células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram sub-cultivadas utilizando 0,25% de tripsina /EDTA (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido).

Os anticorpos

Os anticorpos primários para rato ZO-1 e coelho ocludina, Claudina-1 e Claudina -7 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Paisley, Reino Unido). Coelho, α-catenina, β-catenina, E-caderina e de coelho β-actina foram adquiridas à New England Biolabs (Hertfordshire, Reino Unido). Horseradish peroxidase anticorpos secundários conjugados /anti-coelho anti-ratinho, também foram adquiridos à New England Biolabs (Hertfordshire, Reino Unido).

Para imunofluorescência, anticorpos primários adicionais para α-catenina, β-catenina foram obtidos a partir de Abcam ( de Cambridge, Reino Unido). Anti-ratinho (Qdot655) e anti-coelho (Qdot525) os anticorpos secundários foram obtidos a partir de Invitrogen (Paisley UK).

Análise

A expressão de genes

O ARN celular total foi extraído utilizando o estojo de extracção de RNeasy ( Qiagen, Crawley, Reino Unido) e de ADN residual foi removido por tratamento com DNA-free ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) de acordo com as instruções dos fabricantes. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN de 1 ug, utilizando iniciadores aleatórios e o kit de transcrição reversa de síntese de ADNc de Alta Capacidade (Applied Biosystems, Warrington, UK). As reacções de PCR em tempo real foram realizadas no termociclador iCycler iQ térmica (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK), utilizando a metodologia de detecção de SYBR Green. Os conjuntos de iniciadores (Tabela 1) foram concebidos para serem exão-exão abrangendo a fim de minimizar a possibilidade de que qualquer ADN genómico contaminante iria ser amplificado. Os conjuntos de iniciadores utilizados foram também testados para garantir que todos eles demonstraram a eficiência igualmente amplificação. Todas as reacções foram realizadas em triplicado com 2 ul de cDNA, 12,5 ul iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) e 0,2 uM directo e inverso, iniciadores, num volume de reacção final de 25 ul. β-actina e HPRT foram utilizados como genes de referência. As condições de amplificação de PCR foram 95 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s. Dobre expressão foi normalizado contra as células epiteliais da próstata PNT2 normais.

Western blot

A proteína total foi extraído usando tampão RIPA (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido). Trinta microgramas de proteína foi executado em ambos os 7,5% ou 12% PAGE Tris-glicina (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK), dependendo do tamanho da proteína de interesse. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% em Tween /TBS para inibir a ligação não (todos Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) específico e incubadas durante a noite a 4 ° C, utilizando anticorpos primários para, ocludina (1:83), ZO- 1 (1:250), Claudina-1 (1:125), Claudina-7 (1:125) α-catenina (1:1000), β-catenina (1:1000) e e-caderina (1:500) . β-actina (1:1000) foi utilizado como um controlo para a carga de proteína. As membranas foram lavadas para remover o anticorpo primário e incubadas com peroxidase de rábano anti-ratinho /anticorpos secundário conjugado anti-coelho (1:1000) durante 1 hora à temperatura ambiente. As proteínas foram visualizadas utilizando o kit de Immun-Star WesternC detecção chemiluminescene (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) e expressão relativa foi quantificada por densitometria e o programa de software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK). As transferências de Western foram realizadas em duplicado.

Imunofluorescência

Após a análise do mRNA e proteína, Claudina 7 α-catenina e β-catenina pareciam ter níveis semelhantes de expressão para as células da próstata normais que se tornou alterados em células derivado de um tumor metastático agressivo. Portanto, imunofluorescência foi realizada apenas sobre estas moléculas para determinar se as alterações na expressão da proteína foram seguidos por Localização aberrante. As células foram semeadas a 1 x 10

5 células /ml em lâminas de microscópio estéreis contidas em placas estéreis de cultura de tecidos quadriperm (Invitrogen, Paisley UK). As células foram deixadas durante a noite para aderir às lâminas e crescidas até à confluência durante 5 dias. Uma vez que as células foram meios confluentes foi removido, as lâminas foram lavadas duas vezes com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) (Invitrogen, Paisley UK) e fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) durante 15 minutos à temperatura ambiente. PFA foi removido por lavagem das lâminas em PBS de glicina /100 mM (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) 5 minutos três vezes. As células foram permeablised em 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos e lavadas em PBS três vezes. Para matar os grupos reactivos seguintes PFA a fixação, as lâminas foram incubadas em boro-hidreto de sódio (Fisher Scientific, Leicestershire, Reino Unido) a uma concentração de 1 mg /ml durante 10 minutos. Isto foi realizado três vezes, seguido por uma lavagem com PBS 5 minutos antes de bloquear as lâminas em 10% de albumina de soro bovino (BSA) /PBS durante 30 minutos. A solução de bloqueio foi removida através da realização de 3 × 2 lavagens de hora em PBS. As lâminas foram incubadas com anti-Claudina 7 (1.100 em BSA a 1% /PBS), α-catenina e β-catenina (1:50 a 1% de BSA /PBS). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C. O anticorpo primário foi removida por 3 lavagens × 5 min, seguido por incubação com anticorpos secundários (1:100 em 6% BSA /PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários foram removidos por 3 × 5 min em PBS, antes de as lâminas foram lavadas em água (2 min), 70%, 85% e 95% de etanol (2 min cada). As lâminas foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência AxioCam (Carl Zeiss Ltd, Hertfordshire, Reino Unido).

Os controlos negativos (para excluir autofluorescência) foram realizados substituindo o anticorpo primário durante 1% de BSA /PBS.

a análise estatística

análise realizada utilizando o teste ANOVA paramétrica. A análise post-hoc de Dunnett foi realizado para comparar as células cancerosas com as células de controlo PNT2 epiteliais normais e a análise post hoc de Tukey foi realizada para comparações múltiplas de grupo. A

p

-valor 0,05 foi considerado significativo

NOTA:. Apenas diferenças na expressão gênica e níveis de proteína que satisfazem tanto o p-valor e uma biológica fold-change of 1,5 seria considerado uma mudança significativa.

Resultados

Gene Expression Analysis

Quantitative PCR em tempo real (Fig. 1) mostrou níveis de mRNA ocludina foram significativamente diferentes entre todos os grupos (

p Art 0,001). Uma redução significativa nos níveis de ARNm foi observada em ocludina CAHPV-10 (-19,08 dobra,

P

= 0,001), DU145 (-3,2 dobra,

P

= 0,003) e PC-3 ( -4,3 vezes,

p

= 0,003), as células de câncer de próstata em comparação com as células epiteliais da próstata normais (PNT2). Não houve diferença significativa na expressão de ARNm de ocludina entre as células de cancro independentemente da capacidade invasiva. No entanto, os níveis de mRNA foram significativamente até regulamentada (2,2 vezes,

p

= 0,001) nas células cancerosas LNCaP em comparação com as células epiteliais da próstata (PNT2).

Os níveis de expressão foram normalizados para o a linha de células de próstata normais PNT2 cujo nível de expressão foi definido como 1. * denota diferença significativa (P 0,05) em comparação com PNT2

com relação ao ZO-1, não houve diferença significativa em transcricional. níveis entre as células epiteliais da próstata normais e qualquer uma das células cancerosas da próstata.

Claudin 1 a expressão do gene foi significativamente baixo regulados em todas as células cancerosas em comparação com PNT2. Em células cancerosas da próstata CAHPV-10 e LNCaP, Claudina 1 foi regulada negativamente -10 vezes (

p

= 0,001) e -100 vezes (

p

= 0,001), respectivamente, . DU145 mostrou uma vezes -2.1 baixo regulação (

p

= 0,001) e PC-3 demonstrou uma dobra -3.8 (

p

= 0,001). Reduzido nível de expressão

claudin níveis de expressão do gene 7 foram semelhantes entre PNT2 e CAHPV-10 (valor da expressão 1,1). Em contraste, Claudina 7 transcrição foi significativamente até regulamentada em LNCaP, (4,63 vezes,

p

= 0,001), mas até regulamentada em DU145, (-5,3 vezes,

p = 0,004

) e PC-3, (-24,8 dobra,

P

= 0,01) quando comparado com PNT2. Houve também uma regulação para baixo significativa nos níveis de expressão quando claudina 7 níveis de ARNm foram comparados entre CAHPV-10 e (DU145, (

P

= 0,02) e PC-3 (

p = .. 0.001)

níveis de transcrição para catenin α- não diferiram significativamente entre PNT2, CAHPV-10, (-1,1 vezes) ou LNCaP, (- 1 vezes) A ​​regulamentação significativa para baixo foi observado por -2.2 dobra em DU145 e -33 vezes em células PC-3, (ambos p = 0,0001). Quando os níveis de mRNA para CAHPV-10 foram comparados com DU145 e PC-3, uma significativa diminuição da regulação da expressão foi detectada (ambos DU145 e PC-3

p

= . 0.001)

β-catenina expressão do gene foi significativamente regulada em CAHPV-10 células, (-3 vezes,

p

= 0,015) em comparação com PNT2 enquanto um aumento da regulação significativa foi observada em LNCaP, (3,8 vezes,

P

= 0,001), DU145, (2,2 vezes,

p = 0,001

) e PC-3, (2,1 vezes,

P

= 0,001). Houve também um aumento da regulação significativa nos níveis de expressão, quando os níveis de mRNA para CAHPV-10 foram comparados com DU145 (

p

= 0,006) e PC-3 (

p

= 0,001).

e-caderina níveis de expressão do gene foram significativamente menores em CAHPV-10 (-2,3 vezes,

p

= 0,004), DU145 (-5,6 vezes,

p

= 0,001) e PC-3 (-7.25 vezes,

p

= 0,001) em comparação com PNT2. Não houve diferença significativa nos níveis de expressão de gene da E-caderina entre as células de cancro da próstata não-invasivos e invasivos. Em contraste, as células LNCaP mais uma vez demonstrou um aumento da regulação significativa de E-caderina, em comparação com PNT2 (1,6 vezes,

p

= 0,037).

análise de expressão proteica

e densitometria de Western blot foram realizadas (Fig. 2) para determinar se os níveis de expressão de mRNA foram comparáveis ​​ao nível da proteína (Tabela 2). Os níveis de proteína para a ocludina foram regulados nas células de cancro da próstata CAHPV-10 (-2,8 vezes), DU145 (-1,6 vezes) e PC-3 (-9,3 vezes), mas sobre-regulada em LNCaP (2,4 vezes) em comparação com PNT2. No entanto, devido à elevada variação entre repetições (dados não mostrados), não houve diferença significativa entre qualquer das células da próstata.

β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Western blot foram realizadas em duplicata e as bandas são representativos dos resultados obtidos.

Os níveis de proteína para ZO-1 não mostrou nenhuma diferença significativa em qualquer das linhas celulares (CAHPV-10 1,1 vezes, LNCaP 3,6 vezes, DU145, 2,5 vezes e PC-3 -1.1 vezes).

em comparação com PNT2, os níveis de Claudina 1 foram reduzidos em todas as células cancerosas da próstata. CAHPV-10 foi regulada negativamente -2.1 vezes, DU145 -2,3 vezes e PC-3 -1.8 vezes. LNCaP foi a única linha de células para mostrar uma regulação significativa em comparação com PNT2 (-9,3 vezes,

p

= 0,04).

Claudin 7 níveis de proteína não mostraram diferença entre CAHPV-10 ( 1,2 vezes) e PNT2 mas os níveis foram significativamente para baixo regulamentada em LNCaP (-1,1 vezes), DU145 (-1,1 vezes) e PC-3 (-1,5 vezes). Todos tinham um

p

= valor da 0,01. No entanto, LNCaP e DU145 não atender a dobra-mudança biológica e, portanto, estas alterações não foram tidas em conta. Além disso, quando os níveis de proteína claudina 7 para CAHPV-10 foram comparados com PC-3, um sub-regulação significativa foi também documentada (

P

= 0,01)

Em relação à. Os níveis de proteína catenina a-, não houve diferença significativa entre CAHPV-10 e PNT2, enquanto que para LNCaP (4,4 vezes,

P

= 0,03), DU145 (-2 dobrar

p = 0,04

) níveis α-catenina foram significativamente regulada negativamente em vários graus, quando comparado com PNT2. Para, PC-3, uma regulação negativa substancial na α – catenina se observou níveis de proteína, de tal modo que uma banda de proteína foi indetectável e não poderia ser obtido um valor de densitometria. Além disso, CAHPV-10 níveis de proteína também foram significativamente diferentes para LNCaP (

p

= 0,03) e DU145 (

p

= 0,04).

Não houve diferença significativa nos níveis de proteína β-catenina entre CAHPV-10 (1,1), LNCaP (2 vezes), DU145 (1,4 vezes) ou PC-3 (1,5 vezes) e PNT2, portanto, mesmo que PC-3 exibiu a mudança dobra biológica, o resultado foi desconsiderada

Para os níveis de proteína e-caderina regulamento significativa para baixo foi evidente em CAHPV-10 (-1,7 vezes,

p

= 0,01). e DU145 (-1,5 vezes,

P

= 0,01). Mais uma vez, não pode ser obtida uma regulação para baixo substancial em PC-3, de tal modo que uma banda de proteína foi indetectável e um valor de densitometria. Em células LNCaP E-caderina foi-se regulados no nível de proteína (2,7 vezes

p

= 0,01).

Imunofluorescência

A fim de determinar se as proteínas AJ e TJ Encontravam-se presentes na sua localização sub-celular correcta (membrana celular), imunofluorescência foi utilizado.

de imunofluorescência (Fig. 3) para Claudina 7 apresentaram coloração forte na membrana celular para PNT2, CAHPV-10 e LNCaP. Para tanto DU145 e PC-3, marcação fluorescente foi reduzida. A coloração foi marcadamente reduzida em ambos os DU145 e PC-3 de células com coloração evidente tanto na membrana celular e no citoplasma. Coloração para catenina α- mostraram forte coloração específica na membrana celular para células PNT2, CAHPV-10 e LNCaP, enquanto que para DU145 e PC-3 intensidade do sinal foi significativamente reduzida e não específica. No que diz respeito a p-catenina coloração por fluorescência, PNT2, CAHPV-10 DU145 e exibiram coloração específica na membrana celular. intensidade β-catenina em células LNCaP e PC-3 de células era forte na membrana celular e em sítios de contacto célula-célula, mas em PC-3 coloração também foi evidente no citoplasma.

Para as células LNCaP, proteínas localização ocorre na membrana celular e a intensidade da coloração parece semelhante à PNT2 (com a excepção de β-catenina, que parece ter uma expressão mais elevada). Em células DU145, expressão para todas as proteínas é reduzida e a localização é difusa e citoplasmático. Para as células PC-3, Claudina 7 e catenin α-, fluorescência é muito reduzida e /ou citoplasmática na distribuição, enquanto β-catenina fluorescência é mais forte, mas também citoplasmática em sua localização.

Discussão

o primeiro passo na cascata metastática é a perda de adesão célula-célula, a fim de romper as células a partir do tumor primário. Assim, AJs ter sido um grande foco de estudos de câncer e agora componentes TJ também estão sendo reconhecidos pelo seu envolvimento. Alterações na chave componentes AJ e TJ, como α-catenin, E-caderina, β-catenina e Claudina 1 têm sido aclamados como potenciais biomarcadores para a progressão do câncer de próstata [18], [22], [23], [24] mas o maioria da investigação tem sido realizada em moléculas individuais. O cancro é por natureza heterogénea, portanto, há uma necessidade de um painel de biomarcadores, em oposição a moléculas individuais, para ajudar a determinar a progressão do cancro e, no caso de cancro da próstata, cancro distinguir dormente de doença metastática agressiva. Como resultado, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de vários componentes bem conhecidos TJ e AJ, coletivamente, como um primeiro passo importante na identificação de um painel de biomarcadores putativos que podem ajudar a distinguir o câncer de próstata latente da doença metastática agressiva. Sete biomarcadores putativos foram escolhidos devido à sua expressão aberrante, que têm sido documentadas na literatura científica e investigada em estudos de doentes centrado anteriores [17], [18], [20], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Os 7 proteínas AJ e TJ escolhidos foram a E-caderina, α- e β- catenina, ZO-1, ocludina, Claudina 1 e claudin 7 e sua expressão foi investigado usando um

in vitro

modelo de progressão do cancro da próstata . Fora do 7, destacamos 3 (Claudina 7, catenina α- e β-) cujo ARNm, os níveis de proteína e /ou localização são semelhantes em células derivadas de cancro tanto normal e de próstata confinado ao órgão, mas os seus níveis e /ou localização de todos alterar em células derivadas de tumores metastáticos agressivos. Claudina 7 ARNm e os níveis de proteína em células de cancro da próstata não-invasivos (CAHPV-10) foram semelhantes às encontradas nas células epiteliais da próstata. Além disso ambos os níveis de proteína e ARNm foram significativamente regulada para baixo na linha de células metastática mais agressivo PC-3 quando comparado com CAHPV-10. Estes resultados são suportados por Sheehan et ai, que mostraram uma diminuição na expressão Claudina 7 correlacionada com tumores prostáticos alto grau [19]. Portanto, Claudina 7 níveis de proteína pode ser um reflexo da agressividade destas células de cancro da próstata e só podem ser alterados na forma mais agressiva da doença. Além disso, uma análise por imunofluorescência revelou que Claudina 7 localização nas células PC-3 foi citoplasmático bem como ligada à membrana. localisation aberrante de Claudina 7 para o citoplasma, tem sido demonstrado que ocorrem em células de cancro da mama [28] e carcinoma de célula escamosa esofágica [2]. Esta re-distribuição de claudinas têm sido atribuídos a vários mecanismos incluindo a regulação de proteínas para baixo resultando em internalização citoplasmática [2]. Com base nestes resultados, pode ser colocada a hipótese de que Claudina 7 poderia ser um possível candidato para distinguir cancros indolentes das formas metastáticas mais agressivas, o que requer a validação em amostras de doentes.

Em combinação com Claudina 7, a- -catenina níveis em células de cancro da próstata não-invasivos foram semelhantes aos níveis em células epiteliais da próstata, mas como Claudina 7, foi significativamente diminuída nas células metastáticas mais agressivos. Uma relação significativa entre a expressão reduzida α-catenina e alta pontuação de Gleason tem sido relatada em tumores de próstata [24]. Da mesma forma, α-catenina foi relatado para estar presente em tumores da próstata com um baixo grau de Gleason [17]. Tem sido sugerido, por conseguinte, que a perda de α-catenina leva à perda de função de E-caderina que conduz a um prognóstico pobre [18], ao passo que, de repleção de α-catenina em células de cancro da próstata nulos α-catenina foi reportado para aumentar a formação de junção aderente e reduziu a actividade de transcrição de β-catenina, níveis de ciclina D1 e proliferação de células [26].

para níveis de proteína ARNm β-catenina e a intensidade da coloração por imunofluorescência de células CAHPV-10 foram semelhantes às da próstata normais células epiteliais e curiosamente, imunofluorescência revelou β-catenina em células PC-3 para ser tanto de membrana e citoplásmica. β-catenina se concentra em citoplasma, como resultado da junção adherens repartição complexo e, em seguida, transloca-se para o núcleo onde exerce ele efeito transcricional [29]. Esta localização para o citoplasma aberrante tem sido mostrado para contribuir para carciongenesis tiróide [30] e ligado a um mau prognóstico em pacientes de cancro da mama [31]. Os nossos resultados sugerem que pode ser pertinente para olhar para localização citoplasmática de β-catenina, em oposição a avaliar quantitativamente os níveis de ARNm que é ou de proteína, como um biomarcador putativo de doença agressiva.

Deve notar-se que o ARNm e os níveis de expressão de proteína na linha celular LNCaP raramente seguido a mesma tendência que DU145 e PC-3. Esta diferença em níveis de expressão poderiam ser explicados por o potencial de diferenciação e estado metastático da linha celular. LNCaP tem sido documentada como tendo limitado potencial metastático e permanece bem diferenciada quando introduzidos em modelos de rato [32]. Assim, pode ser postulado que a seguinte metástases para os nódulos linfáticos, nesta linha celular foi revertido para uma forma mais epitelial, como resultado da colonização [33] e o crescimento. Além disso, houve também algumas discrepâncias entre mRNA e os níveis de proteína para Claudina 7 e ocludina em LNCaP, e β-catenina em CAHPV -10 e DU145 e α-catenina em CAHPV-10 e LNCaP. Como o ARNm é traduzido em proteína, pode presumir-se que deve haver uma correlação entre os níveis de ARNm e de proteína. No entanto, estudos que investigaram a correlação entre os níveis de mRNA e expressão de proteínas relataram correlações mínimos ou limitados [34]. A quantidade de proteína detectado, provavelmente, pode ser afetada pela tradução e pós-transcricional modificações fornecendo um grau secundário do controle de expressão que poderiam ser responsáveis ​​por essas diferenças.

Conclusão

Devido à natureza heterogénea de câncer , a análise de moléculas individuais fornece informação limitada e é impossível para diagnosticar cancro ou prever a progressão da doença usando um único biomarcador. Os 7 biomarcadores aqui analisados, foram relatados para ser expressas de forma aberrante em amostras de tecido de câncer de próstata, mas, principalmente, numa base individual. No entanto, o nosso

in vitro

inquérito demonstrou, que fora destes 7 apenas 3 (Claudin 7, α-catenin e β-catenina) podem coletivamente ser usado para distinguir o câncer de próstata localizado a partir de células que representam a doença metastática agressiva. Acreditamos que esta

in vitro

identificação de alterações em vários genes-chave em combinação destaca a importância de utilizar vários marcadores moleculares e é um primeiro passo importante na identificação de um painel de biomarcadores putativos que podem ajudar a distinguir o câncer de próstata latente de doença metastática agressiva. Um estudo IHC grande paciente é agora necessária para validar esses resultados.